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WO2002020039A2 - Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen antikörpern zur behandlung von malignem aszites - Google Patents

Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen antikörpern zur behandlung von malignem aszites Download PDF

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WO2002020039A2
WO2002020039A2 PCT/EP2001/010184 EP0110184W WO0220039A2 WO 2002020039 A2 WO2002020039 A2 WO 2002020039A2 EP 0110184 W EP0110184 W EP 0110184W WO 0220039 A2 WO0220039 A2 WO 0220039A2
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tumor
cells
use according
associated antigen
antibody
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Horst Lindhofer
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Priority to DK01982241T priority patent/DK1315520T3/da
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Priority to AT01982241T priority patent/ATE294591T1/de
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Definitions

  • the invention relates to the use of a trifunctional bispecific antibody and / or trispecific containing pharmaceutical preparation for destroying the tumor cells which are associated with malignant ascites and / or a pleural effusion in order to treat malignant ascites and a pleural effusion.
  • Malignant ascites can be caused by a number of primary tumors such as Breast cancer, ovarian cancer or gastrointestinal cancer can be caused. Although ascites is detected in the first manifestation of a tumor in a high percentage of patients, it is a sign of an advanced disease.
  • the situation is similar in the case of pleural effusion induced by tumor cells.
  • the pleural effusion is a fluid accumulation in the pectoral cavity and can form again after the puncture. Since one of the causes of the pleural effusion is the presence of tumor cells in this compartment, the destruction of the tumor cells is an essential prerequisite for preventing the new formation of the pleural effusion.
  • This means that the problem and the associated solution approaches are very similar for malignant ascites and pleural effusion based on tumor cells. It is an object of the invention to provide a new agent for the treatment of malignant ascites and for the treatment of a pleural effusion which overcomes the disadvantages of the prior art, in particular offers a noticeable relief to the patient.
  • a pharmaceutical preparation which contains a trifunctional bispecific and / or trispecific antibody with the following properties: a) binds to a T cell; b) binds to at least one antigen on a tumor cell associated with malignant ascites and / or pleural effusion; c) binds to Fc receptor positive cells by its Fc part (in the case of bispecific antibodies) or by a third specificity (in the case of trispecific antibodies)
  • Figure 1 Elimination of EpCAM + tumor cells and proliferation of immune cells in ascites under BSA therapy
  • Figure 2 FACS analysis of tumor cells for surface antigens
  • Figure 3 Destruction of residual tumor cells after CD3 x EpCAM treatment using RT-PCR
  • Figure 4 Evidence of EpCAM positive tumor cells from the ascites fluid in flow cytometry in the course of antibody therapy
  • Figure 5 Decrease in ascites fluid formation during therapy with the antibodies REMOVAB (anti EpCAM x anti CD3) and REXOMAB (anti Her2 / new x anti CD3).
  • Trifunctional bispecific and trispecific antibodies and various areas of application of these antibodies belong to the prior art.
  • This prior art describes the use of bispecific and trispecific antibodies with the three features a, b and c for immunization against tumors;
  • a direct treatment option for the tumors by destroying the tumor cells, which goes beyond induction of immunity, is not described in these documents.
  • the pharmaceutical preparation is designed in such a way that it achieves at least a primary immunization by destroying the tumor cells.
  • the pharmaceutical preparation which contains the trifunctional antibodies described in more detail below, is administered in several doses.
  • the first dose is chosen so that a foreign protein reaction of the patient against the administered antibody is tested.
  • the second dose is preferably chosen so that the patient's immune cells are activated and proliferate.
  • a third dose and further doses are chosen so that they lead in particular to the destruction of the tumor cells.
  • the first dose is administered in an amount of 1 to 20 ⁇ g, preferably 5 to 10 ⁇ g, of the antibody in order to test allergic reactions.
  • the second dose is administered in an amount of 20 to 80 ⁇ g, preferably up to 100 ⁇ g, further preferably 30 to 60 ⁇ g of antibody.
  • the third dose and each further dose are administered in an amount of more than 80 ⁇ g, preferably 100 to 500 ⁇ g, further preferably 100 to 300 ⁇ g of the antibody. It goes without saying for a specialist that these quantities are indicative and can vary from patient to patient and from antibody to antibody. However, it is part of the medical specialist's knowledge to select the amount of antibody to be used individually.
  • the number of applications is preferably 3 to 8, preferably 3 to 6, times a dose.
  • the administration takes place at certain time intervals, in particular 48 to 72 hours being selected.
  • a period of 2-3 days plus minus several hours is preferably selected between the individual applications.
  • the applications are preferably continued over a period of 12-14 days.
  • the period of time is chosen so that further antibody doses are no longer administered when the first immune reactions against the antibody protein occur.
  • the HAMA human anti mouse antibody
  • apheresis is a collection of blood cells which in particular contains no erythrocytes. In particular, it contains T cells, macrophages, monocytes, NK cells, dendritic cells, granulocytes and B cells.
  • the apheresis product must be obtained in particular before the first chemotherapy in order to ensure the integrity of the immune cells, which are practically always affected by the chemotherapeutic agents.
  • the patient is not only treated with the trifunctional bispecific and / or trispecific antibodies, but in addition receives inactivated autologous and / or allogeneic tumor cells and autologous immune cells as part of the secondary immunization.
  • the autologous immune cells are preferably T-lymphocytes and accessory cells, for example monocytes, macrophages and dendritic cells. These are, for example, in PBMC (peripheral blood mononuclear cells), which are obtained, for example, from heparinized blood via Ficoll density gradient centrifugation. However, it is also possible to use sub-fractions, for example only the T lymphocytes and dendritic cells or macrophages etc.
  • the autologous immune cells are the apheresis cells, which together with the antibody and the inactivated autologous or allogeneic tumor cells can be used mixed.
  • the amount of tumor cells administered is selected in a suitable manner.
  • an insufficient number of tumor cells does not bring about the desired immunization success.
  • An excessive amount of tumor material in turn, can have an adverse effect, since tolerance phenomena can occur, for example. If these results are transferred to the situation in the patient, this means that it is advantageous for the immunization success to administer a defined amount of tumor material in the correct spatial context with a likewise defined amount of antibodies.
  • An immunization success occurs even if one of these parameters has not been optimized; Particularly good results are achieved, however, if both the amounts of the antibody and the amount of tumor material and the spatial context have been coordinated and optimized.
  • the tumor cells are preferably administered in an amount of 10 5 to 10 8 cells per application, a cell count of approximately 10 7 having been found to be preferred.
  • the tumor cells were treated before the reapplication in such a way that their survival after the reapplication is prevented, and they can optionally also be subjected to a heat pretreatment.
  • the tumor cells are obtained from the tumor material of the patient to be treated.
  • the tumor material is processed, for example by enzymatic treatment, preferably by collagenase treatment, to give a single cell suspension. It is important that the tumor cells are as undamaged as possible. Lysates of the tumor cells have proven to be unsuitable.
  • the tumor cells are treated in such a way that survival of the tumor cells in the patient is excluded.
  • the tumor cells are therefore treated in a manner known per se, for example by radiation or by treatment with chemical agents.
  • the treatment in particular, should also leave the external structure of the tumor cell unchanged, so that the recognition pattern for the antibodies is retained.
  • ⁇ -irradiation is preferably used for the irradiation, which is preferably carried out with a dose of 20 to 200 Gy.
  • Mitomycin C has proven particularly useful for chemical treatment.
  • a further improvement in the immunogenicity of the tumor cells can be achieved by subjecting them to a heat pretreatment before infusion.
  • the temperature is in a range from approximately 40 to 45 ° C., a range from 41 to 42 ° C. being preferred.
  • the optimum can be determined by tests. Preferred results are achieved in particular at a temperature of approximately 41.8 ° C.
  • the period for the heat pretreatment is generally 1 to 6 hours, preferably about 3 hours. Both the time period and the temperature that are optimally used also depend on the type of tumor to be treated. The respective optima can be determined by a person skilled in the art on the basis of experiments.
  • the administration of the individual doses is generally carried out in such a way that to achieve primary immunization, i.e. H. to destroy the tumor cells, an intraperitoneal form of application is selected in which the antibodies are infused into the patient.
  • the doses for secondary brain ammunition are generally administered by topical application, for example intradermally, subcutaneously or intramuscularly. But it can also be done intraperitoneally or intravenously.
  • the inactivated autologous and / or allogeneic tumor cells and the autologous immune cells are preferably used: a) 1-200 x 10 6 inactivated tumor cells, preferably 10-100 x 10 6 inactivated tumor cells b) 10-500 x 10 6 immune cells, preferably 50-200 x 10 6 immune cells c ) 1-10 ⁇ g trifunctional bispecific antibodies or trispecific antibodies, preferably 2-5 ⁇ g antibodies.
  • the pharmaceutical preparation provided according to the invention is, for example, in an isotonic saline solution.
  • Other components can be, for example, stabilizing agents such as Tween 80 or buffer solutions.
  • Intact trifunctional bispecific and / or trispecific antibodies are preferably used for the treatment.
  • the treatment not only achieves the surprising direct destruction of the tumor cells described above, but also induces immunity to the tumor to be treated.
  • “Intact antibodies” are to be understood as those which have a functional Fc part. These are preferably heterologous antibodies, i.e. they are composed of heavy immunoglobulin chains of different subclasses (combinations, also fragments) and / or origin (species).
  • the antibodies used in preferred embodiments of the invention also have the further features d and e: d) activates the Fc receptor positive cell by binding to the Fc receptor positive cell, thereby Expression of cytokines and / or of costimulatory antigens is initiated or increased; e) the costimulatory antigens and / or cytokines transmit to the T cell at least a second activation signal which is required for a physiological activation of the T cell, this activation being found in the upregulation of activation markers, the destruction of the tumor cell and / or in a proliferation of the T cell.
  • the invention is described below in particular using the example of bispecific antibodies. The results can also be achieved with trispecific antibodies.
  • the antibodies which can be used according to the invention are capable of activating the Fc receptor positive cell, which initiates or increases the expression of cytokines and or costimulatory antigens.
  • the binding to the Fc receptor positive cells is preferably carried out, for example, via the Fc receptor from Fc receptor positive cells or also via other antigens on Fc receptor positive cells (antigen presenting cells), such as e.g. the mannose receptor.
  • tumor immunity preferably long-term tumor immunity
  • MRD tumor residual disease situation
  • heterologous bispecific and / or trispecific antibodies which can be used according to the invention are known per se. For example, they are described in Lindhofer et al., Blood, 88: 4651, 1996 or Lindhofer et al., J. nmunology, 155: 219, 1995.
  • MHC 1 is upregulated on the tumor cell and the intracellular processing machinery (proteasome complex) is activated due to the release of cytokines (such as LNF- ⁇ and TNF- ⁇ ) in the immediate vicinity of the tumor cell.
  • cytokines such as LNF- ⁇ and TNF- ⁇
  • the cytokines are released due to bispecific antibody-mediated activation of T cells and accessory cells. This means that the intact bsAk not only destroys or phagocytizes tumor cells, but also indirectly increases their tumor immunogenicity.
  • the activation of the Fc receptor positive cell by the bsAk depends on the subclass or the subclass combination of the bsAk.
  • bsAk of the mouse-IgG2a / rat-IgG2b subclass combination are able to bind positive cells to the Fc receptor and to activate them at the same time, which leads to upregulation or new formation (expression) of costimulatory antigens, such as CD40, CD80 or CD86, on the cell surface of these cells (Zeidler et al., J. Immunol., 163: 1246, 1999).
  • costimulatory antigens such as CD40, CD80 or CD86
  • bsAk of the mouse-IgGl / RatteIgG2b subclass combination are able to bind positive cells to Fc receptor (Haagen et al., J. Immunology, 1995, 154: 1852-1860), but apparently they cannot activate them to a comparable extent (Gast et al., Cancer Immunol. Immuntherap., 1995, 40: 390).
  • bsAk While the intact bsAk binds the T cell with a binding arm (e.g. to CD3 or CD2) and simultaneously activates it, costimulatory signals can be transmitted from the Fc receptor positive cell bound to the Fc part of the bsAk to the T cell. That Only the combination of activation of the T cell via a binding arm of the bsAk and the simultaneous transmission of costimulatory signals from the Fc receptor positive cell to the T cell leads to an efficient T cell activation. Tumor-specific T cells that have been insufficiently activated on the tumor cell and are anergic can also be reactivated after the treatment according to the invention with intact bispecific antibodies or trispecific antibodies.
  • a binding arm e.g. to CD3 or CD2
  • Tumor-specific CD4 cells Another important aspect in inducing tumor immunity is the possible phagocytosis, processing and presentation of tumor components by the accessory cells brought up and activated by the bsAk (monocytes / macrophages, or dendritic cells). This classic mechanism for the presentation of antigens can be used to generate both tumor-specific CD4 and CD8 positive cells. Tumor-specific CD4 cells also play an important role in inducing a humoral immune response in connection with T-B cell cooperation.
  • Bispecific and trispecific antibodies can bind to the T cell receptor complex of the T cell with one binding arm and to tumor-associated antigens on the tumor cell with the second binding arm. They activate T cells by releasing them of cytokines or apoptosis-mediating mechanisms that destroy tumor cells.
  • T-cells recognize tumor-specific antigens via their receptor as part of the activation with bispecific antibodies, thereby inducing permanent immunization.
  • the intact Fc part of the bispecific or Uspecific antibody which mediates the binding to accessory cells such as monocytes / macrophages and dendritic cells and which causes them to become cytotoxic and / or at the same time important costimulatory signals to the T cell pass. In this way, a T cell response can obviously also be induced against previously unknown, tumor-specific peptides.
  • TTLs cytotoxic T cells
  • the antibodies used according to the invention are preferably capable of reactivating tumor-specific T cells which are in anergy. Furthermore, they are able to induce tumor-reactive complement-binding antibodies and thus to induce a humoral immune response.
  • the binding is preferably via CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L and / or CD44 to the T cell.
  • the Fc receptor positive cells have at least one Fc ⁇ receptor type I or ⁇ i.
  • Antibodies which can be used according to the invention are capable of binding to monocytes, macrophages, dendritic cells, "natural killer” cells (NK cells) and / or activated neutrophils as Fc ⁇ receptor I and / or in positive cells (Zeidler, 1999, Zeidler 2000 supra).
  • the antibodies which can be used according to the invention have the effect that the expression of CD40, CD80, CD86, ICAM-1 and / or LFA-3 as costimulatory antigens and / or the secretion of cytokines by the Fc receptor positive cell is initiated or increased.
  • the cytokines are preferably IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, INF- ⁇ and / or TNF- ⁇ .
  • bispecific antibodies which can be used according to the invention are, for example:
  • the trispecific antibodies which can be used according to the invention are preferred:
  • the trispecific antibodies which can be used according to the invention have at least one T cell binding arm, one tumor cell binding arm and one binding arm binding to Fc receptor.
  • This latter binding arm can be an anti-Fc receptor binding arm or a mannose receptor binding arm.
  • the bispecific antibody is preferably a heterologous intact rat / mouse bispecific antibody.
  • T cells are activated and redi-fied against the tumor cells.
  • Preferred heterologous intact bispecific antibodies are selected from one or more of the following isotype combinations:
  • Rat-IgG2b / human-IgG2 Rat-IgG2b / human-IgG2,
  • the antibodies which can be used according to the invention are preferably monoclonal, chimeric, recombinant, synthetic, semisynthetic or chemically modified intact antibodies with, for example, Fv, Fab, scFv or F (ab) 2 fragments.
  • Antibodies or derivatives or fragments from humans are preferably used or those which are modified in such a way that they are suitable for use in humans (so-called "humanized antibodies”) (see, for example, Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 ( 1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).
  • the person skilled in the art is familiar with the production of the various antibody types and fragments mentioned above.
  • the production of monoclonal antibodies, which originate preferably in mammals, e.g. Human, rat, mouse, rabbit or goat can be done using conventional methods such as those described in e.g. in Köhler and Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) or in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) or DE 195 31 346 are described.
  • bispecific antibodies The production of antibodies with two different specificities, the so-called bispecific antibodies, is possible on the one hand by using recombinant DNA technology, but also by the so-called hybrid-hybridoma fusion technique (see, for example, Milstein et al., Nature 305 (1983), 537 ). Hybridoma cell lines that produce antibodies with one of the desired specificities are fused and cell clones (quadroms) are identified and isolated that produce antibodies with both specificities.
  • bispecific and trispecific Antiköiper belongs to the state of the art, and full reference is made here to the literature describing such production techniques.
  • the production of antibodies with three specificities, so-called trispecific antibodies, by means of which the problem on which the invention is based can also be solved, can be carried out, for example, in such a way that a third antigen binding site with a further specificity, e.g., to one of the heavy Ig chains of a bispecific antibody. in the form of a "single chain variable fragment" (scFv).
  • the scFv can, for example, use a
  • trispecific F (ab) 2 constructs can be produced by replacing the CH2-CH3 regions of the heavy chain of a specificity of a bispecific antibody with an scFv with a third specificity, while the CH2-CH3 regions of the heavy chain of the other specificity, for example by incorporating a stop codon (at the end of the "hinge” region) into the coding gene, for example by means of homologous recombination.
  • bispecific antibodies are used, for example.
  • Intact bispecific antibodies are composed of two antibody half-molecules (one H- and one L-immunoglobulin chain), each representing a specificity, and, like normal antibodies, also have an Fc part with the known effector functions. They are preferably manufactured using Quadrom technology. This manufacturing process is described by way of example in DE-A-44 19 399. Reference is made in full to this document, also with regard to a definition of the bispecific antibodies, for complete disclosure. Of course, too other manufacturing processes can be used as long as they lead to the intact bispecific antibodies of the above definition which are necessary according to the invention.
  • bispecific antibodies can be produced in sufficient quantities in a newly developed manufacturing process (Lindhofer et al., J. Immunology 1995, 155: 219).
  • the combination of 2 bispecific antibodies against 2 different tumor-associated antigens (e.g. c-erb-B2, and EpCAM) on the breast cancer cells minimizes the risk that tumor cells that only express one antigen remain undetected.
  • bsF (ab ') 2 fragments are:
  • Fc receptor can bind positive cells to intact bsAk and, on the one hand, directly contribute to tumor destruction via ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) and, on the other hand, as explained in more detail above, to T cell activation.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • anergized tumor-specific T cells are also introduced to the tumor cell, which according to the invention can be reactivated directly on the tumor. This cannot be achieved by a bsF (ab ') 2 fragment with the specificities of anti-CD64X anti-tumor associated antigen.
  • Binding the bsAk to Fc ⁇ -RI has two major advantages with regard to optimal anti-tumor activity:
  • Fc ⁇ -RI positive cells have the ability to eliminate tumor cells by means of ADCC and can therefore contribute synergistically to the anti-tumor effect of the cytotoxic T cells brought to the tumor cell by the bsAk.
  • Fc ⁇ -RI positive cells such as monocytes / macrophages / dendrites
  • Fc ⁇ -RI positive cells are able to deliver important costimulatory signals to the T cell, similar to the antigen presentation, and thus prevent anergization of the T cell
  • the costimuli necessary for a correct activation of the T cell would be provided by the accessory cell (eg monocyte) in this constellation.
  • the antibody according to the invention should also activate and generate tumor-specific T cells which continue to patrol the patient after the bsAk has been broken down.
  • intact bsAk similar to gene therapy approaches (eg by incorporating costimulatory antigens such as B-7 into the tumor cell), can break through the tumor tolerance in the patient.
  • the immunotherapy of tumors using trifunctional bispecific antibodies can also be used therapeutically in the treatment of ascites.
  • the peritoneum was punctured, ascitic fluid (700ml) was removed and the cells contained therein were analyzed. As shown in Fig.1, the tumor cells could already be identified visually using a microscope based on their morphology. In addition, an anti-EpCAM peroxidase staining was carried out.
  • the counting of the cells in the ascites before the treatment showed a ratio of approximately 50:50 of tumor cells and immune cells.
  • the flow cytometric analysis showed a strong positivity of the tumor cells for the surface antigen EpCAM (epithelial cell adhesion molecule, Baizar et al., Mol. Cell. Biol., 18: 4833, 1998) and weaker expression of the tumor-associated surface antigen Her2 / new (Fig. 2).
  • EpCAM epidermal cell adhesion molecule
  • a first change was found 1 day after the 40 ⁇ g infusion. Peritoneal lavage was carried out at this time and the cells contained therein were analyzed, the ratio of immune cells to tumor cells improving to a value of 3: 1.
  • the peritoneum was also punctured, the ascitic fluid (3 liters) was collected and the cells contained therein were analyzed in flow cytometry. Detection antibodies against the tumor-associated antigen EpCAM and CD14 were used to distinguish non-specific binding to Fc receptor positive cells (the detection antibody) from binding to tumor cells. As shown in Fig. 4, at day 0 before the therapy, over 70% of the cells detectable in the ascites fluid were EpCAM-positive tumor cells, which decreased to 0.7% during the therapy.
  • the patient On day 0, after draining the ascites fluid, the patient received 10 ⁇ g of the anti-EpCAM X anti-CD3 antibody Removab (isotype combination: mouse IgG2a x RatteIgG2b), and on the following days 2 and 5 40 ⁇ g and 100 ⁇ g Removab intraperitoneally over a period of administered about 6 hours. On day 8 the patient was given a combination of the antibodies Rexomab (anti-Her 2 / new X anti-CD3; 100 ⁇ g) and Removab (50 ⁇ g) intraperitoneally after the tumor-associated antigen Her2 / neu could also be detected on the tumor cells in flow cytometry (not shown).
  • Removab isotype combination: mouse IgG2a x RatteIgG2b
  • Day 0 10 ⁇ g (starting dose for testing a hypersensitivity reaction to the foreign protein)
  • Day 2 40 ⁇ g (activation and proliferation of the immune cells)
  • Day 4 200 ⁇ g (main dose to destroy the tumor cells)
  • the immunotherapeutic treatment of ascites intraperitoneally using trifunctional bsAk can also serve as a primary immunization to induce long-lasting anti-tumor immunity.
  • the abdominal cavity contains a number of immunological organs such as Spleen, Peyer's plaques and a variety of lymph nodes.
  • the trifunctional bsAk are capable of interacting with tumor cells, T cells, and accessory cells (Zeidler et al., J. Immolol. 163: 1246, 1999, Zeidler et al., British J. Cancer 83: 261, 2000 ) To deliver tumor material to the antigen-presenting system and to initiate an immigration of activated dendritic cells into the immunological organs.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt die Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung, die einen trifunktionellen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper mit den nachfolgenden Eigenschaften enthält: a) bindet an eine T-Zelle; b) bindet an zumindest ein Antigen auf einer Tumorzelle, die mit malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß in Zusammenhang steht; c) bindet durch seinen Fc-Teil (bei bispezifischen Antikörpern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifischen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellen zur Zerstörung der Tumorzellen bei der Behandlung von malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß.

Description

Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur
Behandlung von malignem Aszites
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer trifunktionelle bispezifische Antikörper und/oder trispezifische enthaltenden pharmazeutischen Zubereitung zur Zerstörung der Tumorzellen, die mit malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß in Zusammenhang stehen, um malignen Aszites und einen Pleuraerguß zu behandeln.
Maligner Aszites kann von einer Reihe von Primärtumoren wie z.B. Brustkrebs, Ovarialkarzinom oder den gastrointestinalen Karzinomen hervorgerufen werden. Obwohl Aszites bei einem hohen Prozentsatz der Patienten bereits bei der Erstmanifestation einer Tumorerkrankung nachgewiesen wird, ist er ein Anzeichen für eine fortgeschrittene Erkrankung.
Die gegenwärtigen Therapiemöglichkeiten für Aszites sind u. A. Punktion, örtliche Chemotherapie oder diuretische Behandlung. Alle diese Optionen haben gravierende Nachteile; so führt die Punktion nur zu einer kurzfristigen Erleichterung und es muß im Durchschnitt nach 9,5 Tagen erneut punktiert werden (Mackey et al., J. Pain Symptom Manage., 19: 193, 2000). Die Chemotherapie dagegen kann nur bei den Patienten ansprechen, die nicht bereits Chemotherapie-resistente Tumorzellen entwickelt haben, was leider oft der Fall ist. Insofern besteht für Aszites bei Tumorerkrankungen ein enormer Bedarf für die Verbesserung der klinischen Behandlungsmöglichkeiten.
Ähnlich ist die Situation beim durch Tumorzellen induzierten Pleuraerguß. Der Pleuraerguß ist eine Flüssigkeitsansammlung im Brustfellraum und kann sich nach Punktion erneut bilden. Da eine der Ursachen für den Pleuraerguß das Vorhandensein von Tumorzellen in diesem Kompartiment ist, ist die Zerstörung der Tumorzellen eine wesentliche Voraussetzung für die Unterbindung der Neubildung des Pleuraergusses. D.h. die Problematik und die damit verbundenen Lösungsansätze sind beim malignen Aszites und dem auf Tumorzellen basierendem Pleuraerguß sehr ähnlich. Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein neues Mittel zur Behandlung von malignem Aszites und zur Behandlung eines Pleuraergusses bereitzustellen, welches die Nachteile des Standes der Technik überwindet, insbesondere eine spürbare Erleichterung des Patienten bietet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine pharmazeutische Zubereitung gelöst, die einen trifunktionellen bispezifϊschen und/oder trispezifischen Antikörper mit den nachfolgenden Eigenschaften enthält: a) bindet an eine T-Zelle; b) bindet an zumindest ein Antigen auf einer Tumorzelle, die mit malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß in Zusammenhang steht; c) bindet durch seinen Fc-Teil (bei bispezifischen Antikörpern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifischen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellen
zur Zerstörung der Tumorzellen bei der Behandlung von malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind den beiliegenden Patentansprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung zu entnehmen. Es sei darauf hingewiesen, das die Erfindung nicht auf die nachfolgend genannten bevorzugten Ausgestaltungen und die Beispiele beschränkt ist. Vielmehr kann der Fachmann im Rahmen seines Fachwissens die Erfindung im Umfang der beiliegenden Anspräche in Verbindung mit der Beschreibung abwandeln, ohne von der Erfindung abzuweichen.
Die beiliegenden Abbildungen dienen zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung. Die Abbildungen zeigen:
Abbildung 1 : Elimination von EpCAM+ Tumorzellen und Proliferation von Immunzellen im Aszites unter bsAk-Therapie; Abbildung 2: FACS-Analyse von Tumorzellen auf Oberflächenantigene; Abbildung 3: Zerstörang von residuellen Tumorzellen nach CD3 x EpCAM-Behandlung mittels RT-PCR; Abbildung 4: Nachweis von EpCAM positiven Tumorzellen aus der Aszitesflüssigkeit in der Durchflußzytometrie im Verlauf der Antikörpertherapie; Abbildung 5: Abnahme der Aszites-Flüssigkeitsbildung unter der Therapie mit den Antikörpern REMOVAB (anti EpCAM x anti CD3) und REXOMAB (anti Her2/neu x anti CD3).
Trifunktionelle bispezifische und trispezifische Antikörper und verschiedene Einsatzbereiche dieser Antikörper gehören zum Stand der Technik. Beispielsweise sei hier hingewiesen auf die DE 198 44 157.6 sowie die DE 199 25 586. Dieser Stand der Technik beschreibt zwar die Verwendung bispezifischer und trispezifischer Antikörper mit den drei Merkmalen a, b und c zur Immunisierung gegen Tumoren; eine direkte Behandlungsmöglichkeit der Tumoren durch Zerstörang der Tumorzellen, die über eine Induktion einer Immunität hinausreicht, wird jedoch in diesen Dokumenten nicht beschrieben. Insbesondere wird durch diese Druckschriften nicht ausgeführt, das ein höchst spezieller Teilbereich der ungeheuer breiten Palette an Tumorerkrankungen, nämlich der malignen Aszites, aber auch ein Pleuraerguß, durch trifunktionelle bispezifische und trispezifische Antikörper mit den vorstehend aufgeführten Merkmalen in höchst effizienter und nicht vorhersehbarer Weise behandelbar ist. Ein Behandlungs erfolg konnte bereits bei zwei Patienten in der Klinik, die an einer finalen Tumorerkrankung litten, erreicht werden (vgl. Beispiel 1 und 2).
Die pharmazeutische Zubereitung ist so ausgelegt, daß sie zumindest eine Primärimmunisierung durch Zerstörung der Tumorzellen erreicht. Hierzu wird die pharmazeutische Zubereitung, welche die nachfolgend näher beschriebenen trifunktionellen Antikörper enthält, in mehreren Dosen verabreicht. Die erste Dosis wird so gewählt, daß eine Fremdproteinreaktion des Patienten gegen den verabreichten Antikörper getestet wird. Die zweite Dosis wird bevorzugt so gewählt, daß die Immunzellen des Patienten aktiviert werden und proliferieren. Eine dritte Dosis und weitere Dosen werden so gewählt, daß sie insbesondere zur Zerstörung der Tumorzellen führen.
Die Verabreichung der ersten Dosis erfolgt in einer Menge von 1 bis 20 μg, bevorzugt 5 bis 10 μg des Antikörpers, um allergische Reaktionen zu testen. Die Verabreichung der zweiten Dosis erfolgt in einer Menge von 20 bis 80 μg, bevorzugt bis 100 μg, weiterhin bevorzugt 30 bis 60 μg an Antikörper. Die Verabreichung der dritten Dosis und jeder weiteren Dosis erfolgt in einer Menge von über 80 μg, bevorzugt 100 bis 500 μg, weiterhin bevorzugt 100 bis 300 μg des Antikörpers. Es ist für einen Fachmann selbstverständlich, daß diese Mengenangaben Richtwerte darstellen, die von Patient zu Patient und von Antikörper zu Antikörper durchaus unterschiedlich sein können. Es gehört jedoch zum Fachwissen eines Mediziners, die individuell einzusetzende Antikörpermenge entsprechend auszuwählen.
Die Zahl der Applikationen liegt bevorzugt bei einer 3 bis 8, bevorzugt 3 bis 6-maligen Verabreichung einer Dosis. Die Verabreichung erfolgt in gewissen zeitlichen Abständen, wobei insbesondere 48 bis 72 Stunden gewählt werden. Bevorzugt wird zwischen den einzelnen Applikationen ein Zeitraum von 2 - 3 Tagen plus minus mehrere Stunden gewählt. Die Applikationen werden bevorzugt über einen Zeitraum von 12 - 14 Tagen fortgesetzt. Der Zeitraum wird so gewählt, daß bei Auftreten erster Immunreaktionen gegen das Antikörperprotein weitere Antikörperdosen nicht mehr verabreicht werden. Bei Verwendung eines Mausantikörpers wird beispielsweise die HAMA (human anti mouse antibody)-Reaktion bestimmt, die im Allgemeinen nach 16 bis 21 Tagen einsetzt, bei einigen Patienten früher, bei anderen später oder überhaupt nicht.
Maligner Aszites ist, wie oben ausgeführt, besonders häufig bei einer Reihe von Primärtumoren, wie zum Beispiel Brastkrebs, Ovarialkarzinomen und gastromtestmalen Karzinomen. Derartige Tumorerkrankungen werden zunächst durch chirurgische Entfernung des Tumorgewebes und anschließende Chemotherapie behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Immunzellen des Patienten durch Apherese gewonnen. Ein derartiges Aphereseprodukt ist eine Sammlung von Blutzellen, die insbesondere keine Erythrozyten enthält. Enthalten sind insbesondere T-Zellen, Makrophagen, Monozyten, NK-Zellen, dendritische Zellen, Granulozyten und B-Zellen. Die Gewinnung des Apherese-Produkts muß insbesondere vor der ersten Chemotherapie erfolgen, um eine Unversehrtheit der Immunzellen zu gewährleisten, die praktisch immer durch die Chemotherapeutika in Mitleidenschaft gezogen werden.
In einer Ausgestaltung der Erfindung wird der Patient nicht nur mit den trifunktionellen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörpern behandelt, sondern er erhält im Rahmen der Sekundärimmunisierung zusätzlich inaktivierte autologe und/oder allogene Tumorzellen und autologe Immunzellen. Bei den autologen Immunzellen handelt es sich bevorzugt um T-Lymphozyten und akzessorische Zellen, beispielsweise Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen. Diese sind beispielsweise in PBMC (peripheral blood mononuclear cells) enthalten, die beispielsweise aus heparinisiertem Blut über Ficoll-Dichtegradientzentrifugation gewonnen werden. Es ist aber auch möglich, Subfraktionen einzusetzen, beispielsweise lediglich die T-Lymphozyten und dendritische Zellen bzw. Makrophagen usw. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den autologen Immunzellen um die Apheresezellen, die zusammen mit dem Antikörper und den inaktivierten autologen oder allogenen Tumorzellen vermischt eingesetzt werden.
Zur erfolgreichen Immunisierang ist es weiterhin vorteilhaft, daß die Menge der verabreichten Tumorzellen in geeigneter Weise ausgewählt wird. So konnte in den Versuchen im murinen Tumormodell gezeigt werden, daß eine zu geringe Anzahl an Tumorzellen nicht den gewünschten Immunisierungs erfolg bringt. Eine zu große Menge an Tumormaterial wiederum kann sich nachteilig auswirken, da beispielsweise Toleranzphänomene auftreten können. Überträgt man diese Resultate auf die Situation im Patienten, heißt dies, daß es für den Immunisierungs erfolg vorteilhaft ist, eine definierte Menge an Tumormaterial im korrekten räumlichen Kontext mit einer ebenfalls definierten Menge an Antikörpern zu verabreichen. Ein Immunisierungs erfolg stellt sich zwar auch dann ein, wenn einer dieser Parameter nicht optimiert wurde; besonders gute Ergebnisse werden jedoch erzielt, wenn sowohl die Mengen des Antikörpers als auch die Menge an Tumormaterial als auch der räumliche Kontext aufeinander abgestimmt und optimiert wurden.
Unter Berücksichtigung der obigen Ausführungen kann bei einer zu geringen Tumorzellzahl beispielsweise nur ein unzureichender Immunschutz etabliert werden. Daher ist es für einen vollständigen Immunisierungserfolg notwendig, mit einer definierten Anzahl an inaktivierten Tumorzellen und einer definierten Menge an bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörpern zu immunisieren. Die jeweiligen Zahlen können vom Fachmann anhand von Versuchen etabliert werden.
Die Tumorzellen werden bevorzugt in einer Menge von 105 - 108 Zellen pro Applikation verabreicht, wobei sich eine Zellzahl von ca. 107 als bevorzugt herausgestellt hat. Die Tumorzellen wurden, wie oben ausgeführt, vor der Reapplikation so behandelt, daß ihr Überleben nach Reapplikation verhindert wird, wobei sie wahlweise zusätzlich einer Hitzevorbehandlung unterzogen werden können. Die Tumorzellen werden aus Tumormaterial des zu behandelnden Patienten gewonnen. Das Tumormaterial wird beispielsweise durch enzymatische Behandlung, bevorzugt durch Kollagenase-Behandlung, zu einer Einzelzellsuspension aufbereitet. Wichtig ist, daß die Tumorzellen möglichst unbeschädigt vorliegen. Lysate der Tumorzellen haben sich als ungeeignet herausgestellt. Die Tumorzellen werden vor ihrer Applikation derart behandelt, daß ein Überleben der Tumorzellen im Patienten ausgeschlossen wird. Die Tumorzellen werden deshalb in an sich bekannter Weise behandelt, beispielsweise durch Bestrahlung oder durch Behandlung mit chemischen Agenzien. Durch die Behandlung soll insbesondere auch die äußere Struktur der Tumorzelle unverändert bleiben, so daß das Erkennungsmuster für die Antikörper erhalten bleibt.
Zur Bestrahlung wird bevorzugt eine γ-Bestrahhmg eingesetzt, die vorzugsweise mit einer Dosis von 20 bis 200 Gy erfolgt. Bei einer chemischen Behandlung hat sich Mitomycin C besonders bewährt.
Eine weitere Verbesserung der Immunogenität der Tumorzellen kann dadurch erreicht werden, daß diese vor Infusion einer Hitzevorbehandlung unterzogen werden. Die Temperatur liegt in einem Bereich von ca. 40 bis 45°C, wobei ein Bereich von 41 bis 42°C bevorzugt wird. Das Optimum kann durch Versuche ermittelt werden. Bevorzugte Ergebnisse werden insbesondere bei einer Temperatur von ca. 41,8°C erreicht. Der Zeitraum für die Hitzevorbehandlung beträgt im allgemeinen 1 bis 6 Stunden, bevorzugt ca. 3 Stunden. Sowohl der Zeitraum als auch die Temperatur, die optimalerweise eingesetzt werden, hängen auch von der Art des zu behandelnden Tumors ab. Die jeweiligen Optima können vom Fachmann anhand von Versuchen ermittelt werden.
Die Verabreichung der einzelnen Dosen erfolgt im Allgemeinen so, daß zur Erzielung einer Primärimmunisierung, d. h. zur Zerstörung der Tumorzellen, eine intraperitoneale Applikationsform gewählt wird, bei der die Antikörper in den Patienten infundiert werden. Die Verabreichung der Dosen für eine Sekundärirnmunisierung erfolgt im Allgemeinen durch eine örtliche Applikation, beispielsweise intradermal, subkutan oder intramuskulär. Sie kann aber auch intraperitoneal oder intravenös erfolgen.
Wenn zusammen mit den trifunktionellen Antikörper auch die inaktivierten autologen und/oder allogenen Tumorzellen und die autologen Immunzellen zur Erzielung einer Sekundärimmunität verabreicht werden, werden bevorzugt die nachfolgenden Mengen eingesetzt: a) 1-200 x 106 inaktivierte Tumorzellen, bevorzugt 10-100 x 106 inaktivierte Tumorzellen b) 10-500 x 106 Immunzellen, bevorzugt 50-200 x 106 Immunzellen c) 1-10 μg trifunktionelle bispezifische Antikörper oder trispezifische Antikörper, bevorzugt 2-5 μg Antikörper.
Wie bereits oben ausgeführt wird jedoch der Fachmann die jeweilige Menge und den Applikations ort so wählen, daß ein optimaler therapeutischer Erfolg gewährleistet ist.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte pharmazeutische Zubereitung liegt beispielsweise in einer isotonischen Kochsalzlösung vor. Weitere Komponenten können beispielsweise Stabilisierangsmittel wie Tween 80 oder Pufferlösungen sein.
Zur Behandlung werden bevorzugt intakte trifunktionelle bispezifische und/oder trispezifische Antikörper eingesetzt. Durch die Behandlung wird nicht nur die oben beschriebene überraschende direkte Zerstörung der Tumorzellen erreicht, sondern auch eine gegen den zu behandelnden Tumor gerichtete Immunität induziert.
Unter "intakte Antikörper" sind solche zu verstehen, die einen funktioneilen Fc-Teil besitzen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um heterologe Antikörper, d.h. sie sind aus schweren Immunglobulinketten unterschiedlicher Subklassen (-kombinationen, auch Fragmente) und/oder Herkunft (Spezies) zusammengesetzt.
Neben den oben beschriebenen Merkmalen a, b und c weisen die eingesetzten Antikörper in bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung noch die weiteren Merkmale d und e auf: d) aktiviert die Fc-Rezeptor positive Zelle durch seine Bindung an die Fc-Rezeptor positive Zelle, wodurch die Expression von Cytokinen und/oder von kostimulatorischen Antigenen initiiert oder erhöht wird; e) die kostimulatorischen Antigene und/oder Cytokine übertragen an die T-Zelle zumindest ein 2. Aktivierungssignal, das für eine physiologische Aktivierung der T- Zelle benötigt wird, wobei sich diese Aktivierung in der Hochregulation von Aktivierungsmarkern, der Zerstörung der Tumorzelle und/oder in einer Proliferation der T-Zelle zeigt. Die Erfindung wird nachfolgend insbesondere am Beispiel bispezifischer Antikörper beschrieben. Die Resultate sind aber auch mit trispezifischen Antikörpern erzielbar.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Antikörper sind befähigt, die Fc-Rezeptor positive Zelle zu aktivieren, wodurch die Expression von Zytokinen und oder kostimulatorischen Antigenen initiiert oder erhöht wird.
Bei den trispezifischen Antikörpern erfolgt die Bindung an die Fc-Rezeptor positiven Zellen bevorzugt beispielsweise über den Fc-Rezeptor von Fc-Rezeptor positiven Zellen oder auch über andere Antigene auf Fc-Rezeptor positiven Zellen (Antigen- präsentierenden Zellen), wie z.B. den Mannose-Rezeptor.
Durch die erfindungsgemäße Kombination und die Art der Anwendung der intakten, bevorzugt heterologen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper wird im Patienten neben der Behandlung des Aszites und des Pleuraergusses durch direkte Zerstörang der Tumorzellen auch eine Tumorimmunität aufgebaut, bevorzugt eine Langzeit-Tumorimmunität. Die Verabreichung erfolgt bevorzugt in einen Patienten nach der Behandlung des Primärtumors, bevorzugt bei Patienten in einer Tumorresterkrankungssituation (MRD = minimal residual disease). Bei Patienten mit wenig verbliebenen Tumorzellen, bei denen allerdings die Gefahr eines Rezidivs hoch sein kann, ist die erfindungsgemäß beschriebene Anwendung der pharmazeutischen Zubereitung besonders erfolgreich.
Die erfindungsgemäß verwendbaren heterologen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper sind an sich bekannt. Sie sind zum Beispiel beschrieben in Lindhofer et al., Blood, 88:4651, 1996 oder Lindhofer et al., J. nmunology, 155:219, 1995.
Auf der Tumorzelle erfolgt eine Hochregulation von MHC 1, sowie eine Aktivierung der intrazellulären Prozessierungsmaschinerie (Proteasom-Komplex) aufgrund der Freisetzung von Zytokinen (wie z.B. LNF-γ und TNF-α) in unmittelbarer Nachbarschaft der Tumorzelle. Die Zytokine werden aufgrund bispezifischer Antikörper-vermittelter Aktivierung von T-Zellen und akzessorischen Zellen freigesetzt. D.h. durch den intakten bsAk werden nicht nur Tumorzellen zerstört oder phagozytiert, sondern indirekt auch deren Tumorimmunogenität erhöht. Die Aktivierung der Fc-Rezeptor positiven Zelle durch den bsAk ist von der Subklasse bzw. der Subklassenkombination des bsAk abhängig. Wie in in vitro-Versuchen nachgewiesen werden konnte, sind beispielsweise bsAk der Subklassenkombination Maus- IgG2a/Ratte-IgG2b in der Lage, an Fc-Rezeptor positive Zellen zu binden und diese gleichzeitig zu aktivieren, was zur Hochregulation bzw. Neuausbildung (Expression) von kostimulatorischen Antigenen, wie z.B. CD40, CD80 oder CD86, auf der Zelloberfläche dieser Zellen f hrt (Zeidler et al., J. Immunol., 163: 1246, 1999). Dagegen sind bsAk der Subklassenkombination Maus-IgGl/RatteIgG2b zwar in der Lage an Fc-Rezeptor positive Zellen zu binden (Haagen et al., J. Immunology, 1995, 154: 1852-1860), können diese aber offenbar nicht in vergleichbarem Maße aktivieren (Gast et al., Cancer Immunol. Immuntherap., 1995, 40: 390).
Während der intakte bsAk die T-Zelle mit einem Bindungsarm (z.B. an CD3 oder CD2) bindet und gleichzeitig aktiviert, können kostimulatorische Signale von der an den Fc-Teil des bsAk gebundenen Fc-Rezeptor positiven Zelle an die T-Zelle übermittelt werden. D.h. erst die Kombination von Aktivierung der T-Zelle über einen Bindungsarm des bsAk und der gleichzeitigen Übertragung von kostimulatorischen Signalen von der Fc-Rezeptor positiven Zelle auf die T-Zelle, führt zu einer effizienten T-Zellaktivierung. Tumorspezifische T-Zellen, die an der Tumorzelle ungenügend aktiviert wurden und anergisch sind, können nach der erfindungsgemäßen Behandlung mit intakten bispezifischen Antikörpern oder trispezifischen Antikörpern ebenfalls reaktiviert werden.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Induktion einer Tumorimmunität ist die mögliche Phagozytose, Prozessierung und Präsentation von Tumorbestandteilen durch die vom bsAk herangeführten und aktivierten akzessorischen Zellen (Monozyten/Makrophagen, oder dendritische Zellen). Durch diesen klassischen Mechanismus der Präsentation von Antigenen können sowohl tumorspezifische CD4- wie auch CD8-positive Zellen generiert werden. Tumorspezifische CD4-Zellen spielen darüber hinaus eine wichtige Rolle für die Induktion einer humoralen Immunantwort im Zusammenhang mit der T-B-Zell Kooperation.
Bispezifϊsche und trispezifische Antikörper können mit einem Bindungsarm an den T- Zellrezeptor-Komplex der T-Zelle, mit dem zweiten Bindungsarm an tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzelle binden. Sie aktivieren dabei T-Zellen, die durch Freisetzung von Zytokinen oder Apoptose-vermittelnde Mechanismen die Tumorzellen zerstören. Darüber hinaus besteht offenbar die Möglichkeit, daß T-Zellen im Rahmen der Aktivierung mit bispezifischen Antikörpern tumorspezifische Antigene über ihren Rezeptor erkennen und dadurch eine dauerhafte Immunisierung eingeleitet wird. Von besonderer Bedeutung ist dabei der intakte Fc-Teil des bispezifischen oder üispezifischen Antiköipers, der die Bindung an akzessorische Zellen wie z.B. Monozyten/Makrophagen und dendritische Zellen vermittelt und diese veranlaßt selbst zytotoxisch zu werden und/oder gleichzeitig wichtige kostimulatorische Signale an die T-Zelle weiterzugeben. Auf diese Weise kann offensichtlich eine T-Zellantwort u.U. auch gegen bislang unbekannte, tumorspezifische Peptide induziert werden.
Durch Redirektion von u. U. anergisierten, tumorspezifischen T-Zellen an Tumorzellen mittels bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper bei gleichzeitiger Kostimulation derartiger T-Zellen durch akzessorische Zellen welche an den Fc-Teil des bispezifischen oder trispezifische Antiköipers binden, könnte die Anergie von zytotoxischen T-Zellen (CTLs) aufgehoben werden. D.h. eine im Patienten gegen den Tumor existierende T-Zell- Toleranz kann mittels intakter heterologer bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper gebrochen und damit eine dauerhafte Tumorimmunität induziert werden.
Für den letzten Punkt gibt es erste in vivo-Daten aus Mausversuchen, die auf eine derartige dauerhafte Tumorimmunität nach Behandlung mit einem syngenen Tumor und intakten bsAk hinweisen. In diesen Versuchen überlebten insgesamt 14 von 18 Tieren, die nach einer ersten Tumorinjektion erfolgreich mit bsAk behandelt werden konnten, eine weitere Tumorinjektion 144 Tage nach der ersten Tumorinjektion - ohne eine erneute Gabe von bsAk.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper sind bevorzugt zur Reaktivierang von in Anergie befindlichen, tumorspezifischen T-Zellen befähigt. Weiterhin sind sie zur Induktion von tumorreaktiven Komplement-bindenden Antikörpern und damit zur Induktion einer humoralen Immunantwort in der Lage.
Die Bindung erfolgt bevorzugt über CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L und/oder CD44 an die T-Zelle. Die Fc-Rezeptor positiven Zellen weisen zumindest einen Fcγ-Rezeptor Typ I oder πi auf. Erfindungsgemäß einsetzbare Antikörper sind zur Bindung an Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, "Natural Killer" -Zellen (NK-Zellen) und/oder aktivierte neutiOphile Zellen als Fcγ-Rezeptor I und/oder in positive Zellen befähigt (Zeidler, 1999, Zeidler 2000 a.a.O.).
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörper bewirken, daß die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als kostimulatorische Antigene oder/und die Sekretion von Zytokinen durch die Fc-Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird. Die Zytokine sind bevorzugt IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8,IL-12, INF-γ und/oder TNF-α.
Die erfϊndungsgemäß einsetzbaren bispezifischen Antikörper sind beispielsweise:
ein anti-CD3 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD8 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD40L X anti-Tumor- assoziiertes Antigen-Antikörper und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen-Antikörper.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren trispezifischen Antikörper sind bevorzugt:
- ein anti-CD3 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und oder anti-CD4 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und oder anti-CD8 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und oder anti-CD40L X anti-Tumor- assoziiertes Antigen-Antikörper und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen-Antikörper.
Die erfϊndungsgemäß einsetzbaren trispezifischen Antikörper weisen zumindest eine T- Zell-Bindungsarm, einen Tumorzell-Bindungsarm und einen an Fc-Rezeptor positive Zellen bindenden Bindungsarm auf. Dieser zuletzt genannte Bindungsarm kann ein anti- Fc-Rezeptor-Bindungsarm oder ein Mannose-Rezeptor-Bindungsarm sein. Der bispezifische Antikörper ist bevorzugt ein heterologer intakter Ratte/Maus bispezifischer Antiköiper.
Mit den erfmdungsgemäß einsetzbaren bispezifischen und trispezifischen Antikörpern werden T-Zellen aktiviert und gegen die Tumorzellen rediiigiert. Bevorzugt einsetzbare heterologe intakte bispezifische Antiköiper werden aus einer oder mehreren der nachfolgenden Isotyp-Kombinationen ausgewählt:
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a, Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b, Ratte-IgG2b/Maus-IgG3 ,
Ratte-IgG2b/Human-IgGl ,
Ratte-IgG2b/Human-IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3 [orientaler Allotyp G3m(st) = Bindung an Protein A],
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3 [kaukasische Allotypen G3m(b+g) = keine Bindung an
Protein A, im folgenden mit * gekennzeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2- CH3]
Maus-IgG2a Ratte-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2- CH3]
Maus-IgG2a Human-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hmge]-Human-IgG3*- [CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1 ,VL-CL]-Human-IgGl /Ratte- [VH-CH1 ,VL-CL]-Human-IgGl- [Hinge]-Human-IgG3 *-[CH2-CH3] Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG4- [Hinge]-Human-IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: > AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG2-pinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2-CH3, orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2-CH3]
Human-IgGl/Human-tVH-CH^VL-CLl-Human-IgGl-fHingel-Human-IgGS*- [CH2-CH3]
Human-IgGl/Ratte-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG4[N- terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : > AS- Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgGl/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG4[N- terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : > AS- Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgGl/Ratte-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG2[N- terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : > AS- Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgGl/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG2rN- terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : > AS- Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgGl/Ratte-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3*- [CH2-CH3] Human-IgGl/Maus-[VH-CHl ,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3 *- [CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG2-[Hmge]-Human-IgG3*- [CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CHl ,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human-IgG3 *- [CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge3-Human-IgG4[N- terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : > AS- Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2- CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CHl ,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3 *- [CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Maus-[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl-[Hinge]-Human-IgG3*- [CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1 ,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CHl ,VL-CL]-Human-IgG4- [Hinge]-Human-IgG4-[CH2]-Human-IgG3*-[CH3]
HumanIgGl/Ratte[VH-CHl ,VL-CL]-Human-IgGl [Hinge]-Human-IgG4-[CH2]- HumanIgG3*[CH3]
HumanIgGl/Maus[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgGl[Hinge]-Human-IgG4-[CH2]- Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG4/Human[VH-CHl,VL-CL]-Human-IgG4-lΗinge]-Human-IgG4- [CH2]-HumanIgG3 *-[CH3] Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um monoklonale, chimäre, rekombinante, synthetische, halbsynthetische oder chemisch modifizierte intakte Antiköiper mit beispielsweise Fv-, Fab-, scFv- oder F(ab)2- Fragmenten.
Bevorzugt werden Antiköiper oder Derivate oder Fragmente vom Menschen verwendet oder solche, die derart verändert sind, daß sie sich für die Anwendung beim Menschen eignen (sogenannte "humanized antibodies") (siehe z.B. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).
Die Herstellung der verschiedenen oben genannten Antikörpertypen und -fragmente ist dem Fachmann geläufig. Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die ihren Ursprung vorzugsweise in Säugetieren, z.B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen oder Ziege, haben, kann mittels herkömmlicher Methoden erfolgen, wie sie z.B. in Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow und Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) oder in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) oder der DE 195 31 346 beschrieben sind.
Ferner ist es möglich, die beschriebenen Antikörper mittels rekombinanter DNA- Technologie nach dem Fachmann geläufigen Techniken herzustellen (siehe Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90 (1993), 6444).
Die Herstellung von Antikörpern mit zwei verschiedenen Spezifitäten, den sogenannten bispezifischen Antikörpern, ist zum einen durch Anwendung rekombinanter DNA- Technologie möglich, aber auch durch die sogenannte Hybrid-Hybridoma-Fusionstechnik (siehe z.B. Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Hierbei werden Hybridomazellinien, die Antikörper mit jeweils einer der gewünschten Spezifitäten produzieren, fusioniert und Zellklone (Quadrome) identifiziert und isoliert, die Antikörper mit beiden Spezifitäten produzieren.
Das der Erfindung zugrunde liegende Problem kann sowohl durch bispezifische als auch trispezifische Antikörper gelöst werden, die bevorzugt die gekennzeichneten Eigenschaften und Wirkungen aufweisen. Nachfolgend wird die Herstellung von Antikörpern mit zwei und drei Spezifitäten näher beschrieben. Die Bereitstellung derartiger bispezifischer und trispezifischer Antiköiper gehört zum Stand der Technik, und auf die derartige Herstellungstechniken beschreibende Literatur wird hier voll inhaltlich Bezug genommen.
Die Herstellung von Antiköipem mit drei Spezifitäten, sogenannten trispezifischen Antikörpern, durch die das der Erfindung zugrundeliegende Problem ebenfalls lösbar ist, kann beispielsweise derart erfolgen, daß an eine der schweren Ig-Ketten eines bispezifischen Antikörpers eine dritte Antigenbindungsstelle mit einer weiteren Spezifität, z.B. in Form eines "single chain variable fragments" (scFv), angekoppelt wird. Das scFv kann beispielsweise über einen
-S-S(G4S)nD-I-Linker
an eine der schweren Ketten gebunden sein (S = Serin, G = Glycin, D = Aspartat, I = Isoleucin).
Analog dazu können trispezifische F(ab)2-Konstrukte hergestellt werden, indem die CH2- CH3-Regionen der schweren Kette einer Spezifität eines bispezifischen Antikörpers ersetzt werden durch ein scFv mit einer dritten Spezifität, während die CH2-CH3 -Regionen der schweren Kette der anderen Spezifität beispielsweise durch Einbau eines Stopcodons (am Ende der "Hinge"-Region) in das codierende Gen, z.B. mittels homologer Rekombination, entfernt werden.
Möglich ist auch die Herstellung trispezifischer scFv-Konstrakte. Hierbei werden drei VH- VL-Regionen, die drei verschiedene Spezifitäten repräsentieren, hintereinander in Reihe angeordnet.
Erfindungsgemäß werden z.B. intakte bispezifische Antikörper verwendet. Intakte bispezifische Antikörper sind aus zwei Antikörper-Halbmolekülen (je eine H- und L- Immunglobulinkette), die jeweils eine Spezifität repräsentieren, zusammengesetzt, und besitzen darüber hinaus, wie normale Antikörper auch, einen Fc-Teil mit den bekannten Effektorfunktionen. Sie werden bevorzugt durch die Quadrom-Technologie hergestellt. Dieses Herstellungsverfahren ist beispielhaft in der DE-A-44 19 399 beschrieben. Auf diese Druckschrift, auch bzgl. einer Definition der bispezifischen Antikörper, wird zur vollständigen Offenbarung vollinhaltlich Bezug genommen. Selbstverständlich sind auch andere Herstellungsverfahren einsetzbar, solange sie zu den erfindungsgemäß notwendigen intakten bispezifischen Antiköipem der obigen Definition führen.
Beispielsweise können in einem neu entwickelten Herstellungsverfahren (Lindhofer et al., J. Immunology 1995, 155: 219) intakte bispezifische Antikörper in ausreichender Menge produziert werden. Die Kombination von 2 bispezifischen Antiköipem gegen 2 unterschiedliche tumorassoziierte Antigene (z.B. c-erb-B2, und EpCAM) auf den Mammakarzinomzellen minimiert die Gefahr, daß Tumorzellen, die nur ein Antigen exprimieren, unerkannt bleiben.
Weitere Vorteile von intakten bsAk mit der Fähigkeit zur Redirektion von T-Zellen gegenüber den o.g. bsF(ab')2 Fragmenten sind im einzelnen:
1. An intakte bsAk können Fc-Rezeptor positive Zellen binden und einerseits über ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) direkt zur Tumorzerstörang beitragen sowie andererseits wie oben näher ausgeführt zur T-Zellaktivierung.
2. Durch intakte T-Zell-redirigierende bsAk werden auch anergisierte tumorspezifische T- Zellen an die Tumorzelle herangeführt, die erfindungsgemäß direkt am Tumor reaktiviert werden können. Dies kann durch ein bsF(ab')2-Fragment mit den Spezifitäten anti-CD64Xanti-tumorassoziiertes Antigen nicht erreicht werden.
Die Bindung des bsAk an Fcγ-RI besitzt zwei wesentliche Vorteile im Hinblick auf eine optimale anti-Tumorwirksamkeit:
(1) Fcγ-RI positive Zellen besitzen die Fähigkeit mittels ADCC Tumorzellen zu eliminieren und können insofern synergistisch zur anti-Tumorwirkung der durch den bsAk an die Tumorzelle herangeführten cytotoxischen T-Zellen beitragen.
(2) Fcγ-RI positive Zellen (wie z.B. Monozyten/Makrophagen/Dendriten) sind in der Lage, wichtige kostimulatorische Signale, ähnlich wie bei der Antigen-Präsentation, der T- Zelle zu liefern und damit eine Anergisierung der T-Zelle zu verhindern. Es können weiterhin, als erwünschtes Nebenprodukt, aufgrund der durch intakten bsAk vermittelten Interaktion von T-Zelle mit akzessorischer Zelle und Tumorzelle sogar T- Zellen, deren T-Zellrezeptor tumorspezifische Peptide (über MHC Antigene auf der Tumorzelle präsentiert) erkennt, stimuliert werden. Die für eine korrekte Aktivierung der T-Zelle notwendigen Kostimuli würden in dieser Konstellation von der akzessorischen Zelle (z.B. Monocyt) geliefert werden. Insofern sollte der erfindungsgemäße Antikörper neben der direkten T-Zellrezeptor-unabhängigen, durch bsAk vermittelten Tumorzerstörung ebenfalls tumorspezifische T-Zellen aktivieren und generieren, die nach Abbau der bsAk weiterhin im Patienten patrouillieren. D.h. mittels intakter bsAk kann ähnlich wie bei gentherapeutischen Ansätzen (z.B. durch Einbau von kostimulatorischen Antigenen wie B-7 in die Tumorzelle) die Tumortoleranz im Patienten durchbrochen werden.
Wie überraschend in zwei Patienten gezeigt werden konnte, kann die Immuntherapie von Tumoren mittels trifunktioneller bispezifischer Antikörper auch bei der Behandlung von Aszites therapeutisch eingesetzt werden.
Bei einer Patientin mit Ovarialkarzinom konnte die Neubildung von Aszites nach einer Behandlung mit bsAk für einen Zeitraum von 6 Monaten unterbunden werden. Dabei konnte auch die vollständige Zerstörang der Tumorzellen, die in der Aszitesflüssigkeit vorhanden sind, nachgewiesen werden.
Beispiel 1
Bei einer Patientin mit Ovarialkarzinom wurde zunächst das Peritoneum punktiert, Aszitesflüssigkeit (700ml) entnommen und die darin enthaltenen Zellen analysiert. Wie in Abb.1 gezeigt, konnten die Tumorzellen bereits visuell mittels Mikroskop auf Grand ihrer Morphologie eindeutig identifiziert werden. Zusätzlich wurde eine anti-EpCAM Peroxidasefärbung durchgeführt.
Die Auszählung der Zellen im Aszites vor der Behandlung ergab ein Verhältnis von ca. 50:50 von Tumorzellen und Immunzellen.
Die durchflußzytometrische Analyse ergab eine starke Positivität der Tumorzellen für das Oberflächenantigen EpCAM (epithelial cell adhesion molecule, Baizar et al., Mol. Cell. Biol., 18:4833, 1998) sowie eine schwächere Expression des tumorassoziierten Oberflächenantigens Her2/neu (Abb. 2).
Um die Möglichkeit einer Fremdproteinreaktion auszuschließen wurden zunächst lOμg des bsAk TPBS03 REXOMAB (anti-Her2/neu X anti-CD3; Isotypkombination MausIgG2a x RatteIgG2b) intraperitoneal mittels Perfusorspritze über 8h infundiert. Die genaue Applikation ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 : Dosierungsschema
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Eine erste Veränderung konnte 1 Tag nach der 40 μg Infusion festgestellt werden. Es wurde zu diesem Zeitpunkt eine Peritoneallavage durchgeführt und die darin enthaltenen Zellen analysiert, wobei sich das Verhältnis von Immunzellen zu Tumorzellen auf den Wert 3 : 1 verbessert hatte.
Überraschenderweise konnten am Tag 11 unmittelbar vor der 160μg Infusion bei der zweiten Peritoneallavage nur noch vereinzelte Tumorzellen gefunden werden. Das Verhältnis von Immunzellen zu Tumorzellen hatte sich dramatisch auf den Wert 330: 1 verändert.
In der dritten Peritoneallavage am Tag 15 nach Gabe von 160μg und unmittelbar vor der 250μg Infusion konnten keinerlei Tumorzellen mehr nachgewiesen werden (Abb.l). Dieses Ergebnis konnte mittels einer besonders sensitiven nested-EpCAM RT-PCR bestätigt werden (Abb.3).
Es ist festzuhalten, dass es während der Behandlung zu keinerlei schwereren Nebenwirkungen kam. Lediglich nach der höchsten Dosis von 250μg bsAk kam es kurzzeitig zu Fieber (38,6°C).
Bei der Patientin konnte über einen Zeitraum von 6 Monaten keine Neubildung der Aszitesflüssigkeit beobachtet werden und es musste auch keine weitere Punktion durchgeführt werden. Dies ist insofern bemerkenswert da das Krankheitsstadium bei dieser Patientin zum Zeitpunkt des Beginns der Immuntherapie sehr fortgeschritten war und bereits Lebermetastasen existierten.
Beispiel 2
Bei einer weiteren Patientin mit Mammakarzmom und Aszitesbildung wurde ebenfalls das Peritoneum punktiert, die Aszitesflüssigkeit (3 Liter) gesammelt und die darin enthaltenen Zellen in der Durchflusszytometrie analysiert. Es wurden dabei Nachweisantiköφer gegen das tumorassoziiert Antigen EpCAM und CD14 verwendet um eine unspezifische Bindung an Fc-Rezeptor positive Zellen (der Nachweisantiköφer) von einer Bindung an Tumorzellen unterscheiden zu können. Wie in Abb. 4 dargestellt, waren zum Zeitpunkt Tag 0 vor der Therapie, über 70% der in der Aszitesflüssigkeit nachweisbaren Zellen, EpCAM-positive Tumorzellen die allerdings unter der Therapie auf 0,7% abnahmen.
Die Patientin erhielt am Tag 0, nach Ablassen der Aszitesflüssigkeit, lOμg des anti- EpCAM X anti-CD3 Antiköφers Removab (Isotypkombination: Maus IgG2a x RatteIgG2b), sowie an den darauffolgenden Tagen 2 und 5 jeweils 40μg und lOOμg Removab intraperitoneal über einen Zeitraum von ca. 6 Stunden verabreicht. Am Tag 8 wurde der Patientin eine Kombination der Antiköφer Rexomab (anti-Her 2/neu X anti- CD3; lOOμg) und Removab (50 μg) intraperitoneal appliziert, nachdem in der Durchflußzytometrie ebenfalls das tumorassoziierte Antigen Her2/neu auf den Tumorzellen nachgewiesen werden konnte (nicht gezeigt).
Wie in Abb.5 dargestellt, nahm unter der Therapie die Flüssigkeitsneubildung des Aszites kontinuierlich ab und blieb zum Ende der Therapie ganz aus.
Die Behandlung wurde gut vertragen. Es kam allerdings nach der höchsten Dosis zu einem vorübergehendem Anstieg der Leberwerte und kurzzeitig zu Fieber.
Schlussfolgerung:
Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass bereits eine Dosis von 40μg bsAk eine gewisse anti-Tumor Wirksamkeit besitzt und es zur Aktivierung und Proliferation von Immun-Effektorzellen kommt. Nach Gabe von 160μg bsAk konnte selbst mit sehr sensitiven Nachweismethoden kein Hinweis auf das Vorhandensein von restlichen Tumorzellen in der Peritoneallavage der ersten Patientin mehr gefunden werden und somit von einer effektiven Zerstörang der autologen Tumorzellen in der Aszitesflüssigkeit ausgegangen werden. Ein ähnlicher Effekt konnte auch bei der zweiten Patientin nach Gabe von 100 μg REMOVAB festgestellt werden. Die Verträglichkeit der verabreichten Dosen war gut, es kam es lediglich bei einer der Patientinnen zu einer Erhöhung der Leberwerte oder sonstigen negativen Nebenwirkungen. Nach der 250μg Dosis (Patientin 1) bzw. 100 μg Dosis (Patientin 2) kam es kurzzeitig zu Fieber (38,6°C).
Insofern ließe sich für zukünftige Behandlungen zur Zerstörung von Tumorzellen im Aszites und der Vermeidung der Neubildung von Aszites folgende Applikation von trifunktionellen bispezifischen Antiköφern ableiten:
Tag 0 : lOμg (Einstiegs dosis zur Prüfung einer Überempfindlichkeitsreaktion gegen das Fremdprotein) Tag 2 : 40 μg (Aktivierung und Proliferation der Immunzellen) Tag 4 : 200 μg (Hauptdosis zur Zerstörung der Tumorzellen)
Nachdem es gegenwärtig keine befriedigende Behandlung von malignem Aszites bei Tumorerkrankungen gibt, stellt die Immuntherapie mittels bsAk hier eine neue, vielversprechende Methode dar.
Die immuntherapeutische Behandlung von Aszites intraperitoneal mittels trifunktioneller bsAk kann auch als Primärimmunisierung zur Induktion einer langanhaltenden anti-Tumor Immunität dienen.
Der Bauchraum enthält eine ganze Reihe von immunologischen Organen wie z.B. Milz, Peyer'sche Plaques und eine Vielzahl von Lymphknoten. Die trifunktionellen bsAk sind in der Lage auf Grund ihrer Interaktion mit Tumorzellen, T-Zellen und akzessorischen Zellen (Zeidler et al., J.Immunol. 163: 1246, 1999, Zeidler et al., British J. Cancer 83:261, 2000), Tumormaterial dem antigenpräsentierendem System zuzuführen und eine Einwanderang von aktivierten dendritischen Zellen in die immunologischen Organe einzuleiten.
Diese Vorgänge sind essentielle Voraussetzungen für die Induktion einer Irnmunantwort gegen den autologen Tumor. Um die antitumorale Immunantwort langfristig zu etablieren und insbesondere eine funktionale polyklonale humorale und zelluläre Immunantwort zu generieren, ist eine Sekundärimmunisierung notwendig. Die Sekundärimmunisierung kann auch subcutan bzw. intradermal durchgeführt werden. Als autologes Tumormaterial kann bei malignem Aszites die in ihm befindlichen Tumorzellen einfach mittels Punktion gewonnen und verwendet werden.

Claims

Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zurBehandlung von malignem AszitesP atentansprtiche
1. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung, die einen trifunktionellen bispezifischen und/oder trispezifischen Antiköφer mit den nachfolgenden Eigenschaften enthält: a) bindet an eine T-Zelle; b) bindet an zumindest ein Antigen auf einer Tumorzelle, die mit malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß in Zusammenhang steht; c) bindet durch seinen Fc-Teil (bei bispezifischen Antiköφern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifischen Antiköφern) an Fc-Rezeptor positive Zellen
zur Zerstörang der Tumorzellen bei der Behandlung von malignem Aszites und/oder einem Pleuraerguß.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung zur Verabreichung in Form einer ersten Dosis und zumindest einer weiteren Dosis ausgelegt ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung zur Verabreichung in Form einer zweiten Dosis zur Aktivierung und Proliferation der Immunzellen und zumindest einer dritten Dosis zur Zerstörung der Tumorzellen ausgelegt ist.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung zur Verabreichung in Form einer ersten Dosis zur Prüfung allergischer Reaktionen gegen den verabreichten Antiköiper ausgelegt ist.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung so ausgelegt ist, daß zur Verabreichung am ersten Tag eine erste Dosis von 1 bis 20 μg, bevorzugt 5 bis 10 μg, des Antiköφers, zur Verabreichung der zweiten Dosis eine Menge von 20 bis 100 μg, bevorzugt 30 bis 60 μg, des Antiköφers, und zur Verabreichung jeder weiteren Dosis eine Menge von 100 bis 500 μg, bevorzugt 100 bis 300 μg, des Antiköipers enthalten ist.
6. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer in 3 bis 8 Dosen, bevorzugt 3 bis 6 Dosen, zur Primärimmunisierung verabreicht wird, bevorzugt zwischen jeder Applikation ein Zeitraum von ca. 2 bis 3 Tagen liegt, und weiterhin bevorzugt die Verabreichung des Antiköφers so lange erfolgen kann, bis eine Antiköφerreaktion gegen den verabreichten Antiköφer nachweisbar ist.
7. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung so ausgelegt ist, daß zur Sekundärimmunisierang bei der Verabreichung weiterer Dosen inaktivierte autologe und/oder allogene Tumorzellen und autologe Immunzellen enthalten sind.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als autologe Immunzellen Apheresezellen eingesetzt werden, die bevorzugt vor der ersten Chemotherapie gewonnen wurden.
9. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung zur Primärimmunisierung bevorzugt für eine intraperitoneale Applikation ausgelegt ist und zur Sekundärimmunisierang für eine intradermale, subkutane oder intramuskuläre Applikation ausgelegt ist.
10. Verwendung nach Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutische Zubereitung zur Sekundärimmunisierang bevorzugt die nachfolgenden Mengen enthält: a) 1-200x10 inaktivierte Tumorzellen, bevorzugt 10-100x10 inaktivierte Tumorzellen b) 10-500xl06 Immunzellen, bevorzugt 50-200xl06 Immunzellen c) 1-10 μg trifunktionelle bispezifische Antiköφer oder trispezifische Antiköφer, bevorzugt 2-5 μg Antiköφer
11. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein intakter bispezifischer oder trispezifischer Antiköφer eingesetzt wird.
12. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer zur Bindung Fc-Rezeptor positiver Zellen befähigt ist, die einen Fcγ- Rezeptor I oder in aufweisen.
13. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer zur Bindung an Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, "Natural Killer" -Zellen (NK-Zellen) und/oder aktivierte neutrophile Zellen als Fcγ- Rezeptor I und/oder Hl positive Zellen befähigt sind.
14. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer zur Induktion von tumorreaktiven Komplement-bindenden Antiköφem und damit zur Induktion einer humoralen Immunantwort befähigt sind.
15. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer so ausgewählt werden, daß sie über CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L (= CD154) und/oder CD44 an die T-Zellen binden.
16. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer so ausgewählt werden, daß nach ihrer Bindung an die Fc-Rezeptor positiven Zellen die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als kostimulatorische Antigene und/oder die Sekretion von Zytokinen durch die Fc- Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird.
17. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antiköφer so ausgewählt werden, daß die Sekretion der Zytokine IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, LNF-γ und/oder TNF-α erh öht wird.
18. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antiköφer so ausgewählt wird, daß er ein anti-CD3 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und oder anti-CD4 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und oder anti-CD6 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD8 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und oder anti-CD40L X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen-Antiköφer ist.
19. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antiköφer aus einem heterologen bispezifischen oder trispezifischen Antiköφer, bevorzugt einem heterologen Ratte/Maus bispezifischen Antiköφer, ausgewählt wird.
20. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß der trispezifische Antiköφer einen T-Zell-Bindungsarm, einen Tumorzell- Bindungsarm und eine dritte Spezifität zur Bindung an Fc-Rezeptor positive Zellen besitzt.
21. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß der trispezifische Antiköφer so ausgewählt wird, daß er ein anti-CD3 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und oder anti-CD4 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD8 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 X anti-Tumor- assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD40L X anti-Tumor-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 X anti-Tumor-assoziiertes Antigen-Antiköφer ist.
22. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß
Tumorzellen eingesetzt werden, die durch Bestrahlung, bevorzugt durch γ-Bestrahlung, weiterhin bevorzugt in einer Dosisstärke von 50 bis 200 Gy, oder durch chemische Substanzen, bevorzugt Mitomycin C, behandelt wurden.
23. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Steigerung der Immunogenität der Tumorzellen diese vor Verabreichung einer Hitzevorbehandlung unterzogen werden.
24. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antiköφer weiterhin so ausgewählt wird, daß er zur Aktivierung Fc-Rezeptor positiver Zellen befähigt ist, wodurch die Expression von Cytokinen und oder co- stimulatorischen Antigenen initiiert oder erhöht wird.
25. Verwendung nach einem oder meheren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß autologe Immunzellen aus PBMC, Apherisaten oder Knochenmark eingesetzt werden.
26. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische und/oder trispezifische Antiköφer in einer Menge von 0,1 - 500 μg, die autologen oder allogenen Tumorzellen in einer Menge von 105-2 x 108 und die autologen Immunzellen in einer Menge von 5 x 106-5 x 108 Zellen vorliegen.
27. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zur Zerstörang der Tumorzellen eine Immunität gegen die Tumorzellen, gegen den die trifunktionellen bispezifischen Antiköφer oder trispezifischen Antiköφer gerichtet sind, etabliert wird.
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