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WO2002065112A1 - Apparatus for detecting interaction between biopolymer and ligand and method thereof - Google Patents

Apparatus for detecting interaction between biopolymer and ligand and method thereof Download PDF

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WO2002065112A1
WO2002065112A1 PCT/JP2002/001269 JP0201269W WO02065112A1 WO 2002065112 A1 WO2002065112 A1 WO 2002065112A1 JP 0201269 W JP0201269 W JP 0201269W WO 02065112 A1 WO02065112 A1 WO 02065112A1
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WO
WIPO (PCT)
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biopolymer
reaction field
detecting
interaction
sample
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PCT/JP2002/001269
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English (en)
French (fr)
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Akihiko Tanioka
Yutaka Yamagata
Kozo Inoue
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S T RESEARCH Co Ltd
S T Res Co Ltd
RIKEN
Original Assignee
S T RESEARCH Co Ltd
S T Res Co Ltd
RIKEN
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Publication date
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Priority to EP02712364A priority patent/EP1371974A4/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/5438—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for detecting an interaction between a biopolymer and a ligand, and a method therefor.
  • radioimmunoassay which labels a known ligand with a radioisotope, an enzyme, or a fluorescent compound
  • a labeled immunoassay method such as an enzyme immunoassay (EIA / ELISA) or a fluorescence immunoassay (FIA)
  • EIA / ELISA enzyme immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • SPR sensor surface plasmon resonance phenomenon
  • This method is based on the phenomenon that, if there is a change in concentration near a metal thin film provided on a glass substrate, it is reflected on the refractive index, and the incident angle that reduces the intensity of reflected light changes.
  • one of the compounds whose bond is to be observed is immobilized on a gold thin film via dextran or the like, and a sample solution containing another compound is allowed to flow to detect a change in the incident angle.
  • the streaming potential or the electropotential generated by the interfacial electric double layer indicates the state of the solid surface, and is applied to various purposes in many fields such as polymer membranes, fibers, and various particles. It is known that this streaming potential or overnight potential is also changed by the binding of a biopolymer to a ligand (Biosensors 2, pages 89-: 100, 1986).
  • Labeling immunoassay methods such as the enzyme immunoassay (E. I AZE LISA) and fluorescence immunoassay (FIA) require the use of a known ligand / labeled compound. Not applicable to proteins of unknown function.
  • the SPR sensor does not require a known ligand-labeled compound, it is currently focused on detecting relatively large intermolecular bonds, and it is said that the lower molecular weight is limited to several hundred daltons even under optimal conditions. This is a major limitation when applied to proteins of unknown function.
  • the mechanochemical method does not require a known ligand-labeled compound like the SPR sensor, and can be applied to low molecular weight compounds. (It has been reported that the binding between protein and Ca or Mg can be detected.) However, it is very likely that the device will be very large and complicated if it is applied to simultaneously detect the binding of a large number of proteins and ligands.
  • the streaming potential-sequential potential has been studied as a method applicable to detection of binding between a biopolymer and a ligand without requiring a known ligand-labeled compound and regardless of the molecular weight.
  • the problem with this method is the method for fixing biopolymers. Glad et al. Fixed the biopolymer in a tube packed with a porous material, Nishizaki fixed it in latex particles, and Koch et al. Fixed it in a fused silica-filled cavernary. Therefore, the conventional fixation method cannot detect the interaction between many biopolymers and the ligand at once.
  • an object of the present invention is to provide an apparatus and a method for detecting the binding between a high molecule and a compound that specifically binds thereto without the need for a known ligand-labeled compound.
  • Another object of the present invention is to provide an apparatus and a method for detecting the binding between a large number of biopolymers and a compound that specifically binds to them at a time without requiring a known ligand / labeled compound. It is. Disclosure of the invention
  • An apparatus for detecting an interaction between a biopolymer and a ligand according to the present invention includes: a reaction field in which a biopolymer is immobilized; a supply channel connected to the reaction field, for supplying a sample to the reaction field; A recovery flow path connected to the reaction field and recovering a sample that has passed at least a part of the reaction field; and a block forming a reaction system having:
  • a sample is supplied to the reaction field via the supply channel, and while the sample that has passed at least a part of the reaction field is collected from the recovery channel, the flow potential of the fixed biological polymer is changed.
  • an apparatus for detecting an interaction between a biopolymer and a ligand comprises: the block comprising first and second substrates having flat surfaces joined to each other; A supply flow path and a recovery flow path are formed on the joint surface of these substrates, and a supply opening and a recovery opening for connecting the supply flow path and the recovery flow path to the outside are formed. It is characterized by having achieved.
  • an apparatus for detecting an interaction between a biopolymer and a ligand according to the present invention is characterized in that the biopolymer is immobilized by an electrospray deposition method.
  • the apparatus for detecting the interaction between a biopolymer and a ligand according to the present invention includes a pair of minute electrodes arranged on the supply channel side and the recovery channel side of the fixed biopolymer,
  • the electrode is an ISFET
  • the apparatus for detecting the interaction between a biopolymer and a ligand comprises a plurality of biopolymer films or spots arranged and fixed in an array, and each of the above-mentioned films or spots.
  • a plurality of pairs of electrodes disposed on the supply channel side and the recovery channel side of the film or spot,
  • an apparatus for detecting an interaction between a biopolymer and a ligand includes: a pair of pressure detecting means arranged at the supply opening and the collection opening; And calculating means for determining the potential over time based on
  • the method for detecting the interaction between a biopolymer and a ligand comprises a reaction field in which the biopolymer is immobilized, a reaction field connected to the reaction field, and a sample supplied to the reaction field.
  • the method for detecting the interaction between a biopolymer and a ligand according to the present invention includes the steps of detecting pressure at the supply opening and the recovery opening, respectively, based on the measured streaming potential and pressure.
  • the present invention has been mainly described as an apparatus. However, it goes without saying that the present invention includes respective methods corresponding to these apparatuses.
  • the potential difference between the slip surface and the inside of the solution is called the zero potential () potential or the electrokinetic potential.
  • ⁇ an arbitrary pressure difference
  • ⁇ an arbitrary pressure difference
  • streaming potential a potential difference appears between both interfaces of the membrane, at both ends of the capillary and the two flat plates.
  • ⁇ ⁇ is the pressure difference between the two interfaces of the membrane and the ends of the capillary or two flat plates when flowing the solution
  • ⁇ is the dielectric constant of the solution
  • ? 7 is the viscosity of the solution
  • ⁇ is the conductivity of the solution.
  • ⁇ , 7 and are values specific to the solution, and can be known from the literature and other measurements. Therefore, ⁇ can be obtained by measuring ⁇ while changing. ⁇ can be considered as a parameter that represents the characteristics of the surface of the membrane, capillary, or plate.
  • the measurement is performed between both interfaces of the membrane and at both ends of the capillary or two flat plates as described above.
  • a local pressure difference ⁇ ⁇ ⁇ is applied between two intermediate points in a membrane pore, capillary or two flat plates, a local potential difference ⁇ between the two points can be obtained, and an apparent local One night potential ⁇ ⁇ ⁇ 5 can be obtained.
  • ⁇ ? 7. If the conditions such as ⁇ are kept constant, the obtained streaming potential can be used as a measure of the surface evaluation instead of the overnight potential. Therefore, when there are ⁇ parts with different properties (called local surfaces) on the surface of pores, capillaries and two flat plates in a membrane, ⁇ sets of electrodes are placed at both ends of each local surface.
  • ⁇ sets of streaming potentials can be obtained.
  • the local pressure difference between the electrodes on the ⁇ sets of local surfaces can be obtained from the measurement of the total pressure difference ⁇ and the position of the electrodes, and thus the apparent local zeta potential can be finally calculated.
  • FIG. 1 is a sectional view showing the basic structure of a detection device 10 according to the present invention
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a first substrate 21 constituting a detection device according to the present invention
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a second substrate 34 constituting a detection device according to the present invention
  • FIG. Sectional view of a double-sided detection device 50 according to the invention
  • Figure 5 is a cross-sectional view of a substrate using a pin-type electrode
  • Figure 6 is a cross-sectional view of a substrate using land-type electrodes
  • Fig. 7 is a schematic diagram of an electrode using an IS-FET (Ion Sensitive Field Effect Transistor).
  • IS-FET Ion Sensitive Field Effect Transistor
  • FIG. 8 is a cross-sectional view of a substrate using an IS-FET type electrode
  • Figure 9 is a schematic diagram of an array-type detector in which a number of biopolymer spots and electrodes are arranged;
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the potential difference obtained when a CaC 12 aqueous solution (HEPES buffer pH 7.5) was passed at lm L / min and the aqueous solution concentration; and
  • FIG. 4 is a graph showing the difference between the streaming potential of a substrate on which a polymer spot is immobilized and the streaming potential of a substrate without spots alone.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a basic structure of a detection device 10 according to the present invention.
  • the detection device 10 is composed of a block having a reaction system in which the flat surfaces of the first substrate 11 and the second substrate 14 are joined to form a flow path and a reaction field on the joining surface.
  • a biopolymer spot 12 (film) is immobilized on the surface of the first substrate 11, and a pair of electrodes 13 is arranged on the upstream and downstream sides of the spot 12.
  • the second substrate 14 is provided with a concave portion 18 that forms a supply channel 15, a recovery channel 16, and a reaction field 17 by bonding.
  • a supply opening 19 and a recovery opening 20 for communicating the flow path with the outside, and are connected to the inflow pipe and the discharge pipe, respectively.
  • a 0 ring is A ring-shaped groove for accommodating the O-ring is provided on both or one of the substrates.
  • the size of the first substrate 11 is about 75 x 25 mm made of acrylic having a thickness of 1 mm, and the second substrate 14 functioning as a flow channel structure has a thickness of 75 x 25 mm as well. It is 5 mm and made of acrylic.
  • two rod-shaped platinum electrodes 13 are fixed in front and behind (upstream and downstream) of the polymer film of the first substrate 11 and have a diameter of about 0.2 mm. It protrudes approximately 0.5 mm from the substrate surface.
  • the channel is sealed by an oval o-ring, 1 mm thick, 5 mm wide and about 35 mm long.
  • the liquid is injected from the inflow pipe by a peristatic pump or the like.
  • the biopolymer spots 12 are formed by an electrospray method, and are cross-linked by dartal aldehyde.
  • the local streaming potential generated between the pair of electrodes 13 and 13 is measured while the sample solution containing the ligand is injected into the inflow tube while applying pressure, and the sample is allowed to flow into the reaction field serving as the measurement site. .
  • the binding between the substance present on the local surface and the ligand is determined based on the change in the value of the streaming potential measured in this way or the difference from the reference potential measured using a substrate without a biopolymer.
  • FIG. 1 shows an example of a device having a single measuring unit provided with one biopolymer film and a pair of electrodes.
  • n measuring units are provided in an array (n spots and It is also possible to configure an apparatus that measures a streaming potential due to the binding of a plurality of types of biomolecules and ligands at a time, with n pairs of electrodes provided before and after each spot).
  • the range of n is preferably l ⁇ n ⁇ l 0 0 0 0.
  • the device can be configured under the following conditions.
  • the distance between the flow path and the reaction field formed on the joint surface between the first substrate and the second substrate is set to 50 nm or more and 1 cm or less.
  • each substrate is lmm 2 or more and 900 cm 2 or less.
  • the material of the substrate is a metal, inorganic, or organic material, but has conductivity.
  • Platinum, platinum black, silver / silver chloride are used for the electrodes. 5 mm or more and 2 mm or less, for a flat plate, the thickness is 0.05 mm or more and 2 mm or less, and the width is 0.1 mm or more and 1 cm or less.
  • the electrolyte solution used is an aqueous solution consisting of electrolytes monovalent such NaC 1, an aqueous solution comprising a divalent electrolytes such as Ca C 1 2, with an aqueous solution consisting of other multivalent electrolyte, concentration 10- 5 Use between mo 1ZL and 5mo 1ZL.
  • the pressure difference ⁇ applied between both ends of the flow channel is from 0.01 atm to 1 atm.
  • the size of the minute film or spots to 1 cm 2 or less 1 m 2 or more.
  • the g separation between electrodes should be 1 m or more and 1 cm or less.
  • the individual potentiometers are located in front of or behind the biopolymer microfilm or spot (the supply channel side and the recovery channel side) on which proteins and DNA are deposited by electrospray. It consists of a pair of electrodes arranged back and forth across a film or spot on an unfixed part, and the potential difference between these electrodes is measured while flowing the sample. The difference between the potential difference measured in this way and the potential difference when the biopolymer is not fixed or the potential difference from when the sample is started to flow is used to bind the biopolymer to the ligand. To detect.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the first substrate 21 constituting the detection device according to the present invention.
  • a spot 22 (film) of a biopolymer is fixed on the flat surface of the first substrate 21, and a pair of electrodes 23 are arranged on the upstream and downstream sides of the spot 22.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the second substrate 34 constituting the detection device according to the present invention.
  • the second substrate 34 is provided with a recess 38 that forms a supply channel 35, a recovery channel 36, and a reaction field 37 by bonding.
  • a supply opening 39 and a recovery opening 40 for communicating the flow path with the outside are provided.
  • a groove 41 for attaching an O-ring is provided to prevent liquid leakage of the sample.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of a double-sided detection device 50 according to the present invention.
  • This double-sided detector The device 50 is composed of a block having a reaction system in which the flat surfaces of the first substrate 51 and the second substrate 54 are joined to form a flow path and a reaction field on the joining surface.
  • a biopolymer spot 52A (film) is immobilized on the surface of the first substrate 51, and a pair of electrodes 53A are arranged upstream and downstream of the spot 52A.
  • a biopolymer spot 52B (film) is fixed on the surface of the second substrate 54, and a pair of electrodes 53B are arranged on the upstream and downstream sides of the spot 52B.
  • the biopolymer spot 52 B and the pair of electrodes 53 B are provided on the upper substrate, and the streaming potential can be detected with higher sensitivity. It is.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a substrate using a pin-type electrode.
  • a biopolymer spot 62 is immobilized on the surface of a substrate 61, and a pair of pin-type electrodes 6 are formed on the upstream and downstream sides so as to penetrate the substrate 61 and be exposed to a reaction field. Three are provided.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of a substrate using land-type electrodes.
  • a biopolymer spot 72 is immobilized on the surface of a substrate 71, and a pair of land electrodes 73 is provided on the upstream and downstream sides. Wiring is connected to the land-type electrode 73 by penetrating from the lower side to the upper side of the substrate 71.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of an electrode using an IS-FET (Ion Sensitive Field Effect Transistor).
  • a biopolymer spot 82 is immobilized on the surface of a substrate 81, and a pair of IS-FET electrodes 83 is provided on the upstream and downstream sides thereof.
  • FIG. 8 is a sectional view of a substrate using IS-FET type electrodes.
  • 91 is a substrate
  • 92 is an oxide film
  • 93 A is a drain
  • 93 B is a source
  • 94 is a gate oxide film
  • 95 is a protective film
  • 96 is an electrode wiring. If an ISFET type electrode is used as shown in the figure, it is possible to detect the streaming potential with higher sensitivity because it is very sensitive to the potential change on the upper surface of the gate oxide film.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of an array-type detector in which a number of biopolymer spots and electrodes are arranged.
  • 101 is the inlet
  • 102 is the distribution circuit
  • 103 Is a reaction field, ie, a measurement site
  • 104 is a connector for taking out electrode wiring
  • 105 is a recovery circuit
  • 106 is an outlet.
  • the lower part of Fig. 9 is an enlarged view of a part of the reaction field 103.
  • 111 is a microchannel
  • 112 is a biopolymer spot
  • 113 is an electrode
  • 114 is Is a wiring.
  • each spot 1 1 2 is almost the same as the basic type, but these electrode wirings are drawn out to one place by the pattern on the back surface of the substrate, making it possible to electrically detect at high speed. ing.
  • the sample (reaction liquid) is supplied uniformly and continuously to each spot 1 1 2 by the fine channel 1 1 1. According to this configuration, it is also possible to construct a system in which a large number of different biopolymer spots are formed on a substrate to enable detection of many different types of substances at the same time.
  • a different structure such as a land type can be obtained by applying a printed board forming technique or the like.
  • the wiring can be guided to the outside of the substrate using the back surface or the front surface, and an amplifier circuit can be provided immediately below the electrodes.
  • FIG. 11 is a graph showing the difference between the streaming potential of the substrate on which the spot of the biopolymer is immobilized and the streaming potential of the substrate without the spot alone.
  • the apparatus and method for detecting the interaction between a biopolymer and a ligand of the present invention for example, it is possible to specifically bind to various polymers without requiring a known ligand / labeled compound.
  • the binding to the compound, ie, the interaction can be detected easily and easily.
  • the device and method according to the present invention are expected to be applied to various fields such as clinical diagnostic analysis and environmental analysis.

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Description

明 細 書 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 技術分野
本発明は、 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置、 及びその方法 に関するものである。 背景技術
生体内の反応の多くは、 生体高分子特に蛋白質とその蛋白質と特異的に結合す る化合物 （リガンドという） との結合により開始される。
ヒ卜の遺伝子配列が決定され、 個々の遺伝子の機能つまりはその遺伝子の生産 する蛋白質の機能を解明することが求められている昨今、 生体高分子とリガンド の結合を検出する技術は益々重要となる。 また、 蛋白質とリガンドの結合は極め て特異性が高いため、 臨床診断分析や環境分析など多くの分野で分析技術として も活用されている。 そのため従来から、 蛋白質とリガンドの結合を検出するため の多くの技術が開発されてきた。
例えば、 既知のリガンドを放射性同位元素 ·酵素や蛍光化合物で標識するラジ オイムノアツセィ、 酵素ィムノアッセィ （E IA/EL I SA) や蛍光ィムノア ッセィ （F IA) 等の標識ィムノアッセィ法がよく知られている （例えば、 ぶん せき， 1999年，ページ 839〜843)。 この技術は抗体と坊原の分離方法などによつ ていくつかのグループに分けられるが、 基本は種々の既知の抗原または抗体を放 射性同位元素 ·酵素や蛍光化合物で標識し、 目的の抗原や抗体との結合を検出す ることである。 最近では、 特に酵素ィムノアッセィ （E IA/EL I SA) や蛍 光ィムノアッセィ （F IA) は最もよく使われている。
近年表面プラズモン共鳴現象に基づく方法 （S PRセンサ） が開発されている (ぶんせき、 1997年， ページ 362〜368 )。 この方法は、 ガラス基板上に設けた 金属薄膜の近傍での濃度変化があれば、 それが屈折率に反映し、 反射光強度を減 少させる入射角が変化する、 という現象に基づいている。 実際には、 結合を見よ うとする化合物の一方をデキストランなどを介して金薄膜に固定し、 他の化合物 を含む試料溶液を流し、 入射角の変化を検出する。
また、 生体高分子を弾性体としてとらえ、 微小なフィルムを用いリガンドとの 結合による高次構造の変化に基づく張力の変化から結合を検出する、 メカノケミ カル法も開発されている （Anal.Biochem. 201, ページ 68〜79, 1992年）。 一方、 固相と溶相が直接接している界面において、 溶液中の電解質の固体表面 への吸着等により界面において正負の電荷の分離つまり界面分極がおこり、 界面 電気二重層が生じる。 この界面電気二重層により生じる流動電位またはゼ一夕電 位は、 固体表面の状態を示すため、 高分子膜 ·繊維 ·各種粒子など多くの分野で 種々の目的に応用されている。 この流動電位またはゼ一夕電位は、 生体高分子と リガンドとの結合によっても変化することが知られている （Biosensors 2, ベー ジ 89〜： 100, 1986年）。
蛋白質とリガンドとの相互作用を検出するために、 前述のように多くの方法が 開発されている。 しかし、 現在機能が不明な蛋白質を解明しそれらの結果を実際 の種々の目的に応用していくためには、 一度に多数の蛋白質とそれらへのリガン ドの結合を検出できる技術が求められている。
この場合、 機能未知の蛋白質は勿論、 リガンドが分かっている蛋白質でも、 そ の既知のリガンドを酵素や蛍光化合物により標識する事を必要としない方法が望 ましい。 リガンドの入手が容易でなかったり、 標識化合物を結合させること自体 が困難であったり、 その標識により活性が阻害される場合も多いからである。 こ のような視点から上述の技術を見ると種々の問題点がある。
酵素ィムノアッセィ （E. I AZE L I S A) や蛍光ィムノアッセィ （F I A) 等の標識ィムノアッセィ法は、 既知のリガンドゃ標識化合物が必要であるため、 機能未知の蛋白質には適用できない。
S P Rセンサは既知のリガンドゃ標識化合物を必要としないが、 現時点では比 較的大きな分子間の結合検出が中心であり、 低分子量は最適の条件でも数百ダル トンが限界といわれている。 これは、 機能未知の蛋白質に適用する時には大きな 限界となる。
メカノケミカル法は、 S P Rセンサと同様に既知のリガンドゃ標識化合物を必 要とせず、 かつ低分子量化合物にも適用できる （蛋白質と C aや M gとの結合の 検出が可能という報告がされている） という大きな利点を持つが、 同時に多数の 蛋白質とリガンドの結合を検出するのに適用するためには、 装置が非常に大規模 かつ複雑になる可能性が大きい。
流動電位ゃゼ一夕電位を生体高分子とそれに結合する化合物の検出に応用する 試みは 1 9 7 0年代から行われてきた。 Gladらは、 IgGと Protein Aの結合が 流動電位によって測定出来る事を示している （Biosensors 2， ページ 89〜： L00， 1986年)。 西崎は、 ヒト血清アルブミン （H S A) と抗 H S A抗体の結合をゼ一 タ電位の変ィ匕によって定量している （特開平 6-265551号公報)。 又、 Kochらは、 リゾチ一ムを用いて、 蛋白質の結合と流動電位との関係についての実験的 ·理論 的考察を行っている （Biosensors & Bioelectronics 14, ページ 413〜421， 1999 年)。
このように、 流動電位ゃゼ一夕電位は、 既知のリガンドゃ標識化合物を必要と せず、 カゝっ分子量に関係なく、 生体高分子とリガンドの結合検出に適用できる方 法として研究されてきた。 しかし、 この方法で問題になるのは、 生体高分子の固 定法である。 Glad らは、 生体高分子を、 多孔性物質を詰めたチューブに固定し、 西崎はラテックス粒子に固定し、 Koch らは溶融シリカを詰めたキヤビラリ一に 固定している。 従って、 従来の固定方法では、 一度に多くの生体高分子とリガン ドとの相互作用を検出する事はできない。
一方、 生体高分子から微小なフィルムやスポットをエレクトロスプレイデポジ シヨン法により形成する技術が開示されている （Anal.Chem.,71, ページ 1415 〜1420， 1999年及び Anal. Chem., 71, ページ 3110〜3117, 1999年）。 この方 法により、 例えば、 多数の蛋白質スポットからなる蛋白質マイクロチップを作製 し、 試料を流す時、 流動電位 （又は、 ゼ一タ電位） を測定すれば、 各スポット中 の蛋白質と試料中の化合物の結合を検出する事ができる。 発明の目的
従って、 本発明の目的は、 既知のリガンドゃ標識化合物を必要としないで、 高 分子とそれに特異的に結合する化合物との結合を検出する装置及びその方法を提 供する事である。 また本発明の別の目的は、 既知のリガンドゃ標識化合物を必要 としないで、 一度に多数の生体高分子とそれに特異的に結合する化合物との結合 を検出する装置及びその方法を提供する事である。 発明の開示
本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 生体高分子を固定させた反応場と、 この反応場に連結され、 反応場へ試料を供 給する供給流路と、 前記反応場と連結し、 反応場の少なくとも一部を通過した試 料を回収する回収流路と、 を有する反応系を形成したブロックと、
前記供給流路を介して前記反応場へ試料を供給し、 前記反応場の少なくとも一 部を通過した試料を前記回収流路から回収しながら、 前記の固定された生体高分 子の流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 前記プロックを、 平坦な表面を互いに接合させた第 1及び第 2の基板を以って 構成し、 前記反応場、 供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に形成し、 前記供給流路および回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回収用開口を形 成したことを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 前記生体高分子が、 エレクトロスプレイ 'デポジション法により固定されるこ とを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 前記の固定された生体高分子の供給流路側及び回収流路側に配置された微小な 一対の電極と、
この一対の電極間に発生する流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 前記電極が、 I S F E Tである、
ことを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 ァレイ状に配列し固定させた生体高分子の複数のフィルムまたはスポットと、 前記の各フィルムまたはスポットごとに、 こられのフィルムやスポットの供給 流路側及び回収流路側に配置した複数の一対の電極と、
前記一対の電極の間に発生する流動電位を、 前記の各フィルムまたはスポット ごとに測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、 前記の供給用開口及び回収用開口に配置された一対の圧力検出手段と、 前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、 ゼ一夕電位を求める演算手段と、 を具える、
ことを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法は、 生体高分子を固定させた反応場と、 この反応場に連結され、 反応場へ試料を供 給する供給流路と、 前記反応場と連結し、 反応場の少なくとも一部を通過した試 料を回収する回収流路と、 を有する反応系を形成したブロックを用いて、 前記反応場へ供給流路を介して試料を供給し、 反応場の少なくとも一部を通過 した試料を前記回収流路から回収しながら、 前記の固定された生体高分子の流動 電位を測定する流動電位測定ステツプ、
を含むことを特徴とするものである。
また、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法は、 前記の供給用開口及び回収用開口においてそれぞれ圧力を検出するステツプと、 前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、 ゼ一夕電位を求めるゼ一タ電位 演算ステップと、
を含むことを特徴とするものである。 ―
なお、 上述したように本発明は主に装置の形態として説明したが、 本発明には これら装置に対応するそれぞれの方法が含まれるのはもちろんである。
以下、 本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置、 及び その方法の原理を詳細に説明する。
固相と溶相が直接接している界面において、 溶液中の電解質の固体表面への吸 着等により界面において正負の電荷の分離つまり界面分極がおこり、 界面電気二 重層が生じる。 界面に電気二重層が存在するとき、 各相を相対的に移動させると 電場を誘起する。 この現象は界面動電現象と呼ばれるが内部に多くの毛細管を持 つ多孔性膜や、 毛細管や、 二枚の平板に若干の間隙を持たせたものと溶液の系に おいて顕著である。 固体と液体の接触面では、 両相が相対的に移動するときに固 体面の薄い液相は固相面に固着して固相と共に動く。 この固定された液相と、 運 動する液相との境界面をすベり面という。 すべり面と溶液内部との間の電位差を ゼ一夕 （ ） 電位または界面動電位という。 多孔性膜、 毛細管、 二枚の平板の間 隙を通して任意の圧力差 （Δ Ρ) を加えて電解質溶液を流すと、 膜の両界面間、 毛細管や二枚の平板の両端に電位差が現れ、 この電位を流動電位という。 流動電位 （△£) とゼ一夕電位 （ ） との間には次の関係がある。 ■
ΔΡ ηλ
ここで Δ Ρは溶液を流す時の、 膜の両界面間、 毛細管や二枚の平板の両端間の 圧力差、 εは溶液の誘電率、 ？7は溶液の粘度、 λは溶液の伝導度である。 （1 ) 式から明らかなように、 ε、 7]、 えは溶液固有の値であり文献や別途測定により 知ることができる。 従って を変えながら Δ を測定すると ζを求めることが できる。 ζは膜や毛細管や平板の表面の特徴を表すパラメ一夕と考えることがで きる。
一般的に の測定は、 上述したように膜の両界面間、 毛細管や二枚の平板の 両端で行われる。 しかし膜内細孔や毛細管や二枚の平板において局所圧力差 Δ Ρ {となる中間の二点間で行うと、 二点間における局所電位差 Δ を得る事がで き、 その間における見かけ上の局所ゼ一夕電位 ζ 5を求めることができる。 ここ では ε、 ？7、 λ等の条件を一定に保っておけば求められた流動電位をゼ一夕電位 の代わりに表面評価の尺度として用いることができる。 従つて膜内細孔や毛細管 や二枚の平板の表面上に η個の異なった性質を持つ部分 （局所表面と呼ぶ） が存 在する時、 それぞれの局所表面の両端に η組の電極を配置し η組の流動電位を求 めることができる。 この時 η組の局所表面における電極間に生じる局所圧力差は 全体の圧力差 Δ と電極の位置の計測から得る事ができ、 したがって見かけの局 所ゼータ電位を最終的に計算できる。
生体高分子とリガンドとの結合により、 この流動電位及びゼ一夕電位は変化す るため、 この変化を測定する事により、 既知のリガンドゃ標識化合物を用いるこ となく生体高分子とリガンドとの相互作用を検出することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明による検出装置 1 0の基本構造を示す断面図； 図 2は、 本発明による検出装置を構成する第 1の基板 2 1の模式図； 図 3は、、 本発明による検出装置を構成する第 2の基板 3 4の模式図； 図 4は、 本発明による両面型検出装置 5 0の断面図；
図 5は、 ピン型電極を用いた基板の断面図；
図 6は、 ランド型電極を用いた基板の断面図；
図 7は、 IS-FET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) を用いた電極の模 式図；。
図 8は、 IS-FET型電極を用いた基板の断面図；
図 9は、 多数の生体高分子スポットおよび電極を配置したアレイ型検出器の模 式図；
図 1 0は、 C a C 1 2水溶液 （H E P E S バッファー p H 7 . 5 ) を l m L/分で流した時に得られた電位差と水溶液濃度との関係を示すグラフ；そして 図 1 1は、 生体高分子のスポットを固定化した基板における流動電位と、 スポ ットなしの基板のみの状態での流動電位との差を取ったグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 添付する図面に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
図 1は、 本発明による検出装置 1 0の基本構造を示す断面図である。 この検出 装置 1 0は、 第 1の基板 1 1と第 2の基板 1 4の平坦な表面を接合してその接合 面に流路及び反応場を形成させた反応系を有するブロックから構成される。 第 1 の基板 1 1の表面上には、 生体高分子のスポット 1 2 (フィルム） を固定化し、 このスポット 1 2の上流側と下流側に一対の電極 1 3を配置する。 第 2の基板 1 4には、 接合することにより供給流路 1 5、 回収流路 1 6及び反応場 1 7を形成 する凹部 1 8を設けてある。 この凹部 1 8の両端部には、 流路と外部とを連通す る供給用開口 1 9及び回収用開口 2 0が設けてあり、 それぞれ流入管及び排出管 に連結してある。 また、 試料の液漏れを防止するため、 接合面には 0 リングを、 基板の双方或いは片方には Oリングを収納するリング状の溝を設けてある。 第 1の基板 1 1の大きさは、 約 7 5 X 2 5 mm厚さ 1 mmのアクリル製であり、 流路構造体として機能する第 2の基板 1 4は同じく 7 5 x 2 5 mm厚さ 5 mmで アクリル製である。 図のように、 第 1の基板 1 1の高分子フィルムの前後 （上流 側と下流側） には、 棒状のプラチナ電極 1 3が 2個固定されておりその直径は約 0. 2 mmであり基板面からおよそ 0 . 5 mm突出している。 流路は、 長円形の 0—リングにより密閉されており、 その厚さは 1 mm幅は 5 mm長さが約 3 5 m mとなっている。 液体は、 流入管からペリスタティックポンプなどによって注入 される。 生体高分子スポット 1 2はエレクトロスプレー法により形成されており、 ダルタルアルデヒ .ドによつて架橋処理されている。
測定に際しては、 流入管に加圧しながらリガンドを含有する試料溶液を注入し て測定部位となる反応場へ試料を流した状態で、 一対の電極 1 3間に発生する局 所流動電位を測定する。 このようにして測定した流動電位の値の変化、 或いは生 体高分子なしの基板を用いて測定した基準電位との差に基づき、 局所表面に存在 する物質とリガンドとの間の結合を判断する。
図 1では、 例示として 1個の生体高分子フィルムと一対の電極を設けた単一の 測定部を持つ装置を挙げたが、 この測定部をアレイ状に n個設け （n個のスポッ トと、 一対の電極を各スポットの前後に n個設け)、 一度に複数の種類の生体高 分子とリガンドとの結合による流動電位を測定するような装置を構成することも 可能である。 例えば、 nの範囲は l≤n≤l 0 0 0 0とするのが好適である。 例 えば、 変形例として、 以下のような条件で装置を構成することもできる。
( 1 ) 第 1の基板と第 2の基板の接合面に形成する流路及び反応場の間隔を 5 0 nm以上 1 c m以下とする。
( 2 ) 各基板の面積は l mm 2以上 9 0 0 c m2以下とする。
( 3 ) 基板の材料は金属、 無機、 有機材料であるが導電性を有するものとする。
(4) 電極としては白金、 白金黒、 銀/塩化銀を使用し線状の場合は直径 0. 0 5 mm以上 2 mm以下、 平板の場合は厚みが 0. 05 mm以上 2 mm以下、 横 が 0. 1mm以上 1 cm以下とする。
(5) 使用する電解質溶液は、 NaC 1等の一価の電解質からなる水溶液、 Ca C 12等の二価の電解質からなる水溶液、 その他多価の電解質からなる水溶液で、 濃度は 10— 5mo 1ZLから 5mo 1ZLの間で使用する。
(6) 流路の両端間に加わる圧力差 ΔΡは 0. 01気圧から 1気圧とする。
(7) 微小フィルム又はスポットの大きさは 1 m2以上 1 cm2以下とする。
( 8 ) 電極間 g巨離は 1 m以上 1 c m以下とする。
(9) 電極間の電位差は 1 から 100 OmVのオーダーで測定できる測定手 段を用いる。
(10) 個々の電位差測定部は、 蛋白質や DNAをエレクトロスプレイ法により デポジットした生体高分子の微小フィルムまたはスポットの前方または後方 （供 給流路側と回収流路側） であって、 生体高分子を固定していない部位にフィルム やスポットを挟んで前後するように配置した一対の電極からなり、 試料を流レな がらこれらの電極間の電位差を測定する。 このようにして測定された電位差と、 生体高分子が固定されていない状態での電位差や試料を流し始めたときからの電 位差などとの差を用いて、 生体高分子とリガンドとの結合の検出する。
図 2は、 本発明による検出装置を構成する第 1の基板 21の模式図である。 第 1の基板 21の平坦な表面上には、 生体高分子のスポット 22 (フイ レム） を固 定化し、 このスポット 22の上流側と下流側に一対の電極 23を配置する。 図 3は、 本発明による検出装置を構成する第 2の基板 34の模式図である。 第 2の基板 34には、 接合することにより供給流路 35、 回収流路 36及び反応場 37を形成する凹部 38を設けてある。 この凹部 38の両端部には、 流路と外部 とを連通する供給用開口 39及び回収用開口 40が設けてある。 また、 試料の液 漏れを防止するため、 0リング取付け用溝 41を設けてある。
図 4は、 本発明による両面型検出装置 50の断面図である。 この両面型検出装 置 5 0は、 第 1の基板 5 1と第 2の基板 5 4の平坦な表面を接合してその接合面 に流路及び反応場を形成させた反応系を有するプロックから構成される。 第 1の 基板 5 1の表面上には、 生体高分子のスポット 5 2A (フィルム） を固定化し、 このスポット 5 2Aの上流側と下流側に一対の電極 5 3 Aを配置する。 更に、 第 2の基板 5 4の表面上には、 生体高分子のスポット 5 2 B (フィルム） を固定ィ匕 し、 このスポット 5 2Bの上流側と下流側に一対の電極 5 3 Bを配置する。 この ように、 両面型では上述した片面型に加えて上側の基板にも生体高分子スポット 5 2 Bおよび一対の電極 5 3 Bを設けてあり、 より高感度に流動電位を検出する ことが可能である。
図 5は、 ピン型電極を用いた基板の断面図である。 この例では、 基板 6 1の表 面上に生体高分子のスポット 6 2を固定化し、 その上流側と下流側に基板 6 1を 貫通して反応場に露出するように一対のピン型電極 6 3を設けてある。
図 6は、 ランド型電極を用いた基板の断面図である。 この例では、 基板 7 1の 表面上に生体高分子のスポット 7 2を固定化し、 その上流側と下流側に一対のラ ンド型電極 7 3を設けてある。 このランド型電極 7 3には基板 7 1の下側から上 面に貫通させて配線を結合する。
図 7は、 IS-FET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) を用いた電極の模 式図である。 この例では、 基板 8 1の表面上に生体高分子のスポット 8 2を固定 化し、 その上流側と下流側に一対の IS-FET型電極 8 3を設けてある。
図 8は、 IS-FET型電極を用いた基板の断面図である。 図において、 9 1は基 板、 9 2は酸化膜、 9 3 Aはドレイン、 9 3 Bはソース、 9 4はゲ一ト酸化膜、 9 5は保護膜、 9 6は電極配線である。 図のように ISFET型電極を用いれば、 ゲ一ト酸化膜上面の電位変ィ匕に非常に敏感に反応するために流動電位をより高感 度に検出することが可能となる。
図 9は、 多数の生体高分子スポットおよび電極を配置したアレイ型検出器の模 式図である。 図 9の上図において、 1 0 1は流入口、 1 0 2は分配回路、 1 0 3 は反応場即ち測定部位、 1 0 4は電極配線取り出しコネクター、 1 0 5は回収回 路、 1 0 6は流出口である。 図 9の下図は、 反応場 1 0 3の一部を拡大した図で あり、 図において 1 1 1は微細流路、 1 1 2は生体高分子のスポット、 1 1 3は 電極、 1 1 4は配線である。 図のように、 各々のスポット 1 1 2は、 基本形とほ ぼ同等であるが、 これらの電極配線は基盤裏面のパターンにより一力所に引き出 され、 電気的に高速に検出が可能となっている。 それぞれのスポット 1 1 2には 微細流路 1 1 1により試料 （反応液） が均一かつ連続的に供給されるようになつ ている。 本構成によれば、 多数の異なる生体高分子スポットを基板状に形成する ことで異なる多種類の物質の検出が同時に可能となるシステムの構築も可能とな る。
上述したようにプリント基板の形成技術等を応用することにより、 ランド型な どの異なる構造にすることも可能である。 また、 アレイ状にする場合は裏面ある いは表面を用いて配線を基盤外部に導くことも可能であるし、 また電極直下部に 増幅回路を設けることも可能である。
次に、 本発明による測定装置を用いて実際に生体高分子とリガンドとの結合を 測定した。 5 mmX 5 mmの基板上に αラクトアルブミンをエレクトロスプレ 一法によりデポジットし、 これを用いてブロックを形成し装置を構成させた。 こ の装置に C a C 1 2水溶液 （H E P E S バッファ一 p H 7 . 5 ) を l mL/分 で流した時に得られた電位差と水溶液濃度との関係を図 1 0に示す。 装置は、 図 1で示した基本形の装置を使用している。 またラクトアルブミンをデポジットし ていない基板上にも同様の条件で C a C 1 2水溶液を流しブランクテストを行つ た。 基板は、 アクリルで、 αラクトアルブミンをデポジットするエリアには P t 一 P d合金をスパッタ蒸着によりコ一ティングしている。 図のように、 明らかに スポットを形成した基板とスポットなしの基板との間に差が見られこの方法で流 動電位が測定でき、 各種蛋白質や D N Aのキャラクタリゼーションができること を示している。 ' 図 1 1は、 生体高分子のスポットを固定化した基板における流動電位と、 スポ ットなしの基板のみの状態での流動電位との差を取つたグラフである。
実施態様で挙げた実施例は例示に過ぎず、 本発明の範囲には、 幾多の変形、 変 更例が含まれることに留意されたい。 例えば、 実施例では挙げていないが、 流動 電位測定用の電極の他に、 圧力計を上流側と下流側に設け、 圧力差を求めること により、 さらに CPUなどの演算装置を用いて、 測定した流動電位からゼ一タ電 位を演算し、 これに基づき生体高分子とリガンドとの結合を測定することは、 当 業者には容易である。 産業上の利用可能性
本発明の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法によれ ば、 例えば、 既知のリガンドゃ標識化合物を必要としないで、 種々の高分子とそ れに特異的に結合する化合物との結合、 即ち相互作用を簡易かつ簡便に検出する ことが可能となる。 本発明による装置や方法は、 臨床診断分析や環境分析など 様々な分野への応用が期待される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生体高分子を固定させた反応場と、 この反応場に連結され、 反応場へ試料 を供給する供給流路と、 前記反応場と連結し、 反応場の少なくとも一部を通 過した試料を回収する回収流路と、 を有する反応系を形成したブロックと、 . 前記供給流路を介して前記反応場へ試料を供給し、 前記反応場の少なくと も一部を通過した試料を前記回収流路から回収しながら、 前記の固定された 生体高分子の流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とする生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装
2 . 請求項 1に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、
前記プロックを、 平坦な表面を互いに接合させた第 1及び第 2の基板を以 つて構成し、 前記反応場、 供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に 形成し、 前記供給流路ぉよび回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回 収用開口を形成したことを特徴とする装置。
3 . 請求項 1に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、
前記生体高分子が、 エレクトロスプレイ ·デポジション法により固定され ることを特徴とする装置。
4. 請求項 2に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、
前記生体高分子が、 エレクトロスプレイ ·デポジション法により固定され ることを特徴とする装置。
5 . 請求項 1に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、 前記の固定された生体高分子の供給流路側及び回収流路側に配置された微 小な一対の電極と、
この一対の電極間に発生する流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とする装置。 '
6. 請求項 5に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、
前記電極が、 I S F E Tである、
ことを特徴とする装置。
7 . 請求項 1に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、
アレイ状に配列し固定させた生体高分子の複数のフィルムまたはスポット と、
前記の各フィルムまたはスポットごとに、 こられのフィルムやスポットの 供給流路側及び回収流路側に配置した複数の一対の電極と、
前記一対の電極の間に発生する流動電位を、 前記の各フィルムまたはスポ ットごとに測定する手段と、
を具えることを特徴とする装置。
8. 請求項 1に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置にお いて、
前記の供給用開口及び回収用開口に配置された一対の圧力検出手段と、 前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、 ゼ一夕電位を求める演算手 段と、
を具える、 ことを特徴とする装置。
9. 生体高分子を固定させた反応場と、 この反応場に連結され、 反応場へ試料 を供給する供給流路と、 前記反応場と連結し、 反応場の少なくとも一部を通 過した試料を回収する回収流路と、 を有する反応系を形成したブロックを用 いて、
前記反応場へ供給流路を介して試料を供給し、 反応場の少なくとも一部を 通過した試料を前記回収流路から回収しながら、 前記の固定された生体高分 子の流動電位を測定する流動電位測定ステツプ、
を含むことを特徴とする生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法
- 0 . 請求項 9に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法に おいて、
前記の供給用開口及び回収用開口においてそれぞれ圧力を検出するステツ プと、
前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、 ゼ一夕電位を求めるゼ一夕 を含むことを特徴とする方法。
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