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WO2000071732A2 - Nukleotidsequenz zur erhöhung der abwehrreaktion einer pflanze gegen pathogenbefall - Google Patents

Nukleotidsequenz zur erhöhung der abwehrreaktion einer pflanze gegen pathogenbefall Download PDF

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WO2000071732A2
WO2000071732A2 PCT/DE2000/001589 DE0001589W WO0071732A2 WO 2000071732 A2 WO2000071732 A2 WO 2000071732A2 DE 0001589 W DE0001589 W DE 0001589W WO 0071732 A2 WO0071732 A2 WO 0071732A2
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promoter
nucleotide sequence
plant
leaves
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KWS SAAT SE and Co KGaA
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    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance

Definitions

  • the present invention relates to a nucleotide sequence for increasing the defense reaction of a plant against pathogen attack and gene constructs with such
  • the invention further relates to a method for increasing the defense reaction of a plant against pathogen attack and transgenic plants and seeds of these plants.
  • Mushrooms are often found, which are chlorophyll-free, heterotrophic thallophytes. Your thalli are often filamentous and usually surrounded by a cell wall.
  • Promoters can have a constitutive, an organ-, tissue- or cell-specific or an inducible activity in plants. Constitutive promoters are able to express an associated coding region in all tissues during the normal development of a plant. The level of expression need not be the same for all tissues and all cell types. Constitutive promoters can be of plant, bacterial or viral origin.
  • ocs ocs
  • nos nopaline synthase
  • Isolated from Agrobacterium tumefaciens have meanwhile been widely used
  • Organ, tissue or cell specific promoters can be used for the expression of genes in specific parts of plants.
  • specificity can mean that a promoter is mainly or exclusively active in an organ, tissue or cell type.
  • Mainly active in a certain organ e.g. the tomato promoters TFM7 and TFM9 in tomato fruits (US 5,608,150), a rapeseed promoter in roots (WO 94/02619), a sunflower promoter in seeds (WO 98/45460) and a potato promoter (WO 98/18940) in leaves.
  • These promoters show their highest activity in the organs mentioned.
  • An exclusive, exclusive activity for a specific compartment was for a lock cell-specific promoter from the potato (DE 42 07358 A1), for the tapetum-specific
  • TA29 promoter from tobacco (EP 0344 029 B1) and for the pistil and pollen-specific SLG promoter from Brassica (Dzelzklalns et al., 1993).
  • Inducible promoters are regulatory elements whose activity is regulated by endogenous or exogenous stimuli. Endogenous stimuli can be developmental
  • Exogenous stimuli that act on a plant and that can activate a promoter are light, abiotic and biotic stress.
  • Abiotic stress factors include drought, Cold, heat and high salt concentrations in the ground or mechanical damage to parts of plants.
  • Biotic stress situations in plants are caused by pathogen infestation.
  • an organ-specific promoter which is active in the storage root tissue of the sugar beet (WO 97/32027).
  • a pathogen-active promoter is also described in WO 92/17591.
  • the object of the present invention is to provide a further nucleic acid sequence with the aid of which an improved pathogen defense of a plant is possible.
  • This nucleic acid sequence is said to act in particular against fungal pathogens and to protect plants with an age-related susceptibility to fungi.
  • a promoter is to be understood as a DNA sequence which controls the expression of a gene under its control depending on endogenous and exogenous factors. These factors include, for example, inducers, repressors and similar DNA-binding proteins, as well as environmental influences.
  • a promoter can consist of several elements. However, it comprises at least one regulatory element that is responsible for the transcription of the gene under its control.
  • nucleotide sequence Derivatives of a nucleotide sequence are shortened versions of this sequence with the same, modified or singular properties as the starting sequence.
  • Elicitors are substances that are partly originate from the pathogen, partly they are released from the plant cell wall by pathogens. Mushroom elicitors are neutral, branched glucans on the one hand, and glycoproteids on the other. Cell wall elicitors may be fragments of pectin substances. Elicitors can trigger gene expression within 20 minutes at the transcription level, as was shown using the example of the synthesis of PAL-specific mRNA in parsley cell cultures.
  • Pathogen inducibility means the action of external factors on a plant, which results in a defense reaction of the same. These can be attacks by insects (food), bacteria, fungi or other pathogens, but also abiotic effects such as mechanical wounds (e.g. from hailstorms).
  • the pathogen inducibility of the promoter described here means the increased transcription of the gene which is under the control of the promoter when the pathogenic inducer is present and which is consequently expressed in an active defense reaction of the infected plant.
  • Direct antifungal activity means that gene products have an immediate antifungal effect, e.g. Dissolve cell walls or code for phytoalexin synthases or for metabolites that inhibit fungal metabolism.
  • Indirect antifungal activity means that gene products activate plant gene defense.
  • genes include, for example, resistance genes, components of the Signal transduction (such as kinases, phosphatases), transcription factors or enzymes which produce signal substances (such as ethylene-forming, salicylic acid-forming or jasmonate-forming enzymes, reactive oxygen species-forming enzymes, nitrogen monoxide-forming enzymes).
  • Age dependency or developmental dependence means the different intensity of the promoter activation and thus the expression of the gene controlled by the promoter depending on the plant age.
  • Infection is the earliest point in time at which the metabolism of the fungus (or the growth of the fungus) is prepared for penetration of the host tissue. These include e.g. the outgrowth of hyphae or the formation of specific infection structures such as penetration hyphae and appressories.
  • Inoculation is to be understood as the physical coincidence of the pathogen and the host.
  • the nucleotide sequence according to the invention contains at least two different cis elements, selected from the following group a) L-box or L-box-like sequence with the hexanucleotide sequence CCTAc / aC b) GCC box with the core sequence GCCGCC c) W- Box with the hexanucleotide sequence TTGACC and has the property of a promoter.
  • L-box means a 12 bp sequence t / aCTc / aACCTAc / aCc / a (Lois et al., 1989; since Costa e Suva et al., 1993) where ta or c / a means that a T or A or C or A can be present at this point in the sequence.
  • a L-box-like sequence is understood to be a sequence which contains the hexanucleotide core sequence CCTAc / aC and which corresponds to the L-box in at least one further nucleotide.
  • the L-box or L-box-like sequences are in the promoters of the phenylalanine ammonium lyase (pal) genes from parsley, bean and Arabidopsis thaliana and some other genes of the phenylpropane pathway (Lois et al., 1989; Ohl et al., 1990).
  • the L-Box was identified by the "in vivo DNA footprinting" technique as a site of UV light and elicitor-inducible DNA / protein
  • the core sequence CCTAc / aC is the sequence region where the greatest hypomethylation occurs (Lois et al., 1989).
  • the appearance of box L and box P "footprint" coincide with the beginning of the transcription of the pal gene after UV or elicitor stimulation (da Costa e Silva et al., 1993).
  • a GCC box is understood to be an 11 bp TAAGAGCCGCC sequence (Ohme-Takagi and Shinshi, 1995).
  • a GCC box is also understood to mean a nucleotide sequence which only contains the core motif GCCGCC of the GCC box.
  • the GCC box mediates the activation of promoters by the signal substance ethylene and has been described for the promoters of some pathogen defense genes (Ohme-Takagi and Shinshi,
  • W-box is understood to mean a hexanucleotide sequence TTGACC. W boxes have also been described in the promoters of other pathogen defense genes (Rushton and Somssich, 1998). The importance of this cis element for the pathogen inducibility of the promoters has been demonstrated for the maize gene PRms (Raventos et al., 1995) and the parsley genes PR1-1 and PR1-2 (Rushton et al., 1996).
  • the present invention is based on the finding that nucleotide sequences which are effective for the defense against pathogens can be obtained if at least two of the cis elements mentioned above are combined. Further combinations of cis elements are described in subclaims 2 to 5.
  • the nucleotide sequence contains a further cis element which is responsible for induction of the defense reaction by salicylic acid. It is a fragment that is a SAR (Salicylic acid response element) element.
  • SAR Salicylic acid response element
  • the SAR element is preferably in a reverse complementary orientation in the immediate vicinity of a W box.
  • a SAR element with the sequence TTCGACCTCC was identified as the core sequence of a 76 bp DNA fragment of the PR2-d gene from tobacco (Shah and Klessig, 1996). The 76 bp fragment with the SAR element is responsible for the salicylic acid inducibility of the PR2-d gene. SAR elements in the sense of this application are TTCGACCTCC sequences including corresponding consensus sequences.
  • the sequence TTCGACCTCG is also a SAR element. This is preferably in the reverse, complementary orientation to the transcription start at position 4176-4167 and thus only 2 bp next to the third W box.
  • a close coupling of the 10 bp SAR element to a W box is preferred.
  • the close coupling may be responsible for an increased salicylic acid inducibility of the promoter.
  • the presence of three L-box-like sequences and the presence of two W-boxes in normal and reverse complementary form appear to be particularly advantageous for the pathogen inducibility of a nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID No.1) according to FIG. 1 represents a solution to the problem set forth at the beginning. This sequence and sequences derived therefrom are suitable promoters with good pathogen inducibility. Derived
  • Sequences are, among other things, homologous sequences with a homology of at least 50%, the homology being essentially due to matches in the area of the cis elements.
  • the term "homology” here means homology at the DNA level, which is determined according to known methods, for example computer-aided sequence comparisons (SF Altschul et al (1990), Basic Local Alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410) can be.
  • derivatives of a nucleotide sequence according to FIG. 1 are produced.
  • a polymerase chain reaction takes place with one of the following primer pairs a) P0 / P4480 b) P0 / P4047 c) P0 / P3017 d) P0 / P2661 e) P0 / P2339 f) P0 / P1889 g) PO / P 1777 h) PO / P 1777 * i) P0 / P814 j) P0 / P368, where
  • P368 binds with the sequence TAT AAT TCA TGT TGA CGT GTT AGT CCT TCC or a sequence derived therefrom.
  • secretion of expressed proteins in apoplasts can also be achieved by transcriptionally fusing the nucleotide sequence with the signal sequence of the apoplastic invertase inhibitor from tobacco.
  • nucleotide sequences according to this invention can also be used with a nucleotide
  • Sequence at the 3 'area can be expanded translationally.
  • a translational fusion can preferably be carried out with the aid of a nucleotide sequence from the sequence according to FIG. 5.
  • transgenic plants can be produced.
  • Pathogen resistance can be influenced by introducing the nucleotide sequences into the plants to be modified. No pleiotropic gene effects are expected. This means that the performance of the breeding material remains unaffected. The resulting transgenic plants show an increased resistance to pathogens, especially to fungal pathogens.
  • Plasmodiophoromycetes Oomycetes, Ascomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be used in particular to produce gene constructs in which the gene is a pathogen defense gene.
  • the gene is advantageously a resistance gene or an avirulence gene.
  • the gene exhibits direct or indirect antifungal activity.
  • a promoter from pAnjasek provided with a signal sequence can be fused with the T4 lysozyme gene, the construct can be transformed into plants which then have an increased pathogen defense reaction, especially against fungal pathogens.
  • the new nucleodide sequences are furthermore distinguished by the fact that they are rapidly localized in various organs and tissues of transgenic plants, such as leaves, shoots and / or roots, after pathogen attack or wounding Expression of the gene under your control. This property makes these sequences an ideal regulatory element for the controlled expression of antifungal compounds and thus for the development of fungus-resistant plants. Corresponding advantages also result in the derivatives derived from the nucleotide sequences in the form described above.
  • nucleotide sequences according to the invention are also constitutively active in side roots, the tap root and the petioles of sugar beet.
  • these sequences regardless of the "sink” or “source” character of the leaves, show an age-dependent, in particular increasingly age-dependent
  • the new nucleotide sequences are also distinguished by the fact that they allow increasing expression of the gene under their control in leaves of transgenic plants with increasing plant age. This is an excellent way of combating fungal diseases in plants that, like sugar beet, are susceptible to aging with the pathogen Cercospora beticola.
  • a promoter shown in the present application offers the solution that it can be activated at the time of the highest infection pressure (July / August).
  • the cultivation of late-ripening varieties with transgenic pathogen resistance can be made possible in these infestation situations.
  • the enzyme polygalacturonase can be used as the elizitor for the elicitor inducibility
  • the induction of the defense reaction against fungal pathogens can be demonstrated from the first day after inoculation by the nucleotide sequences according to the invention. This surprising property is particularly relevant for the early phase of infection, since infection by Cercospora beticola does not begin until four days after the inoculation.
  • the new promoter shows a low but steadily increasing activity in both "sink” and “source” leaves during the first 12 weeks of plant development, but this is not yet greater than the activity in the other organs (Petiole, taproot, side root). After 12 weeks there is an increase in promoter activity in non-infected "sink” and “source” leaves, which far exceeds the promoter activity in the other organs. This indicates an increased age activity of the promoter described here in leaves.
  • the promoter is used both in beet leaves by leaf fungi, e.g. Cercospora beticola as well as in beet roots due to root-borne pathogens such as Rhizoctonia solani activated.
  • a gene construct which consists of a gene and a promoter, the gene being under the control of the promoter.
  • the gene is characterized by the fact that it has direct or indirect antifungal activity.
  • the increase in the defense response can be triggered by biotic and / or abiotic factors.
  • Salicylic acid is particularly suitable as an abiotic factor.
  • Biofic factor can be a plant pathogen, in particular a fungal pathogen.
  • Fungal pathogens preferably originate from a fungus which is selected from the group comprising Plasmodiophoromycetes, Oomycetres, Ascomycetes, Chytridio-mycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.
  • Sequence according to the present invention contain to regenerate parts of plants and whole plants. For example, methods for this are described by Fennell et al., Plant Cell Rep. 11 (1992), 567-570; Stoeger et al. Plant Cell Rep. 14: 273-278 (1995); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89: 525-533 (1994).
  • Plants to which increased resistance can be imparted on the basis of the present invention include practically all plants.
  • cultivated plants can be grown which are resistant to fungal pathogens.
  • Such resistant crop plants are far superior to their non-resistant relatives because they cannot be infected by fungal pathogens and are therefore less susceptible to disease.
  • resistant crop plants have the same high quality and performance as other non-resistant crop plants. This is due to the fact that with the transfer of a nucleotide sequence according to the present According to the invention, no DNA sequences are transmitted which may code for undesired properties.
  • Suitable plants for the purposes of this invention are plants providing food and raw materials, e.g. Plants that supply carbohydrates (especially wheat, corn,
  • the plant is selected from beet, rape, potato, corn, soybean, cotton, wheat, rice, rye, barley and sunflowers.
  • this selection is not restrictive.
  • the invention also relates to transgenic plants which result from the plants modified according to the invention by somatic hybridization or crossing.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • the nucleotide sequence is shown in 5 " -3 ' orientation.
  • FIG. 2 shows the plasmid pAnja with the 5,947 kb genomic DNA fragment from sugar beet (Beta vulgaris), which was subcloned from pBluescriptII KS + (Stratagene) via Hlllll and the blunted SamHI restriction site.
  • sugar beet Beta vulgaris
  • pBluescriptII KS + Stratagene
  • Hlllll the blunted SamHI restriction site.
  • some cut other restriction enzymes of the polylinker also in the cloned fragment.
  • Figure 3 shows the distribution of cis elements in the promoter.
  • the arrowheads show the orientation of the cis-elements, based on the transcription start at 0.
  • a TATA box is located at nucleotide position 5912-5915 and a CAAT box is located at nucleotide position 5903-5906.
  • a W-Box follows at position 4179-4184. There are two more W boxes
  • a GCC box is duplicated in a reverse complementary orientation to the TATA box at positions 3598-3593 and at positions 3081-3076.
  • An L-box-like sequence is repeated in triplicate at positions 2331-2342, 2117-2228 and 1916-1927. All three L-Box-like sequences are in the same orientation with respect to the TATA box.
  • FIG. 4 shows promoter deletions starting from the vector pAG5947.
  • the plasmids listed result from a transcriptional combination of the promoter with a cast Gene (pAG4480, pAG4047, pAG3017, pAG2661, pAG2339, pAG1899, pAG1777, pAG1777 *, pAG814 and pAG368) or from restriction digestion (pAG3667, pAG1074, pAG516).
  • Figure 5 shows the nucleotide and deduced amino acid sequence of a synthetic DNA fragment.
  • the 95 bp DNA fragment carries the underlined recognition site for the restriction endonuclease Spei (ACTAGT) at the 5 'end and the underlined recognition sites for the restriction endonucleases Psfl (CTGCAG) and ⁇ / of und (GCGGCCGC) at the 3' end.
  • nucleotide sequence is identical to the first 22 nucleotides of the untranslated 5 ' region and the first 27 nucleotides of the coding region of a ⁇ -1,3 glucanase cDNA clone from the sugar beet (Gottschalk and Mikkelsen, 1998).
  • FIG. 6 shows the 8,946 bp vector pAnja-trans.
  • a translatable region is inserted into the vector by introducing a synthetic DNA fragment (see FIG. 5) behind the transcription start point of the promoter.
  • the translatable region codes from nucleotide position 51-95 for the N-terminus of a protein.
  • a fusion protein can be located between the 1st-12th Amino acid of a synthetic DNA fragment and any gene to be expressed can be created.
  • FIG. 7 shows the 19.86 kb binary plant transformation vector pAG 5.947-trans.
  • the selection marker npfl1 and a reporter gene cassette from the promoter and the gus gene lie within the T-DNA to be transmitted from Agrobacterium tutnefaciens (delimited by the right (RB) and left (LB) border regions).
  • RB right
  • LB left
  • FIG. 8 shows the nucleotide and amino acid sequence of the signal sequence of the invertase inhibitor gene (nt-inh1) from tobacco after amplification by the primers Sek1 and Sek2.
  • the 5 ' region of the cDNA clone of the nt-inh1 gene corresponds to that Nucleotide sequence from 11-106.
  • the primers Sek1 and Sek2 used for the PCR amplification correspond to the nucleotide sequences from position 1-35 and the complementary sequence from 93-131, respectively.
  • nucleotide sequences additionally synthesized by the PCR reaction on the 5 'and 3' region of the cDNA clone with the recognition sites for the restriction enzymes Spei (A / CTAGT), Nael (GCC / GGC) and Notl
  • Figure 9 shows the 8,977 bp vector pAnja-sek.
  • This 5 'area comprises the first 49 bp of the transcribing, non-translated area and the first 57 bp of the encoded area.
  • FIG. 10 shows the histochemical detection of the local promoter activation. 20 .mu.l of Rhizopus Elizitor were pipetted locally onto leaves of the rapeseed transformant AG-5947-t49. After an incubation period of 16 h at 24 ° C., the GUS activity can be detected histochemically. The blue color of the fabric indicates the areas in which high CIS
  • FIG. 11 shows the development-dependent promoter activity in an RNA blot.
  • 10 ⁇ g total cell RNA per organ lateral root, main root, petiole, "sink” leaf, “source” leaf
  • time 4, 6, 10, 12, 16 and 22 weeks after sowing
  • FIG. 12 shows the activation of the promoter in sugar beets after infection with Cercospora beticola under greenhouse conditions.
  • Sugar beets of the tolerant genotype 1 K0088 and the susceptible genotype 3S0057 were used.
  • the activity of the promoter was determined by RNA blot analysis. The damage to the examined flowers due to fungal attack is shown symbolically in the figure: - equally healthy control, + equally weakly infected, ++ equally severely infected.
  • FIG. 13 shows the result of the RNA blot analysis for measuring the transcript formation in sugar beet of genotype 1 K0088 after infection with the root pathogen Rhizoctonia solani. The fungal infection took place in a phyto cell, samples for isolating the total cell RNA were taken 14, 20 and 45 days after inoculation.
  • the nucleotide sequence of the 5947 bp promoter fragment is shown in FIG. 1.
  • the promoter fragment is subcloned in the vector pAnja (FIG. 2).
  • the vector pAnja is derived from the plasmid pBluescript II KS + (Stratagene).
  • Promoter sequence is characterized by several cis elements (FIG. 3), the presence and repetition of which influence the function of the promoter.
  • the L-box-like sequence with the hexanucleotide sequence CCTAAC is in three repeats at positions 2331-2342, 2117-2228 and 1916-1927.
  • the L-box-like sequences all have the same orientation with respect to the start of transcription and are within a sequence range of 420 bp.
  • Another cis element with the nucleotide sequence GCCGCC, the 'ethylene-responsive' or GCC box, is present in duplicate in a reverse, complementary orientation to the TATA box at position 3598-3593 and position 3081-3076.
  • GCC-Box mediates the activation of promoters by the signal substance ethylene and has been described for the promoters of some pathogen defense genes (Ohme-Takagi and Shinshi, 1995).
  • a W-Box with the sequence TTGACC is available in triplicate.
  • a third W-Box (4179-4184) is in close proximity to another, fourth cis element, the SAR element.
  • the promoter contains the basic nucleotide motifs that each promoter needs for the binding of the basal transcription factors. These motifs include a CAAT box at nucleotide position 5903-5906 and a TATA box at nucleotide position 5912-5915.
  • oligo nucleotide primers were used in each case to generate the promoter deletion fragments by PCR (Table 1).
  • the primer PO with the sequence ACT GAC CAC CCG GGG TGG ATT TAT TG was used.
  • the primer PO binds from nucleotide position 5941-5947 of the promoter and the adjacent sequence areas of the multiple cloning site of the vector pBluescriptII KS +.
  • the oligonucleotides P4480, P4047, P3017, P2661, P2339, P1889, P1777, P1777 *, P814 and P368 were used as second primers, which bind to defined sites within the promoter sequence.
  • TCC CCA AA binds from position 1464-1489.
  • the primer P4047 with the sequence TCC AAT TGT CGA CAA TAA AAT TC binds from position 1894-1921.
  • the primer P3017 with the sequence TAT AAC AAG AAG TCG ACA GGA GAA CAT ATT binds from position 2920-2949.
  • the primer P2661 with the sequence GTG AAG TCG ACT GAC AAT TTT GGC AGT CAT C binds from position 3282-3311.
  • the primer P2339 with the sequence TTA TTG AAG GTC GAC CAC TGT TTT GCA ACC binds from position 3600-3629.
  • the primer P1889 with the sequence AAT ATG TTG ACC TAT GGA AAA TAA TC binds from position 4054-4079.
  • TTG ACC GTT AAT TAC or GTT CGA GGT CGA CCT TAG ACT GTT AAT TAC bind from position 4164-4193.
  • the primer P814 with the sequence AGT CAG AGG CGT CGA CAA TAG TGT GC binds from position 5124-5194 and the primer P368 with the sequence TAT AAT TCA TGT CGA CGT GTT AGT CCT TCC binds from position 5570-5599.
  • the PCR conditions are for the primer pairs P0 / P368, P0 / P812, P0 / P1777 and PO / 1777 * when using 1 ng of the plasmid pAnja, a primer concentration of 0.2 ⁇ M, 1.5 ⁇ Taq polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg ) and 25 ⁇ l reaction volume in a multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) as follows:
  • Step 4 2 min 72 ° C
  • the PCR conditions are when using 10 ng of the plasmid pAnja, a primer concentration of 0.2 ⁇ M, 1.0 u Advantage KlenTaq -Polymerase mix (Clontech Laboratories, Heidelberg) and 25 ⁇ l reaction volume in a multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) as follows:
  • Step 3 30 sec 57 ° C
  • Step 4 4 min 72 ° C 1 x step 5: 5 min 72 ° C
  • the P0 / P4480 fragment is cloned as a Smal-Sa / I fragment into the vector pBluescriptII KS + cut with Smal and Sa / I.
  • the resulting plasmid is called pA4480 due to the size of the promoter fragment (Table 1).
  • the PCR products P0 / P4047, P0 / P3017, P0 / P2661, P0 / P2339, P0 / P1889, P0 / P1777, P0 / P1777 * , P0 / P814, P0 / P368 are cut with Smal and Sa / I accordingly.
  • the resulting plasmids are called pA4047, pA3017, pA2661, pA2339 and pA1889, pA1777, pA1777 * , pA814 and pA368 due to the size of the promoter (Table 1).
  • the 5947 bp promoter region is used as a transcriptional fusion with the gus gene in the plant transformation vector pBI101
  • pAG5947 (Fig. 4).
  • the vector pAnja is first linearized with the restriction enzyme Spei (Boehringer Mannhein) and the resulting DNA ends are filled in by a Klenow treatment. Subsequent Sa / I treatment releases the 5947 bp promoter fragment and inserts it into the vector pBI101 previously treated with Sa / I and Smal.
  • the deleted promoter fragments from pA4480, pA4047, pA3017, pA2661, pA2339 and pA1889, pA1777, pA1777 *, pA814 and pA368 are inserted into the plant transformation vector pBI101 cloned.
  • the resulting plasmids are called pAG4480, pAG4047, pAG3017, pAG2661, pAG2339, pAG1889, pAG1777, pAG1777 *, pAG814 and pAG368.
  • the vector pAG was cut on the one hand with the restriction enzyme Sa / I and partially with EcoRI, with the enzymes Sa / I and Xho ⁇ and on the other hand with the enzymes Sa / I and Xbal.
  • the restriction region was used to remove the promoter region shortened to the sequence of nucleotide 2280-5947, position 4874-5947 and position 5432-5947. After the interfaces had been filled in by a Klenow treatment, the vectors could be religated and transformed into E. coli.
  • the remaining promoter portion is 3667 bp after the Sa / l / EcoRI treatment, 1074 bp after the Sal ⁇ lXho ⁇ treatment and 516 bp after the Sal ⁇ IXba ⁇ treatment.
  • the resulting vectors are called pAG3667, pAG1074 and pAG516 (Fig. 4).
  • a synthetic DNA fragment (FIG. 5) is cloned into the vector pAnja.
  • the 95 bp sequence carries the recognition site for the restriction endiuclease Spei at the 5 ' end and the recognition sites for the at the 3 ' end
  • Enzymes Psfl and ⁇ / of ⁇ The nucleotide sequence codes from nucleotide position 51-95 for the 5 'end of a protein.
  • the fragment from FIG. 5 is cloned into the vector pAnja via the Spei and Not ⁇ interface.
  • the resulting vector is called pAnja-trans (Fig. 6).
  • the vector pAnja-trans is linearized with the restriction enzyme Psfl and the protruding 3 ' DNA ends are blunt-ended by T4 polymerase treatment.
  • the vector treated in this way is cut again with the restriction enzyme Sa / I and the 6014 bp DNA fragment is isolated.
  • the promoter fragment is cloned into the plant transformation vector pBI101, which was previously cut with the restriction enzymes Sa / I and Smal. This cloning causes the GUS enzyme to undergo an N-terminal extension of 12 amino acids. While the first 8 amino acids originate from the N-terminus of the synthetic fragment, amino acids 9-12 are encoded by the polycloning site of the vector pBI101.
  • the vector constructed in this way is called pAG5947-trans (FIG. 7).
  • Corresponding translational fusions can also be produced with the vectors pA4480, pA4047, pA3017, pA2661, pA2339 and pA1889, pA1777, pA1777 *, pA814 and pA368, which after integration into the
  • Plant transformation vector pB1101 has the designations pAG4480-trans, pAG4047-trans, pAG3017-trans, pAG2661-trans, pAG2339-trans, pAG1889-trans, pAG1777-trans, pAG1777 * -trans, pAG814-trans and pAG368-trans.
  • the 5947 bp promoter is fused transcriptionally with the signal sequence of the apoplastic invertase inhibitor from tobacco (Greiner et al., 1998).
  • the 106 bp 5 " area of the tobacco inhibitor (Nt-inh1) is used with the help of the primer Sek1 (AGT CAC TAG TAG AAA ATC TAA CTT TGG TCT CT) and the primer Sek2 (CAG TGC GGC CGC GCC GGC GTT TGT TTG TAA TAT AGT CA) amplified by PCR from the plasmid pGreiner.
  • the primers Sek1 and Sek2 bind to positions 1-25 and 83-106 of the 5 ' region to be amplified.
  • the entire nucleotide sequence of the amplified 131 bp fragment is shown in FIG the amplified 5 shown..
  • '- region comprises the 49 bp untranslated 5' region of the cDNA clone and the first 57 bp of the coding region by the primer sequence Sek1 is to the 5 '-
  • an additional recognition site for the restriction endonuclease Spei ACTAGT
  • a recognition site for the enzymes ⁇ / ael GCCGGC
  • ⁇ / ofl GCGGCCGC
  • PCR conditions when using 1 ng of the plasmid pGreiner, a primer concentration of 0.2 ⁇ M, 1.5 u Taq polymerase (Pharmacia) and 25 ⁇ l reaction volume in a multicycler PTC-200 (MJ RESEARCH, WATERTOWN, USA Research) are as follows:
  • Step 3 30 sec 57 ° C
  • Step 4 2 min 72 ° C
  • the location of the interface of ⁇ / ael was chosen so that the GCC triplet is identical to the triplet of the last amino acid of the signal sequence.
  • the constructs intended for the production of transgenic plants are first converted into the Agrobacterium tumefaciens strain C58 ATHV by a direct DNA transformation process (An, 1987).
  • the selection of recombinant A. tumefaciens Cloning is done using the antibiotic kanamycin (50mg / l).
  • the transformation is described below as an example for the vector pAG5947-trans.
  • the reporter gene cassette consisting of the translational fusion between the promoter and the gus gene and the nos terminator is created with the help of A. tumefaciens according to Horsch et al. (1985) transformed into the summer rape genotype Drakkar.
  • Plants are selected using the antibiotic kanamycin.
  • the presence of the promoter in the transgenic plants can be checked by PCR.
  • the use of the primers AGATTTTCTTCGTATAGCAGCCAC and GTACCATGATATGCATCATTCTCTT leads to the amplification of a 269 bp DNA fragment from the promoter in accordance with the nucleotide position 193-461 of
  • PCR is carried out using 10 ng genomic DNA, a primer concentration of 0.2 ⁇ M at an annealing temperature of 57 ° C. in a multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA).
  • PTC-200 MJ Research, Watertown, USA.
  • the binary vector pAG5947-trans was used to create three independent rapeseed transformants, which are called AG5947-t38, AG5947-t48 and
  • Leaves are taken from the transformants AG5947-t48 and AG5947-t49 as well as the non-transgenic starting line Drakkar and for the elicitor induction in 120 mm petri dishes in 50 ml induction medium (LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 6.1, 1 ⁇ / ml rhizopus Pectinase EC 3.2.1.15 from Sigma Chemical CO.) Or in control medium (LS medium without sucrose (Linsmaier and Skoog, 1965), 5 mM MES pH 6.1) for 16 h at 24 ° C. Rhizopus pectinase releases pectolytic breakdown products from the plant cell walls, which in turn have an elitizing effect. The activity of the promoter is determined by a quantitative determination of the
  • Glucuronidase GUS activity determined using the substrate 4-methyl-umbelliferyl-glucuronide (MUG) according to Jefferson (1987).
  • the non-transgenic starting line Drakkar shows, as shown in Table 2, a specific glucuronidase activity of 6.68 and 6.61 pmol Mu x min " 1 x mg " 1 in the non-elitized and in the elitized state. The elicitation leads to none in the non-transgenic line significant change in glucuronidase activity.
  • the transgenic lines AG5947-t48 and AG5947-t49 show a specific enzyme activity of 14.0 and 138.7 pmoles of Mu x min-1 x mg-1, respectively, and after elicitation a glucuronidase activity of 247.6 and 1507.9, respectively pmol Mu x min-1 x mg-1.
  • the glucuronidase activity of the transgenic lines is significantly higher than in the non-transgenic line even in the non-elicited state. Under the action of elicitation, there is a 17.6 or 16.9-fold increase in glucuronidase activity and thus an induction of the reporter gene.
  • the sugar beet promoter thus shows an elicitor and thus pathogen inducibility in the leaves of transgenic rape plants.
  • shoot segments and roots were included in the investigations.
  • F2 plants of the transformant AG5947-t49 were grown under greenhouse conditions. Separated leaves and shoots, which were cut into 5 cm sections and cleaned roots, were incubated as described for leaves for 16 h in pectinase-containing induction medium or in control medium.
  • whole leaves, shoot sections and cleaned roots were frozen in liquid nitrogen immediately after the sampling.
  • separating the leaves from the plant increases the reporter gene activity in the leaves by 5.3 times compared to the control batch and additionally by 72 times by means of elicitation.
  • the separation and cutting of the shoot axis leads to an increase in the GUS activity by 8.3 times and by the additional elicitation by 3.5 times.
  • a 7.2-fold induction of the reporter gene activity was observed by the removal of the root and an additional 9-fold elizitor induction by the elicitation.
  • the promoter is activated in transgenic plants in leaves, the shoot and the roots by wounding and additionally by elicitation. Induction of the promoter in leaves of transgenic rape plants by salicylic acid and PMG elicitor
  • leaf rondelles with a diameter of 14 mm are punched out of the leaves of greenhouse plants using a cork borer.
  • the use of leaf rondelles facilitates the absorption of salicylic acid or the elicitor into the leaf tissue via the wound edge.
  • AG5957-t48 are in 90 mm Petri dishes in salicylic acid-containing medium (LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 0.5 mM SA), in PMG-elicitor-containing medium (LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 25 ⁇ g Elizitor / ml) or in control medium (LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0) for 16 h at 24 ° C.
  • the activity of the promoter is quantified as described in Jefferson (1987)
  • Leaves of the rapeseed transformant AG5947-t49 are used to describe the spatial expression behavior of the promoter. The leaves are separated from greenhouse plants and placed in a clear plastic box on wet filter paper.
  • the elicited leaf half of the transformant AG5947-t49 shows, as shown in FIG. 10, a spatially very limited blue color and thus promoter activity around the pectinase application site.
  • the remaining tissue areas of the enzyme-treated leaf half and the water-inoculated leaf half of the transgenic line show no visible GUS activity.
  • the pathogen-inducibility of the promoter in transgenic plants is demonstrated by infection of leaves of the transgenic rapeseed lines AG5947-t48 and AG5947-t49 with the causative agent of rapeseed disease, Phoma Hungary. Plants of the transgenic lines AG5947-t48 and AG5947-t49 as well as the non-transgenic line Drakkar are grown from seed under greenhouse conditions. After the plants have reached the age of 6 weeks, 2 leaves of the same size are wounded locally with a nail board in order to create an entry gate for the fungus.
  • the leaves are inoculated.
  • leaves of transgenic and non-transgenic plants are wounded and only immersed in water.
  • the plants are then incubated for 7 days under a film tunnel in the greenhouse at 25 ° C and 90-100% humidity.
  • the film tunnel is removed after 7 days and histochemical detection of the promoter activity is carried out after 10 days as described above.
  • the mushroom-inoculated leaves show a 6-8 mm necrotic zone around the wound sites, while the water-treated controls show only a 1-2 mm browning reaction around the wound site.
  • the mushroom-inoculated leaves of the transgenic plants show a local blue color around the infection sites caused by the locally restricted promoter activity.
  • the fungus-infected leaves of the non-transgenic Drakkar line and the wounded and water-treated leaves of the non-transgenic and transgenic lines show no blue discoloration and therefore reporter gene activity.
  • the vector pAG5957-trans is based on the protocol described for rape in Nicotianum tabacum cv. SR1 transformed.
  • the tobacco transformants produced are called PR1-52, PR1-54 and PR1-56.
  • the transformant PR1-52 is propagated and transferred to the greenhouse. After the plant has reached a size of approx. 20 cm, the activability of the sugar beet promoter is analyzed depending on the plant age. 6 leaves of different ages are selected on the plant. The oldest, deepest leaf receives the designation 1 and the youngest, highest leaf the designation 6. From the
  • the promoter activity increases with age in the transgenic plants.
  • the wounding or elicitation or application of saliycalic acid leads to a higher reporter gene and thus promoter activity in all examined leaves.
  • plant age has no influence on the relative induction of the promoter by wounding, elicitation or salicylic acid administration.
  • the vectors pAG516 and pAG2339 are transformed into tobacco with the help of A. tumefaciens.
  • the transformants produced using pAG516 are called PR4-19, PR4-21 and PR4-22 and the transgenic plants produced using pAG2339 are called PR8-2, PR8-3 and PR8-12.
  • the three lines PR1-52, PR1-54 and PR1-56 transformed with pAG5947-trans show a slight increase in reporter gene activity after wounding and a clear induction of promoter activity after elicitation or salicylic acid application (Table 4c).
  • the plants transformed with the construct pAG2339 show no significant change in the reporter gene activity after wounding, elicitation or administration of salicylic acid.
  • Those transformed with the construct pAG516 Plants PR8-2, PR8-3 and PR8-12 show only a low SA inducibility against the background of a very low reporter gene activity in comparison to the PR1 plants.
  • sugar beet seed is laid out in the field. In the course of a central European growing season, 5 complete sugar beet plants are harvested 4, 6, 10, 12, 16 and 22 weeks after sowing.
  • Total cell RNA is according to Logemann et al. 1987 isolated from the organs "sink” and “source” leaf, petiole, side root and tap root (beet body). The activity of the promoter is determined by an RNA blot analysis. Part of the coding region adjoining the promoter is used as the hybridization probe. For this purpose, a 1800 bp genomic DNA fragment is amplified by "inverse polymerase chain reaction (IPCR)" from the plant genome of genotype 1K0088.
  • IPCR inverse polymerase chain reaction
  • the genomic DNA 100 ng is cut with the restriction endonuclease ßg / II, extracted with phenol / chloroform and ethanol precipitated.
  • the DNA is then taken up in ligation buffer (Life Technologies GmbH, Düsseldorf) and in a total volume of 15 ⁇ l in the presence of 1 u T4 DNA ligase (Life Technologies GmbH, Düsseldorf) and in a total volume of 15 ⁇ l in the presence of 1 u T4 DNA ligase (Life
  • a PCR is carried out.
  • the oligonucleotide primer R1 with the sequence GTG GCT GCT ATA CGA AGA AAA TCT and the primer R2 with the sequence ACA CTA TTA TCT ACG CCT CTG ACT for the
  • the primer R1 binds from position 5732-5755 of the nucleotide sequence of Fig. 1 and thus 192 bp away from the transcription start point of the promoter.
  • Primer R2 binds from position 5148-5124 of the nucleotide sequence of FIG. 1 and thus 254 bp behind the only Sg / Il interface of the promoter.
  • the PCR conditions are when using 5 ⁇ l of the ligation mixture, a primer concentration of 0.2 ⁇ M, 1.0 ⁇ Advantage KlenTaq polymerase mix (Clontech Laboratories, Heidelberg) and 25 ⁇ l reaction volume in a multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, MA. , USA) as follows:
  • DNA fragments with 50 ⁇ Ci 32 P-dATP (6000 Ci / mmol, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) are carried out using the Prime-It II Random Primer Kit (Stratagene GmbH, Heidelberg) according to the manufacturer's instructions.
  • the subsequent hybridization of the RNA filter with the labeled probe takes place in 20 ml hybridization buffer (50% formamide, 5 x SSC, 5 x Dendardts, 1% SDS, 0.1 mg herring sperm DNA, 40 mM
  • RNA blot shows that the promoter in the field under non-infection conditions in 4, 6, 10,
  • RNA blot was evaluated with a phosphoimager (Bioimaging Analyzer BAS 1000, Fujiy Japan) in order to quantify the transcript accumulation.
  • the data of the quantification are shown in Table 4.
  • sugar beets of the tolerant genotype 1 K0088 and the susceptible genotype 3S0057 are grown under greenhouse conditions.
  • 20 V8 vegetable juice plates (40% Albani vegetable juice) are inoculated with four different C. beticola isolates and incubated at 25 ° C.
  • the fungus-covered agar is homogenized together with 0.5 l of water in a high-performance agitator (UM5 Universal, Stephan).
  • the concentration of mycelium fragments and fungal spores in the homogenate is determined using a counting chamber.
  • the inoculum density is adjusted to a concentration of 100,000 fragments / ml by dilution with water.
  • the diluted homogenate is sprayed with a backpack
  • the activation of the promoter can be demonstrated in leaves as early as 4 days after the inoculation in leaves that are still symptom-free (-). With the appearance of the harmful symptoms (after 7 or 9 days) (+ or ++) there is a drastic accumulation of a specific transcript. Here, a higher transcript accumulation can be observed in more infested leaves than in less infested leaves.
  • sugar beets of the genotype 1K0088 were grown from seed in a test field. Each test plot with 96 plants that are 12 weeks old was inoculated with a C. beticola agar mixture or, for control purposes, only with an agar mixture. Immediately after the inoculation and then at daily intervals, small leaves (leaf length ⁇ 10 cm) and large leaves (leaf length> 20 cm) were removed from the mushroom-inoculated and only agarin-inoculated plants, immediately shock-frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C. Whole cell RNA was isolated as described and an RNA blot analysis was carried out.
  • RNA blots were evaluated with a phosphoimager (Bio-imaging Analyzer BAS 1000, Fujiy Japan) in order to quantify the transcript accumulation.
  • An induction factor was calculated for each time value and for each leaf type from the transcript quantities, which were determined for control plants and for the infected plants (Table 6). This induction factor is a measure of the activation of the promoter by fungal attack.
  • the activity of the promoter was quickly induced in both small and large leaves. Already after the 1st day, the first time of measurement after the inoculation, a 3.8-fold induction of the promoter was observed in large leaves. In small leaves, a 5.2-fold induction was only observed on the second day.
  • genotypes were infected with C. beticola under field conditions or only treated with agar for control purposes in order to investigate the activity of the promoter during the visible establishment of the batt spot disease.
  • the donor plant for the promoter the genotypes are lines 4T0057 and 9B3734.
  • Large leaves > 20 cm
  • Whole cell RNA was isolated from the leaf samples at all times and an RNA blot analysis was carried out.
  • the amount of transcript was quantified using a phosphoimager.
  • sugar beet of genotype 1 K0088 is first grown in a test field made from seeds. Growing in the field guarantees the formation of a strong main root, which is not the case when growing under greenhouse conditions. After 3 months, the plants are carefully dug out, individually transferred to 10 l plastic buckets filled with earth and cultivated in the greenhouse for a further 2 months.
  • the fungal infection occurs on 5-month-old sugar beets in a phyto cell.
  • 5 holes with a diameter of 1 cm are pressed into the soil around the beet at a distance of 5 cm.
  • the holes are filled with barley flour covered with R. solani.
  • the inoculation holes are only filled with barley flour.
  • the plants are incubated at 25 ° C, good irrigation and a 16/8 hour light / dark change.
  • Detectable transcripts The time and the intensity of the transcript formation correlate with the extent of the visible disease symptoms, ie the promoter is replaced by R. so / on / infestation specifically induced in the beet roots. A stronger fungal attack leads to a stronger activation of the promoter in the plant.
  • leaf rondelles (1 cm in diameter) were punched out of 12 week old sugar beet using a cork borer.
  • 100 leaf trondelles were incubated in control medium (LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0) or in salicylic acid-containing medium (LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 2.0 mM SA) at 24 ° C.
  • LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0 LS medium without sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 2.0 mM SA
  • Whole cell RNA was isolated and an RNA blot analysis was carried out as described above. The intensity of the hybridization signals on the RNA blot was determined using a
  • the promoter activity of the rondelle in the control batch is not constant over the test period (Table 8). Based on the 0 h value, the promoter activity in the control mixture drops slightly after 3 h and then increases over 6 h and 11 h to the 24 h value. After 24 h, the amount of transcript in the control batch is approx. 3 times higher than at the start of the experiment (0 h). This increase in promoter activity is due to the wounding of the leaf tissue associated with punching out the leaf trondelle. The promoter thus shows wound inducibility in the leaves. In the medium containing salicylic acid there is also an increase in the amount of transcript as a function of time (Table 8).
  • the amount of transcripts apart from the time 0 h at all other test times is significantly higher than in the control batches. After 24 h, the amount of transcripts is approximately 8.5 times the 0 h value.
  • the reason for the higher activity of the promoter in the medium containing salicylic acid is an inducibility of the promoter by salicylic acid.
  • SR1 is the non-transgenic parent line.
  • a 1800 bp DNA fragment obtained by IPCR was used as the hybridization probe.
  • the amount of transcript formed by the promoter activity was quantified using a phosphoimager and shown in the table for each time of the experiment.
  • the first pair of leaves was chosen as the "source" leaf for the 4-week-old sugar beet.
  • the cotyledons were selected as the "sink" leaf for the 4-week-old sugar beet.
  • RNA from fungal and control plants was examined by RNA blot analysis.
  • the amount of transcript formed by the promoter activity was quantified using a phosphoimager.
  • Leaf rondelle of sugar beet were incubated for the specified period of time in liquid medium in the presence and in the absence of 2.0 mM salicylic acid. RNA was isolated from the rondelles and an RNA blot analysis was carried out. The amount of transcript formed by the promoter activity was quantified using a phosphoimager and shown in the table for each time of the experiment.
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Promotoren, die in Pflanzen, vorzugsweise in Zuckerrübe, Raps, Kartoffel, Mais, Sojabohne, Weizen, Reis, Roggen, Gerste, Baumwolle und Sonnenblumen, die Pathogen-Induzierbarkeit von Genen erhöhen. Die neuen Promotoren zeichnen sich weiterhin dadurch aus, daß sie in verschiedenen Organen und Geweben transgener Pflanzen, wie Blättern, Sprossen und/oder Wurzeln, nach Pathogenbefall oder Verwundung zur schnellen lokalen Expression des jeweils unter ihrer Kontrolle stehenden Gens führen. Diese Eigenschaft macht diese Sequenzen zu einem idealen Regulationselement zur kontrollierten Expression von antifungalen Verbindungen und damit zur Entwicklung von pilzresistenten Pflanzen.

Description

Nukleotidsequenz zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleotid-Sequenz zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall und Genkonstrukte mit einer solchen
Nukleotid-Sequenz. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall sowie transgene Pflanzen und Samen dieser Pflanzen.
Es ist bekannt, daß Pflanzen von verschiedenen Erregern und Parasitenarten befallen werden. Dabei sind Kulturpflanzen meist anfälliger für einen Parasitenbefall als ihre wildwachsenden Verwandten.
Die Schäden an landwirtschaftlichen Kulturpflanzen durch Pathogenbefall führen jährlich zu Ernteausfällen von bis zu 50%. Eine besondere Bedeutung kommt dabei den Ausfällen durch Befall mit pilzlichen Pathogenen zu. Häufig trifft man Pilze an, bei denen es sich um chlorophyllfreie, heterotrophe Thallophyten handelt. Ihre Thalli sind oft fädig und in der Regel von einer Zellwand umgeben.
Da der Einsatz von Fungiziden nur begrenzt möglich ist, ist es wünschenswert,
Resistenzen gegen pilzliche Pathogene auch in Kulturpflanzen zu verwirklichen. Die Züchtung toieranter/resistenter Kulturpflanzen ist daher von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung. Traditionelle Züchtungsprogramme sind jedoch in den Möglichkeiten, fremde Gene einzukreuzen, stark limitiert, zudem ist der zeitliche und personelle Aufwand sehr hoch.
Die Entwicklungen der Pflanzenbiotechnologie erlauben es, in einen grossen Teil der bekannten Nutzpflanzen Gene einzubringen und die von den Genen kodierten Proteine zu exprimieren.
Für die Expression eines Gens kommt der Auswahl eines geeigneten Promotors eine erhebliche Bedeutung zu. Infolgedessen existiert ein großes Bedürfnis nach gut charakterisierten Promotoren mit spezifischen Eigenschaften. Promotoren können in Pflanzen eine konstitutive, eine organ-, gewebe- bzw. zellspezifische oder eine induzierbare Aktivität besitzen. Konstitutive Promotoren sind in der Lage, während der normalen Entwicklung einer Pflanze einen mit ihnen verbundenen kodierenden Bereich in allen Geweben zu exprimieren. Das Expressionsniveau muß dabei nicht für alle Gewebe und alle Zelltypen gleich groß sein. Konstitutive Promotoren können pflanzlichen, bakteriellen oder viralen Ursprungs sein.
Eine große Zahl pflanzlicher Promotoren konnte in den letzten Jahren isoliert und auf ihre Wirkung hin untersucht werden. Breite Anwendung haben inzwischen die aus Agro- bacterium tumefaciens isolierten Octopinsynthase (ocs), Nopalinsynthase (nos) und
Mannopinsynthase (mas) bzw. TR-Promotoren (De Greve et al., 1982, Depicker et al., 1982; Veiten et al., 1984) und der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (Odell et al., 1985) gefunden. Pflanzliche Promotoren mit einer konstitutiven Aktivität sind für Tabak (WO 97/28268) und Himbeere (WO 97/27307) beschrieben worden.
Organ-, gewebe- oder zeilspezifische Promotoren können für die Expression von Genen in spezifischen Pflanzenteilen verwendet werden. Spezifität kann in diesem Zusammenhang bedeuten, daß ein Promotor hauptsächlich oder ausschliesslich in einem Organ, Gewebe oder Zelltyp aktiv ist. Hauptsächlich in einem bestimmten Organ aktiv sind z.B. die Tomatenpromotoren TFM7 und TFM9 in Tomatenfrüchten (US 5,608,150), ein Rapspromotor in Wurzeln (WO 94/02619), ein Sonnenblumenpromotor in Samen (WO 98/45460) und ein Kartoffelpromotor (WO 98/18940) in Blättern. Diese genannten Promotoren zeigen ihre höchste Aktivität in den erwähnten Organen. Eine exklusive, ausschließliche Aktivität für ein bestimmtes Kompartiment wurde für einen schließzell- spezifischen Promotor aus der Kartoffel (DE 42 07358 A1), für den tapetum-spezifischen
Promotor TA29 aus Tabak (EP 0344 029 B1) und für den pistil- und pollen-spezifischen SLG Promotor aus Brassica (Dzelzkälns et al., 1993) beschrieben.
Induzierbare Promotoren sind regulatorische Elemente, deren Aktivität durch endogene oder exogene Reize reguliert wird. Endogene Reize können entwicklungsabhängige
Vorgänge, Phytohormone oder kritische Metabolitkonzentrationen sein. Exogene Stimuli, die auf eine Pflanze einwirken und die einen Promotor aktivieren können, sind Licht, abiotischer und biotischer Streß. Zu den abiotischen Streßfaktoren zählen Trockenheit, Kälte, Hitze und hohe Salzkonzentrationen im Erdboden oder die mechanische Verletzung von Pflanzenteilen. Biotische Streßsituationen in Pflanzen werden durch Pathogenbefall hervorgerufen.
Entwicklungsabhängig regulierte Promotoren steuern die Entwicklung und Reife von
Organen oder ganzen Pflanzen. Der Übergang von grünen, photosyntetisch aktiven Blättern zu seneszenten Blättern ist u.a. charakterisiert durch die Reduktion der Promotoraktivität von Genen, die an der Photosynthese beteiligt sind. Dazu gehören die Promotoren des Chlorophyll a/b Bindungsproteinsgens (cab) und des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose-1 ,6-bisphosphatsynthase (ssu). Gleichzeitig kommt es mit dem
Einsetzen der Seneszenz zur Aktivierung von seneszenz-spezifischen Promotoren.
Darüber hinaus ist ein organspezifischer Promotor bekannt, der im Speicherwurzelgewebe der Zuckerrübe aktiv ist (WO 97/32027). Ein pathogenaktiver Promotor ist ferner in WO 92/17591 beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine weitere Nukleinsäure-Sequenz anzugeben, mit deren Hilfe eine verbesserte Pathogenabwehr einer Pflanze möglich ist. Diese Nukleinsäure-Sequenz soll insbesondere gegenüber pilzlichen Pathogenen wirken und Pflanzen mit einer altersbedingten Pilzanfälligkeit schützen. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall sowie die entsprechend verbesserten Pflanzen bereitzustellen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgaben durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 aufgeführten Merkmale sowie durch die jeweiligen Gegenstände der nebengeordneten Patentansprüche. In den Unteransprüchen sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angegeben.
Zunächst werden einige in der Anmeldung verwendete Begriffe näher erläutert, um klarzustellen, wie sie hier verstanden werden sollen. Unter Promotor ist eine DNA-Sequenz zu verstehen, die die Expression eines Gens unter seiner Kontrolle in Abhängigkeit von endogenen und exogenen Faktoren steuert. Zu diesen Faktoren gehören z.B. Induktoren, Repressoren und ähnliche DNA-bindende Proteine, als auch Umwelteinflüsse. Ein Promotor kann aus mehreren Elementen bestehen. Er umfaßt jedoch mindestens ein regulatorisches Element, das für die Transkription des unter seiner Kontrolle stehenden Gens zuständig ist.
Derivate einer Nukleotid-Sequenz sind verkürzte Versionen dieser Sequenz mit gleichen, modifizierten oder singulären Eigenschaften wie die Ausgangssequenz.
Elizitoren sind Substanzen, die z.T. aus dem Pathogen stammen, z.T. werden sie durch Pathogene aus der Pflanzenzellwand freigesetzt. Elizitoren aus Pilzen sind einerseits neutrale, verzweigte Glucane, andererseits Glycoproteide. Elizitoren aus der Zellwand dürften Fragmente von Pectinstoffen sein. Elizitoren können innerhalb von 20 min auf Transkriptionsebene Genexpression auslösen, wie am Beispiel der Synthese von PAL- spezifischer mRNA in Petersilien-Zellkulturen gezeigt wurde.
Pathogeninduzierbarkeit bedeutet das Einwirken von äußeren Faktoren auf eine Pflanze, die eine Abwehrreaktion derselben nach sich zieht. Dabei kann es sich um Angriffe durch Insekten (Fraß), Bakterien, Pilze oder andere Pathogene handeln, aber auch um abiotische Einwirkungen, wie mechanische Verwundungen (z.B. durch Hagelschlag).
Die Pathogeninduzierbarkeit des hier beschriebenen Promotors bedeutet die erhöhte Transkription des Gens, das unter der Kontrolle des Promotors steht, wenn der pathogene Induktor vorliegt und welches sich folglich in einer aktiven Abwehrreaktion der befallenen Pflanze ausdrückt.
Direkte antifungale Wirkung bedeutet, daß Genprodukte unmittelbar antifungal wirken, indem sie z.B. Zellwände auflösen oder für Phytoalexinsynthasen codieren bzw. für Metabolite, die hemmend in den pilzlichen Stoffwechsel eingreifen.
Indirekte antifungale Wirkung bedeutet, daß Genprodukte die pflanzliche Genabwehr aktivieren. Zu diesen Genen gehören z.B. Resistenzgene, Komponenten der Signaltransduktion (wie Kinasen, Phosphatasen), Transkriptionsfaktoren oder Enzyme, die Signalsubstanzen produzieren (wie Ethylenbildende, Salicylsäurebildende oder Jasmonatbildende Enzyme, reaktive Sauerstoffspezies bildende Enzyme, Stickstoffmonoxydbildende Enzyme).
Unter Altersabhängigkeit bzw. Entwicklungsabhängigkeit ist die unterschiedliche Intensität der Promotoraktivierung und damit der Expression des vom Promotor kontrollierten Gens je nach Pflanzenalter zu verstehen.
Als "sink"-Blätter werden hier solche Blätter bezeichnet, die aufgrund ihrer geringen
Größe mehr Kohlenhydrate verbrauchen als sie selber produzieren.
"Source' -Bätter dagegen sind Blätter, die aufgrund ihrer Größe mehr Kohlenhydrate produzieren als sie selber verbrauchen.
Unter Infektion ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, bei dem der Stoffwechsel des Pilzes (bzw. das Wachstum des Pilzes) auf eine Penetration des Wirtsgewebes vorbereitet wird. Dazu gehören z.B. das Auswachsen von Hyphen oder die Bildung von spezifischen Infektionsstrukturen wie Penetrationshyphen und Appressorien.
Unter Inokulation ist das physikalische Zusammentreffen von Pathogen und Wirt zu verstehen.
Die Erfindung wird nachfolgend und mit Bezug auf die Figuren und Beispiele näher erläutert:
Die erfindungsgemäße Nukleotid-Sequenz enthält mindestens zwei verschiedene cis- Elemente, ausgewählt aus der folgenden Gruppe a) L-Box oder L-Box ähnliche Sequenz mit der Hexanucleotid-Sequenz CCTAc/aC b) GCC-Box mit der Kernsequenz GCCGCC c) W-Box mit der Hexanukleotidsequenz TTGACC und besitzt die Eigenschaft eines Promotors. Unter L-Box wird eine 12 bp umfassende Sequenz t/aCTc/aACCTAc/aCc/a (Lois et al., 1989; da Costa e Suva et al., 1993) verstanden wobei t a bzw. c/a bedeutet, daß ein T oder A bzw. C oder A an dieser Stelle in der Sequenz vorhanden sein kann. Als L-Box ähnliche Sequenz wird eine Sequenz verstanden, die die Hexanukleotidkernsequenz CCTAc/aC enthält und in mindestens einem weiteren Nukleotid mit der L-Box übereinstimmt. Die L-Box bzw. L-Box ähnlichen Sequenzen sind in den Promotoren der Phenylalanin-Ammonium-Lyase-(pal)-Gene aus Petersilie, Bohne und Arabidopsis thaliana und einiger weiterer Gene des Phenylpropan-Stoffwechselweges (Lois et al., 1989; Ohl et al., 1990) identifiziert worden. Die L-Box wurde durch die "in vivo DNA footprinting" Technik als ein Ort einer UV-Licht und elizitor- induzierbaren DNA/Protein-
Interaktion identifiziert. Die Kernsequenz CCTAc/aC ist der Sequenzbereich an dem die stärkste Hypomethylierung auftritt (Lois et al., 1989). Das Auftreten des Box L sowie des Box P "footprints" fällt zeitlich zusammen mit dem Beginn der Transkription des pal-Gens nach UV- bzw. Elizitorstimulation (da Costa e Silva et al., 1993).
Unter GCC-Box wird eine 11 bp große Sequenz TAAGAGCCGCC (Ohme-Takagi and Shinshi, 1995) verstanden. Als GCC- Box wird auch eine Nukleotidsequenz verstanden, die nur das Kernmotiv GCCGCC der GCC-Box enthält. Die GCC-Box vermittelt die Aktivierung von Promotoren durch die Signalsubstanz Ethylen und wurde für die Promotoren einiger Pathogenabwehrgene beschrieben (Ohme-Takagi and Shinshi,
1995).
Unter W-Box wird eine Hexanukleotidsequenz TTGACC verstanden. W-Boxen sind auch in den Promotoren anderer Pathogenabwehrgene beschrieben worden (Rushton and Somssich, 1998). Die Bedeutung dieses cis-Elementes für die Pathogen-Induzierbarkeit der Promotoren wurde für das Maisgen PRms (Raventos et al., 1995) und die Petersiliengene PR1-1 und PR1-2 nachgewiesen (Rushton et al., 1996).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß für die Pathogenabwehr wirksame Nukleotid-Sequenzen erhältlich sind, wenn man mindestens zwei der oben genannten cis-Elemente kombiniert. Weitere Kombinationen von cis-Elementen sind in der Unteransprüchen 2 bis 5 beschrieben.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Nukleotid- Sequenz ein weiteres cis-Element, das für eine Induktion der Abwehrreaktion durch Salicylsäure verantwortlich ist. Dabei handelt es sich um ein Fragment, das ein SAR- Element (Salicylic acid response element) ist. Das SAR-Element befindet sich vorzugsweise in reverser komplementärer Orientierung in direkter Nähe zu einer W-Box.
Ein SAR-Element mit der Sequenz TTCGACCTCC wurde als Kernsequenz eines 76 bp großen DNA Fragments des PR2-d Gens aus Tabak identifiziert (Shah and Klessig, 1996). Das 76 bp große Fragment mit dem SAR-Element ist verantwortlich für die Salicylsäure-Induzierbarkeit des PR2-d Gens. SAR-Elemente im Sinne dieser Anmeldung sind TTCGACCTCC-Sequenzen einschließlich entsprechender Konsensus-Sequenzen.
Ein SAR-Element ist auch die Sequenz TTCGACCTCG. Diese liegt bevorzugt in reverser, komplementärer Orientierung zum Transkriptionsstart bei Position 4176-4167 und damit nur 2 bp neben der dritten W-Box .
Weitere Ausführungsformen der Erfindung können besondere Abfolgen und
Kombinationen der cis-Elemente vorsehen. Bevorzugt ist eine enge Kopplung des 10 bp großen SAR-Elementes an eine W-Box. Möglicherweise ist die enge Kopplung für eine verstärkte Salicylsäure-Induzierbarkeit des Promotors verantwortlich. Ebenso scheint das Vorliegen dreier L-Box ähnlicher Sequenzen sowie das Vorliegen zweier W-Boxen in normaler und reverser komplementärer Form besonders vorteilhaft für die Pathogeninduzierbarkeit einer Nukleotid-Sequenz zu sein.
Eine Lösung der eingangs gestellten Aufgabe stellt insbesondere die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID No.1) gemäß Fig. 1 dar. Diese Sequenz und hiervon abgeleitete Sequenzen sind geeignete Promotoren mit einer guten Pathogeninduzierbarkeit. Abgeleitete
Sequenzen sind u.a. homologe Sequenzen mit einer Homologie von mind. 50%, wobei die Homologie im wesentlichen auf Übereinstimmungen im Bereich der cis-Elemente zurückzuführen ist. Der Ausdruck "Homologie" bedeutet hierbei Homologie auf DNA-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (S.F. Altschul et al (1990), Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403-410) bestimmt werden kann.
Nach einer anderen Ausgestaltung der Erfindung werden Derivate einer Nukleotid- Sequenz nach Figur 1 hergestellt. Ausgehend von einer Sequenz gemäß Fig. 1 erfolgt eine Polymerasekettenreaktion mit einem der folgenden Primerpaare a) P0/P4480 b) P0/P4047 c) P0/P3017 d) P0/P2661 e) P0/P2339 f) P0/P1889 g) PO/P 1777 h) PO/P 1777* i) P0/P814 j) P0/P368, wobei
PO mit der Sequenz ACT GAC CAC CCG GGG TGG ATT TAT TG P4480 mit der Sequenz CCG GGT CGA CGC CGG GCC TCC CCA AA P4047 mit der Sequenz TCC AAT TGT CGA CAA TAA AAT TC P3017 mit der Sequenz TAT AAC AAG AAG TCG ACA GGA GAA CAT ATT P2661 mit der Sequenz GTG AAG TCG ACT GAC AAT TTT GGC AGT CAT C
P2339 mit der Sequenz TTA TTG AAG GTC GAC CAC TGT TTT GCA ACC P1889 mit der Sequenz AAT ATG TTG ACC TAT GGA AAA TAA TC P1777 mit der Sequenz GTT CGA GGT CGA CCT TTG ACC GTT AAT TAC P1777* mit der Sequenz GTT CGA GGT CGA CCT TAG ACT GTT AAT TAC P81 mit der Sequenz AGT CAG AGG CGT CGA CAA TAG TGT GC und
P368 mit der Sequenz TAT AAT TCA TGT TGA CGT GTT AGT CCT TCC oder einer jeweils hiervon abgeleiteten Sequenz bindet. Darüber hinaus läßt sich auch eine Sekretion exprimierter Proteine in Apoplasten erreichen, indem man die Nukleotid-Sequenz transkriptionell mit der Signalsequenz des apoplastischen Invertase-Inhibitors aus Tabak fusioniert.
Nukleotid-Sequenzen gemäß dieser Erfindung können aber auch mit einer Nukleotid-
Sequenz am 3'-Bereich translationell erweitert werden. Bevorzugt läßt sich eine trans- lationelle Fusion mit Hilfe einer Nukleotid-Sequenz aus der Sequenz nach Fig. 5 durchführen.
Entsprechend der dargestellten Erfindung lassen sich transgene Pflanzen herstellen.
Durch die Einschleusung der Nukleotid-Sequenzen in die zu verändernden Pflanzen kann Pathogenresistenz beeinflußt werden. Es sind keine pleiotropen Geneffekte zu erwarten. Damit bleibt die Leistungsfähigkeit des Zuchtmaterials unberührt. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber Pathogenen, vor allem gegenüber pilzlichen Pathogenen. Diese können aus der Gruppe umfassend
Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Ascomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes stammen.
Mit den erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenzen lassen sich insbesondere Gen- konstrukte herstellen, bei denen das Gen ein Pathogenabwehrgen ist. Vorteilhafterweise ist das Gen ein Resistenzgen oder ein Avirulenzgen.
Nach einer weiter bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung zeigt das Gen direkte oder indirekte antifungale Wirkung.
Beispielsweise läßt sich ein mit einer Signalsequenz versehener Promotor aus pAnjasek mit dem T4-Lysozym-Gen fusionieren, das Konstrukt in Pflanzen transformieren, welche dann eine erhöhte Pathogenabwehrreaktion, speziell gegenüber pilzlichen Pathogenen, aufweisen.
Die neuen Nukleodid-Sequenzen zeichnet sich weiterhin dadurch aus, daß sie in verschiedenen Organen und Geweben transgener Pflanzen, wie Blättern, Sprossen und/oder Wurzeln, nach Pathogenbefall oder Verwundung zur schnellen lokalen Expression des unter ihrer Kontrolle stehenden Gens führen. Diese Eigenschaft macht diese Sequenzen zu einem idealen Regulationselement zur kontrollierten Expression von antifungalen Verbindungen und damit zur Entwicklung von pilzresistenten Pflanzen. Entsprechende Vorteile ergeben sich auch bei den von den Nukleotid-Sequenzen in oben beschriebener Form abgeleiteten Derivaten.
Die erfindungsgemäßen Nukleotid-Sequenzen sind auch in Seitenwurzeln, der Pfahlwurzel und den Petiolen von Zuckerrüben konstitutiv aktiv. In Blättern von Zuckerrüben zeigen diese Sequenzen, unabhängig vom "sink" oder "source" Charakter der Blätter, eine altersabhängige, insbesondere verstärkt altersabhängige
Aktivitätszunahme. Die neuen Nukleotidsequenzen zeichnen sich zudem dadurch aus, daß sie in Blättern transgener Pflanzen mit zunehmenden Pflanzenalter eine steigende Expression des unter ihrer Kontrolle stehenden Gens erlauben. Hierdurch lassen sich ausgezeichnet Pilzerkrankungen von Pflanzen, die wie die Zuckerrübe eine Altersanfälligkeit gegenüber dem Pathogen Cercospora beticola zeigen, bekämpfen.
Diese überraschende Eigenschaft einer altersabhängigen Expression kann z.B. in südlichen Ländern eine Lösung für Folgeprobleme einer Pilzinfektion darstellen. Z.B. werden in Italien, wo der Zuckerrübenanbau unter starken Cercospora-Infektionen zu leiden hat, frühe und mittelfrühe Sorten derzeit bereits im Juli/August geerntet, um einen
Ausfall durch Pathogenbefall zu umgehen. Hier bietet ein in der vorliegenden Anmeldung dargestellter Promotor die Lösung, daß er zum Zeitpunkt des höchsten Infektionsdrucks (Juli/August) aktiviert werden kann. Somit kann bei diesen Befallssituationen auch der Anbau von spätreifen Sorten mit transgener Pathogenresistenz ermöglicht werden.
Weiterhin kann die Aktivitätszunahme eines solchen Promotors in Blättern aber auch genutzt werden, um sowohl Qualitäts- als auch altersabhängige
Verarbeitungseigenschaften von Pflanzen zu verbessern. Dabei kommen beispielsweise Eigenschaften wie der Verringerung von Lagerungsverlusten bei gelagerten Rüben, oder einer Verminderung der Bildung von schädlichem Stickstoff durch antisense-Expression eines Transportergens Bedeutung zu. Tabelle 2 zeigt die überraschend stark auftretende Elizitor-Induzierbarkeit des Promotors. Im Vergleich zur Kontrolle, der nicht-transgenen Rapssorte Drakkar, zeigen die beiden transgenen Linien einen Induktionsfaktor von 17,7 bzw. 16,9 nach Eliziterierung.
Für die Elizitor-Induzierbarkeit läßt sich als Elizitor das Enzym Polygalacturonase aus
Rhizopus einsetzen.
Durch die Nukleotid-Sequnzen gemäß der Erfindung ist die Induktion der Abwehrreaktion gegenüber pilzlichen Pathogenen bereits ab dem ersten Tag nach Inokulation nach- weisbar ist. Diese überraschende Eigenschaft ist vor allem für die Frühphase der Infektion relevant, da eine Infektion durch Cercospora beticola erst vier Tage nach der Inokulation beginnt.
In seiner natürlichen Umgebung in Zuckerrüben zeigt der neue Promotor während den ersten 12 Wochen der Pflanzenentwicklung sowohl in "sink" als auch in "source" Blättern eine geringe, aber stetig zunehmende Aktivität, die aber noch nicht größer ist als die Aktivität in den übrigen Organen (Petiole, Pfahl-, Seitenwurzel). Nach 12 Wochen kommt es in nichtinfizierten "sink" und "source" Blättern zu einem Anstieg der Promotoraktivität, die die Promotoraktivität in den übrigen Organen weit übersteigt. Dies weist auf eine erhöhte Altersaktivität des hier beschriebenen Promotors in Blättern hin.
Der Promotor wird sowohl in Rübenblättern durch Blattpilze wie z.B. Cercospora beticola als auch in Rübenwurzeln durch wurzelbürtige Schaderreger wie z.B. Rhizoctonia solani aktiviert.
Die Aktivitätszunahme des Promotors in Blättern und dem Rübenkörper von Zuckerrüben korreliert mit dem Ausmaß des Pilzbefalls und der Gewebeschädigung. Durch die Verwendung des Promotors in Kombination mit einem geeigneten Gen kann aufgrund dieser Eigenschaft eine kurative Wirkung erzielt werden. Auch im Fall einer bereits erfolgten Infektion kann die weitere Ausbreitung eines Pathogens verhindert oder eingeschränkt werden. ln bevorzugter Weise wird ein Genkonstrukt bereitgestellt, das aus Gen und Promotor besteht, wobei das Gen unter der Kontrolle des Promotors steht. Dabei zeichnet sich das Gen dadurch aus, das es direkte oder indirekte antifungale Wirkung zeigt.
Mit Hilfe eines solchen Genkonstrukts läßt sich eine Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall erreichen, wenn man das Genkonstrukt in dem Genom einer Pflanze stabil etabliert. Dabei kann das in Frage kommende Gen bereits in dem Genom der Pflanze vorhanden sein, wenn die erfindungsgemäße Nukleotid-Sequenz an entsprechender Stelle integriert werden kann.
Gemäß einer Ausgestaltung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung läßt sich die Erhöhung der Abwehrreaktion durch biotische und/oder abiotische Faktoren auslösen. Als ein abiotischer Faktor kommt insbesondere Salicylsäure in Betracht.
Biofischer Faktor kann ein pflanzliches Pathogen, insbesondere ein pilzliches Pathogen, sein. Pilzliche Pathogen stammen vorzugsweise von einem Pilz, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Plasmodiophoromycetes, Oomycetres, Ascomycetes, Chytridio- mycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.
Dem Fachmann sind auch Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, die eine Nukleotid-
Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al., Plant Cell Rep. 11 (1992), 567-570; Stoeger et al. Plant Cell Rep. 14 (1995), 273-278; Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89 (1994), 525-533.
Zu den Pflanzen, denen aufgrund der vorliegenden Erfindng eine erhöhte Resistenz vermittelt werden kann, gehören praktisch alle Pflanzen. Insbesondere lassen sich Kulturpflanzen züchten, die eine Resistenz gegen pilzliche Pathogene aufweisen. Derartig resistente Kulturpflanzen sind ihren nicht resistenten Verwandten weit überlegen, da sie nicht von pilzlichen Pathogenen befallen werden können und daher weniger krankheits- anfäliig sind. Weiterhin weisen derartig resistente Kulturpflanzen eine gleich hohe Qualität und Leistungsfähigkeit wie andere, nicht resistente Kulturpflanzen auf. Dies ist darauf zurückzuführen, daß mit Übertragung einer Nukleotid-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung keine DNA-Sequenzen übertragen werden, die unter Umständen für unerwünschte Eigenschaften kodieren.
Geeignete Pflanzen im Sinne dieser Erfindung sind Nahrungsmittel und Rohstoffe liefernde Pflanzen, z.B. Kohlenhydrate liefernde Pflanzen (insbesondere Weizen, Mais,
Reis, Roggen, Kartoffeln, Gerste, Hafer und Hirse), Öl und Fett liefernde Pflanzen (insbesondere Erdnuss, Ölpalme, Olive, Raps und Sonnenblumen), Zucker liefernde Pflanzen (insbesondere Zuckerrübe, Zuckerrohr, Zuckerhirse), Protein liefernde Pflanzen (insbesondere Erbsen, Bohnen, Kichererbsen, Linsen und Sojabohne), Fasern liefernde Pflanzen (insbesondere Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Genussmittel liefernde Pflanzen
(insbesondere Tabak, Tee- und Kakaosträucher), Holz liefernde Pflanzen (insbesondere Birken, Fichten, Tannen, Douglasien, Kiefern, Lärchen, Limba, Mahagoni, Buchen, Eichen, Zedern), Futtermittel liefernde Pflanzen (insbesondere Luzerne, und Futterrübe), Gemüse (insbesondere Gurken, Kohlarten, Kürbisse, Möhren, Paprika, Salate, Spinat, Radieschen und Tomaten), Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Melonen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen) weiterhin der Kautschukbaum und Zierpflanzen. Vorzugsweise ist die trangene Pflanze ausgewählt aus Zuckerrübe, Raps, Kartoffel, Mais, Sojabohne, Baumwolle, Weizen, Reis, Roggen, Gerste und Sonnenblumen. Diese Auswahl ist jedoch nicht einschränkend aufzufassen.
Die Erfindung betrifft aber auch transgene Pflanzen, die aus den erfindungsgemäß veränderten Pflanzen durch somatische Hybridisierung oder Kreuzung hervorgehen.
BEISPIELE
Figur 1 zeigt die Nukleotid-Sequenz SEQ ID No. 1. Die Nukleotidsequenz ist in 5"-3' Orientierung dargestellt. Die Lage der allgemeinen Konsensus-Promotorsequenzen (CAAT - und TATA-Motive), der cis-Elemente (L-Box ähnliche Sequenz, GCC-Box, W-
Box und SAR-Box) sind unten dargestellt. Die Nummerierung beginnt am 5'-Ende bei Pos. 1.
Figur 2 zeigt das Plasmid pAnja mit dem 5.947 kb großen genomischen DNA -Fragment aus Zuckerrübe (Beta vulgaris), das über H/ndlll und die gebluntete SamHI Restriktionsschnittstelle von pBluescriptll KS+ (Stratagene) subkloniert wurde. Neben den im Zuckerrübenfragment eingezeichneten Schnittstellen schneiden z.T. noch weitere Restriktionsenzyme des Polylinkers auch im klonierten Fragment.
Figur 3 zeigt die Verteilung von cis-Elementen im Promotor. Die Pfeilspitzen geben jeweils die Orientierung der cis-Elemente, bezogen auf den Transkriptionsstart bei 0, wieder.
Eine TATA-Box befindet sich bei Nukleotidposition 5912-5915 und eine CAAT-Box bei Nukleotidposition 5903-5906 . Es folgt bei Position 4179-4184 eine W-Box. Zwei weitere W-Boxen befinden sich an
Position 1494-1499 sowie 1586-1581. Die W-Boxen bei den Positionen 4179-4184 und 1494-1499 liegen in normaler Orientierung mit Bezug auf die TATA-Box, die W-Box 1586- 1581 liegt auf dem komplementären Strang in reverser Orientierung vor. Nur 2 bp von der ersten W-Box bei 4179-4184 entfernt befindet sich eine SAR-Box bei Position 4176-4167 in reverser komplementärer Lage zur TATA-Box.
Eine GCC-Box liegt in zweifacher Wiederholung in reverser komplementärer Orientierung zur TATA-Box bei Position 3598-3593 sowie bei Position 3081-3076. Eine L-Box ähnliche Sequenz liegt in dreifacher Wiederholung bei den Positionen 2331- 2342, 2117-2228 und 1916-1927 vor. Alle drei L-Box ähnlichen Sequenzen liegen in gleicher Orientierung in bezug auf die TATA-Box.
Figur 4 zeigt Promotordeletionen, ausgehend vom Vektor pAG5947. Die aufgeführten Plasmide resultieren aus transkriptioneller Kombination des Promotors mit einem gus- Gen (pAG4480, pAG4047, pAG3017, pAG2661 , pAG2339, pAG1899, pAG1777, pAG1777*, pAG814 sowie pAG368) bzw. aus Restriktionsverdau (pAG3667, pAG1074, pAG516). Diese Promotordeletionen eignen sich für die Identifikation weiterer cis- Elemente.
Figur 5 zeigt die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz eines synthetischen DNA-Fragmentes. Das 95 bp große DNA-Fragment trägt am 5'-Ende die unterstrichene Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease Spei (ACTAGT) und am 3'-Ende die unterstrichenen Erkennungsstelien für die Restriktionsendonukleasen Psfl (CTGCAG) und Λ/ofϊ (GCGGCCGC). Die Nukleotidsequenz ist von Position 33-81 identisch mit den ersten 22 Nukleotiden des nichttranslatierten 5'-Bereichs und den ersten 27 Nukleotiden des codierenden Bereichs eines ß-1 ,3 Glucanase cDNA Klons aus der Zuckerrübe (Gottschalk and Mikkelsen, 1998).
Figur 6 zeigt den 8.946 bp großen Vektor pAnja-trans. Durch Einführung eines synthetischen DNA-Fragments (vgl. Fig.5) hinter dem Transkriptionsstartpunkt des Promotors wird ein translatierbarer Bereich in den Vektor eingefügt. Der translatierbare Bereich codiert von Nukleotidposition 51-95 für den N-Terminus eines Proteins. Durch Nutzung der im 3'-Bereich des synthetischen Fragments gelegenen Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen kann ein Fusionsprotein zwischen der 1.-12. Aminosäure eines synthetischen DNA-Fragmentes und eines beliebigen zu exprimierenden Gens erstellt werden.
Figur 7 zeigt den 19,86 kb großen binären Pflanzentransformationsvektor pAG 5.947- trans. Innerhalb der von Agrobakterium tutnefaciens zu übertragenden T-DNA (begrenzt durch die rechten (RB) und linken (LB) Borderbereiche) liegt der Selektionsmarker npfll und eine Reportergenkassette aus dem Promotor und dem gus-Gen. Durch Sub- klonierung des aus pAnja-trans stammenden Promotors liegt eine Translationsfusion zwischen dem synthetischen DNA-Fragment und dem gus-Gen vor.
Figur 8 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der Signalsequenz des Invertase- Inhibitorgens (nt-inh1) aus Tabak nach Amplifikation durch die Primer Sek1 und Sek2. Der 5'-Bereich des cDNA Klons des nt-inh1 Gens (Greiner et al., 1998) entspricht der Nukleotidsequenz von 11-106. Die für die PCR-Amplifikation verwendeten Primer Sek1 und Sek2 entsprechen den Nukleotidsequenzen von Position 1-35 bzw. der komplementären Sequenz von 93-131. Die durch die PCR Reaktion zusätzlich an den 5'- und 3'-Bereich des cDNA Klons synthetisierten Nukleotidsequenzen mit den Erkennungs- stellen für die Restriktionsenzyme Spei (A/CTAGT), Nael (GCC/GGC) und Notl
(GC/GGCCGC) sind unterstrichen.
Figur 9 zeigt den 8.977 bp großen Vektor pAnja-sek. Durch Einführung eines synthetischen DNA-Fragments (vgl. Abb. 8) hinter den Transkriptionsstartpunkt des Promotors wird der 106 bp große 5'-Bereich des cDNA-Klons des Invertase-Inhibitors aus
Tabak (Greiner et al. 1998) eingeführt. Dieser 5'-Bereich umfaßt die ersten 49 bp des transkribierenden, nicht translatierten Bereiches und die ersten 57 bp des codierten Bereiches. Durch Nutzung der Λ/ael Schnittstelle innerhalb des subklonierten PCR- Fragments kann ein beliebiges zu exprimierendes Gen mit der Signalsequenz des Invertase-Inhibitorgens fusioniert werden.
Figur 10 stellt den histochemischen Nachweis der lokalen Promotoraktivierung dar. Auf Blätter der Rapstransformante AG-5947-t49 wurden lokal 20μl Rhizopus Elizitor pipettiert, nach einer Inkubationszeit von 16h bei 24°C läßt sich die GUS-Aktivität histochemisch nachweisen. Die Blaufärbung des Gewebes zeigt die Bereiche an, in denen hohe GUS-
Aktivität vorliegt.
In Figur 11 wird die entwicklungsabhängige Promotoraktivität in einem RNA-Blot nachgewiesen. Dazu wurden je 10 μg Gesamtzell-RNA pro Organ (Lateralwurzel, Haupt- wurzel, Petiole, "sink"-Blatt, "source"-Blatt) und Zeitpunkt (4, 6, 10, 12, 16 und 22 Wochen nach Aussaat) in einem denaturierenden Formaldehyd-Agarosegel aufgetrennt.
Figur 12 zeigt die Aktivierung des Promotors in Zuckerrüben nach Infektion mit Cercospora beticola unter Gewächshausbedingungen. Verwendet wurden Zuckerrüben des toleranten Genotyps 1 K0088 und des anfälligen Genotyps 3S0057. Vier, sieben und neun Tage nach Inokulation wurden Blätter zur Isolierung von Gesamtzell-RNA geerntet. Die Aktivität des Promotors wurde durch RNA-Blot-Analyse bestimmt. Die Schädigung der untersuchten Blütter durch Pilzbefall ist in der Abbildung symbolisch dargestellt: - gleich gesunde Kontrolle, + gleich schwach befallenes, ++ gleich stark befallenes.
Figur 13 zeigt das Ergebnis der RNA-Blot-Analyse zur Messung der Transkriptbildung in Zuckerrüben des Genotyps 1 K0088 nach Infektion mit dem Wurzelpathogen Rhizoctonia solani. Die Pilzinfektion erfolgte in einer Phytozelle, Proben zur Isolierung der Gesamtzell- RNA wurden jeweils 14, 20 und 45 Tage nach Inokulation genommen.
Charakterisierung der Nukleotid-Sequenz nach Fig. 1
Die Nukleotid-Sequenz des 5947 bp grossen Promotorfragments ist in Fig. 1 wiedergegeben. Das Promotorfragment liegt subkloniert in dem Vektor pAnja (Fig. 2) vor. Der Vektor pAnja leitet sich von dem Plasmid pBluescript II KS+ (Stratagene) ab. Die
Promotorsequenz ist charakterisiert durch mehrere cis-Elemente (Fig.3), deren Anwesenheit und Wiederholungen die Funktion des Promotors beeinflussen. Die L-Box ähnliche Sequenz mit der Hexanukleotid-Sequenz CCTAAC liegt in drei Wiederholungen bei Position 2331-2342, 2117-2228 und 1916-1927 vor. Die L-Box ähnlichen Sequenzen haben alle die gleiche Orientierung in bezug auf den Transkriptionsstart und befinden sich innerhalb eines Sequenzbereichs von 420 bp.
Ein weiteres cis-Element mit der Nukleotidsequenz GCCGCC, die 'ethylene-responsive' oder GCC-Box, liegt in zweifacher Wiederholung in reverser, komplementärer Orientierung zur TATA Box bei Position 3598-3593 und Position 3081-3076 vor. Die
GCC-Box vermittelt die Aktivierung von Promotoren durch die Signalsubstanz Ethylen und wurde für die Promotoren einiger Pathogenabwehrgene beschrieben (Ohme-Takagi and Shinshi, 1995).
Eine W-Box mit der Sequenz TTGACC liegt in dreifacher Wiederholung vor. Die erste W-
Box erstreckt sich von Position 1494-1499, die zweite W-Box in reverser, komplementärer Orientierung von Position 1586-1581 und die dritte W-Box von Position 4179-4184. Charakteristisch ist auch die Anwesenheit der ersten zwei W-Boxen, eine in normaler und eine in reverser Orientierung innerhalb eines kurzen Sequenzabschnitts von 92 bp (1494- 1586). Eine dritte W-Box (4179-4184) liegt in unmittelbarer Nähe zu einem weiteren, vierten cis-Element, dem SAR-Element.
Neben den cis-Elementen, die spezifische Eigenschaften des Promotors ausmachen, enthält der Promotor die grundlegenden Nukleotidmotive, die jeder Promotor für die Bindung der basalen Transkriptionsfaktoren benötigt. Zu diesen Motiven gehören eine CAAT-Box bei Nukleotidposition 5903-5906 und eine TATA-Box bei Nukleotidposition 5912-5915.
Derivate der Nukleotid-Seguenz nach Fig. 1
Ausgehend von dem Vektor pAnja wurden durch PCR-Techniken bzw. der Nutzung singulärer Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen Derivate des Promotors erzeugt. Die dafür notwendigen Klonierungsarbeiten erfolgten nach Sambrook et al.,
1989. Diese Derivate unterscheiden sich vom 5947 bp großen Ausgangspromotor dadurch, daß sie kleiner als der Ausgangspromotor sind und nicht alle cis-Elemente aufweisen, die den Ausgangspromotor kennzeichen. Durch diese Deletionen weisen die Promotorfragmente ein neues Aktivitätsspektrum auf, die sie vom Ausgangspromotor unterscheiden. Weiterhin können durch diesen Deletionsansatz weitere, neue cis-
Elemente identifiziert werden, die für die Promotoreigenschaften relevant sind.
Für die Erzeugung der Promotordeletionsfragmente durch PCR wurden jeweils zwei Oligo-Nukleotidprimer eingesetzt (Tabelle 1). Zum einen wurde der Primer PO mit der Sequenz ACT GAC CAC CCG GGG TGG ATT TAT TG verwendet. Der Primer PO bindet von Nukleotidposition 5941-5947 des Promotors und den angrenzenden Sequenzbereichen der Multiplen Klonierungsstelle des Vektors pBluescriptll KS+. Als zweiter Primer wurden die Oligonukleotide P4480, P4047, P3017, P2661 , P2339, P1889, P1777, P1777*, P814 bzw. P368 verwendet, die an definierten Stellen innerhalb der Promotor- sequenz binden. Der Primer P4480 mit der Sequenz CCG GGT CGA CGC CGG GCC
TCC CCA AA bindet von Position 1464-1489. Der Primer P4047 mit der Sequenz TCC AAT TGT CGA CAA TAA AAT TC bindet von Position 1894-1921. Der Primer P3017 mit der Sequenz TAT AAC AAG AAG TCG ACA GGA GAA CAT ATT bindet von Position 2920-2949. Der Primer P2661 mit der Sequenz GTG AAG TCG ACT GAC AAT TTT GGC AGT CAT C bindet von Position 3282-3311. Der Primer P2339 mit der Sequenz TTA TTG AAG GTC GAC CAC TGT TTT GCA ACC bindet von Position 3600-3629. Der Primer P1889 mit der Sequenz AAT ATG TTG ACC TAT GGA AAA TAA TC bindet von Position 4054-4079. Die Primer P1777 und P1777* mit den Sequenz GTT CGA GGT CGA CCT
TTG ACC GTT AAT TAC bzw. GTT CGA GGT CGA CCT TAG ACT GTT AAT TAC binden von Position 4164-4193. Der Primer P814 mit der Sequenz AGT CAG AGG CGT CGA CAA TAG TGT GC bindet von Position 5124-5194 und der Primer P368 mit der Sequenz TAT AAT TCA TGT CGA CGT GTT AGT CCT TCC bindet von Position 5570- 5599.
Die PCR-Bedingungen lauten für die Primerpaare P0/P368, P0/P812, P0/P1777 und PO/1777* bei Verwendung von 1 ng des Plasmides pAnja, einer Primerkonzentration von 0.2 μM, 1.5 μ Taq-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) und 25 μl Reaktionsvolumen in einen Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) wie folgt:
1 x Schritt 1 : 4 min 95°C
30 x Schritt 2: 30 sec 95°C Schritt 3: 30 sec 57°C
Schritt 4: 2 min 72°C
1 x Schritt 5: 5 min 72°C
Für die Primerpaare P0/P4480, P0/P4047, P0/P3017, P0/P2661 , P0/P2339 und P0/P1889 lauten die PCR-Bedingungen bei Verwendung von 10 ng des Plasmides pAnja, einer Primerkonzentration von 0.2 μM, 1.0 u Advantage KlenTaq-Polymerase-Mix (Clontech Laboratories, Heidelberg) und 25 μl Reaktionsvolumen in einen Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) folgendermaßen:
1 x Schritt 1 : 4 min 95°C
28 x Schritt 2: 30 sec 95°C
Schritt 3: 30 sec 57°C
Schritt 4: 4 min 72°C 1 x Schritt 5: 5 min 72°C
Die Anwendung dieser PCR-Bedingungen führt mit dem Primerpaar P0/P4480 zu einem 4503 bp großen DNA-Fragment. Mit Hilfe der Primerpaare P0/P4047, P0/P3017, P0/P2661 , P0/P2339, P0/P1889, P0/P1777, P0/P1777*, P0/P814, P0/P368 werden 4073,
3047, 2685, 1913, 1800, 1800, 843 und 397 bp große DNA-Fragmente amplifiziert. Durch Einführung einer Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease Smal (CCCGGG) in den Primer PO und einer Erkennungsstelle für das Enzym Sa/I (GTCGAC) in die Primer P4480, P4047, P3017, P2661, P2339, P1889, P1777, P1777*, P814 und P368 können die amplifizierten DNA-Fragmente mit den Enzymen Smal und Sa l nachgeschnitten und gerichtet in einen Vektor kloniert werden.
Das P0/P4480 Fragment wird als Smal-Sa/I Fragment in den mit Smal und Sa/I geschnittenen Vektor pBluescriptll KS+ kloniert. Das resultierende Plasmid trägt aufgrund der Größe des Promotorfragmentes die Bezeichnung pA4480 (Tabelle 1). Entsprechend werden die PCR-Produkte P0/P4047, P0/P3017, P0/P2661 , P0/P2339, P0/P1889, P0/P1777, P0/P1777*, P0/P814, P0/P368 mit Smal und Sa/I geschnitten. Subkloniert in dem mit Smal und Sa/I geschnittenen Vektor pBluescriptll KS+ tragen die resultierenden Plasmide aufgrund der Promotorgröße die Bezeichnung pA4047, pA3017, pA2661 , pA2339 und pA1889, pA1777, pA1777*, pA814 und pA368 (Tabelle 1).
Transkriptionelle Kombination des Promotors mit einem Reportergen (gus-Gen)
Ausgehend von dem Plasmid pAnja wird der 5947 bp große Promoterbereich als transkriptionelle Fusion mit dem gus-Gen in dem Pflanzentransformationsvektor pBI101
(Laboratories, Heidelberg) kombiniert. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pAG5947 (Fig. 4). Dazu wird der Vektor pAnja zunächst mit dem Restriktionsenzym Spei (Boehringer Mannhein) linearisert und die entstehenden DNA-Enden durch eine Klenow- Behandlung aufgefüllt. Durch eine nachfolgende Sa/I-Behandlung wird das 5947 bp große Promotorfragment freigesetzt und in den zuvor mit Sa/I und Smal behandelten Vektor pBI101 inseriert. Entsprechend der beschriebenen Vorgehensweise werden die deletierten Promotorfragmente aus pA4480, pA4047, pA3017, pA2661, pA2339 und pA1889, pA1777, pA1777*, pA814 und pA368 in den Pflanzentransformationsvektor pBI101 kloniert. Die resultierenden Plasmide tragen die Bezeichnung pAG4480, pAG4047, pAG3017, pAG2661 , pAG2339, pAG1889, pAG1777, pAG1777*, pAG814 und pAG368.
Drei weitere Promotordeletionen wurden ausgehend vom Vektor pAG durch die Verwendung von Restriktionsendonukleasen konstruiert. Der Vektor pAG wurde zum einem mit den Restriktionsenzym Sa/I und partiell mit EcoRI, mit den Enzymen Sa/I und Xho\ und zum anderen mit den Enzymen Sa/I und Xbal geschnitten. Durch diesen Restriktions- verdau wurde der Promotorbereich auf die Sequenz von Nukleotid 2280-5947, Position 4874-5947 und Position 5432-5947 verkürzt entfernt. Nach dem Auffüllen der Schnittstellen durch eine Klenowbehandlung konnten die Vektoren religiert und in E.coli transformiert werden.
Der verbleibende Promotoranteil ist nach der Sa/l/EcoRI Behandlung 3667 bp, nach der Sal\lXho\ Behandlung 1074 bp und nach der Sal\IXba\ Behandlung 516 bp groß. Die entstehenden Vektoren tragen die Bezeichnung pAG3667, pAG1074 bzw. pAG516 (Fig. 4).
Modifikation des Promotors für eine translationelle Fusion mit einem Reportergen (gus- Gen)
Um den beschriebenen Promotor nicht nur transkriptionell sondern auch translationell mit dem gus-Gen kombinieren zu können, wird ein synthetisches DNA-Fragment (Fig. 5) in den Vektor pAnja kloniert. Die 95 bp große Sequenz trägt am 5 '-Ende die Erkennungs- stelle für die Restriktiosendonuklease Spei und am 3'-Ende die Erkennungsstellen für die
Enzyme Psfl und Λ/ofϊ. Die Nukleotidsequenz kodiert von Nukleotidposition 51-95 für das 5'-Ende eines Proteins. Das Fragment aus Fig. 5 wird über die Spei und Not\ Schnittstelle in den Vektor pAnja kloniert. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pAnja-trans (Fig. 6).
Für die Konstruktion der Translationsfusion mit dem gus-Gen wird der Vektor pAnja-trans mit dem Restriktionsenzym Psfl linearisiert und die überstehenden 3'-DNA-Enden werden durch T4-Polymerase-Behandlung in stumpfe Enden überführt. Der so behandelte Vektor wird nochmals mit dem Restriktionsenzym Sa/I geschnitten und das 6014 bp grosse DNA- Fragment isoliert. Das Promotorfragment wird in den Pflanzentransformationsvektor pBI101 , der zuvor mit den Restriktionsenzymen Sa/I und Smal geschnitten wurde, kloniert. Durch diese Klonierung erfährt des GUS-Enzym eine N-terminale Verlängerung von 12 Aminosäuren. Während die ersten 8 Aminosäuren von dem N-Terminus des synthetischen Fragmentes stammen, werden die Aminosäuren 9-12 von der Poly- klonierungsstelle des Vektors pBI101 kodiert. Der so konstruierte Vektor trägt die Bezeichnung pAG5947-trans (Fig. 7). Entsprechende translationelle Fusionen lassen sich auch mit den Vektoren pA4480, pA4047, pA3017, pA2661 , pA2339 und pA1889, pA1777, pA1777*, pA814 und pA368 herstellen, die anschließend nach Integration in den
Pflanzentransformationsvektor pB1101 die Bezeichnungen pAG4480-trans, pAG4047- trans, pAG3017-trans, pAG2661 -trans, pAG2339-trans, pAG1889-trans, pAG1777-trans, pAG1777*-trans, pAG814-trans und pAG368-trans tragen. Weiterhin werden ausgehend von dem Vektor pAG5947-trans in Anlehnung an die Konstruktion von pAG3667, pAG1074 und pAG516 durch Verwendung der Restriktionsenzyme Sa/I und EcoRI, Sa/I und Xho\ bzw. Sa/I und Xbal die Deletionskonstrukte pAG3667-trans, pAG1074-trans und pAG516-trans erzeugt.
Modifikation des Promotors für eine Sekretion des exprimierten Proteins in den
Apoplasten
Um mit Hilfe des Promotors auch heterologe Proteine im Apoplasten exprimieren zu können, wird der 5947 bp große Promotor transkriptioneil mit der Signalsequenz des apoplastischen Invertase-Inhibitors aus Tabak (Greiner et al., 1998) fusioniert. Zu diesem
Zweck wird der 106 bp große 5"-Bereich des Tabakinhibitors (Nt-inh1) mit Hilfe des Primer Sek1 (AGT CAC TAG TAG AAA ATC TAA CTT TGG TCT CT) und des Primer Sek2 (CAG TGC GGC CGC GCC GGC GTT TGT TTG TAA TAT AGT CA) durch PCR aus dem Plasmid pGreiner amplifiziert. Die Primer Sek1 und Sek2 binden an Position 1- 25 bzw. 83-106 des zu amplifizierenden 5'-Bereichs. Die gesamte Nukleotidsequenz des amplifizierten 131 bp großen Fragmentes ist in Fig. 8 dargestellt. Der amplifizierte 5'- Bereich umfaßt den 49 bp großen nichttranslatierten 5 '-Bereich des cDNA-Klons und die ersten 57 bp des codierenden Bereichs. Durch die Primersequenz Sek1 wird an das 5'- Ende des PCR-Produktes zusätzlich eine Erkennungsstelle für die Restriktions- endonuklease Spei (ACTAGT) und durch den Primer Sek2 an das 3'- Ende eine Erkennungsstelle für die Enzyme Λ/ael (GCCGGC) und Λ/ofl (GCGGCCGC) synthetisiert. Die PCR-Bedingungen lauten bei Verwendung von 1 ng des Plasmides pGreiner, einer Primerkonzentration von 0.2 μM, 1.5 u Taq-Polymerase (Pharmacia) und 25 μl Reaktionsvolumen in einen Multicycler PTC-200 (MJ RESEARCH, WATERTOWN, USA Research) wie folgt:
1 x Schritt 1 : 4 min 95°C 30 x Schritt 2: 30 sec 95°C
Schritt 3: 30 sec 57°C
Schritt 4: 2 min 72°C
1 x Schritt 5: 5 min 72°C
Nach Behandlung des Fragmentes mit den Enzymen Spei und Not\ wurde das Fragment in den mit Spei und Not\ linearisierten Vektor pAnja kloniert. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pAnja-sek (Fig. 9).
Die Lage der Schnittstelle von Λ/ael (GCC/GGC) wurde so gewählt, daß das GCC-Triplett identisch mit dem Triplett der letzten Aminosäure der Signalsequenz ist. Durch Klonierung des zu exprimierenden Gens in die Λ/ael Schnittstelle der Signalsequenz kann jedes beliebige Protein mit der Signalsequenz in einer funktionellen Weise fusioniert werden. Nach Umklonierung der entsprechenden Kassette bestehend aus Promotor, Signalsequenz und zu exprimierendes Gen in einen binären Vektor kann das Konstrukt in Pflanzen übertragen werden.
Lokale, elizitorinduzierte Expression des Promotors in Raps
Die für die Produktion transgener Pflanzen vorgesehenen Konstrukte werden zunächst durch ein direktes DNA-Transformationsverfahren (An, 1987) in den Agrobacterium tumefaciens Stamm C58 ATHV überführt. Die Selektion rekombinater A. tumefaciens Klone erfolgt unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin (50mg/l). Nachfolgend ist die Transformation beispielhaft für den Vektor pAG5947-trans beschrieben. Die Reportergenkassette bestehend aus der translationellen Fusion zwischen dem Promotor und dem gus-Gen und dem nos-Terminator wird mit Hilfe von A. tumefaciens nach Horsch et al. (1985) in den Sommerraps Genotyp Drakkar transformiert. Transgene
Pflanzen werden unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin selektioniert. Die Anwesenheit des Promoters in den transgenen Pflanzen kann durch PCR überprüft werden. Die Verwendung der Primer AGATTTTCTTCGTATAGCAGCCAC und GTACCATGATATGCATCATTCTCTT führt zu der Amplifikation eines 269 bp großen DNA-Fragments aus dem Promotor entsprechend der Nukleotidposition 193-461 von
Abb.1. Die PCR wird unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA, einer Primerkonzentration von 0,2 μM bei einer Annealingtemperatur von 57°C in einen Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) durchgeführt. Unter Anwendung der beschriebenen Techniken wurden mit dem binären Vektor pAG5947-trans drei un- abhängige Rapstransformanten, die die Bezeichnung AG5947-t38, AG5947-t48 und
AG5947-t49 tragen, gewonnen.
Expressionsverhalten des Promotors in transgenen Pflanzen
Elizitorinduktion des Promotors in Blättern, Sproß und Wurzeln transgener Rapspflanzen
Blätter werden von den Transformanten AG5947-t48 und AG5947-t49 sowie der nicht- transgenen Ausgangslinie Drakkar abgenommen und für die Elizitorinduktion in 120mm großen Petrischalen in 50 ml Induktionsmedium (LS-Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 6.1 , 1 μ/ml Rhizopus Pektinase EC 3.2.1.15 von Sigma Chemical CO.) oder in Kontrollmedium (LS-Medium ohne Sucrose (Linsmaier and Skoog, 1965), 5 mM MES pH 6.1) 16h bei 24°C inkubiert. Die Rhizopus Pektinase setzt aus den pflanzlichen Zellwänden pektolytische Abbauprodukte frei, die ihrerseits eine elizitierende Wirkung haben. Die Aktivität des Promotors wird durch eine quantitative Bestimmung der ß-
Glucuronidase-(GUS- Aktivität unter Verwendung des Substrates 4-Methyl-umbelliferyl- glucuronid (MUG) nach Jefferson (1987) bestimmt. Die nichttransgene Ausgangslinie Drakkar zeigt wie in Tabelle 2 dargestellt im nicht- elizitierten und im elizitierten Zustand eine spezifische Glucuronidaseaktivität von 6,68 bzw. 6,61 pMol Mu x min"1 x mg"1. Die Elizitierung führt in der nichttransgenen Linie zu keiner signifikanten Veränderung der Glucuronidaseaktivität.
Die transgenen Linien AG5947-t48 und AG5947-t49 zeigen im nichtelizitierten Zustand eine spezifische Enzymaktivität von 14,0 bzw. 138,7 pMol Mu x min-1 x mg-1 und nach Elizitierung eine Glucuronidaseaktivität von 247,6 bzw. 1507,9 pMol Mu x min-1 x mg-1. Die Glucuronidaseaktivität der transgenen Linien ist bereits im nichtelizitierten Zustand deutlich höher als bei der nichttransgenen Linie. Unter Einwirkung der Elizitierung kommt es zu einer 17,6 bzw. 16,9-fachen Erhöhung der Glucuronidaseaktivität und damit zu einer Induktion des Reportergens. Der Zuckerrüben-Promoter zeigt somit in Blättern transgener Rapspflanzen eine Elizitor- und damit Pathogeninduzierbarkeit.
Um zu prüfen, ob die Elizitorinduzierbarkeit des Promotors auch in anderen Pflanzenorganen als den Blättern gegeben ist, wurden Sproßsegmente und Wurzeln in die Untersuchungen miteinbezogen. Dazu wurden F2-Pflanzen der Transformante AG5947-t49 unter Gewächshausbedingungen angezogen. Abgetrennte Blätter und Sprosse, die in 5 cm lange Abschnitte geschnitten wurden und gereinigte Wurzeln wurden, wie bereits für Blätter beschrieben, 16 h in pectinasehaltigem Induktionsmedium oder in Kontrollmedium inkubiert. Um den Einfluß der Verwundung während der Probennahme auf das Meßergebnis bewerten zu können, wurden ganze Blätter, Sproßabschnitte und gereinigte Wurzeln auch sofort nach der Probennahme in flüssigem Stickstoff eingefroren. Wie in Tabelle 4 dargestellt, wird durch das Abtrennen der Blätter von der Pflanze, die Reporter- genaktivität in den Blättern im Vergleich zu dem Kontrollansatz um das 5,3-fache und durch die Elizitierung zusätzlich um das 72-fache erhöht. Das Abtrennen und Zerschneiden der Sproßachse führt zu einer Erhöhung der GUS-Aktivität um das 8,3-fache und durch die zusätzliche Elizitierung um das 3,5-fache. Im Fall der Wurzel wurde durch das Abtrennen der Wurzel ein 7,2-facher und durch die Elizitierung eine zusätzliche 9-fache Elizitorinduktion der Reportergenaktivität beobachtet.
Der Promotor wird in transgenen Pflanzen in Blättern, dem Sproß und den Wurzeln durch Verwundung und zusätzlich durch Elizitierung aktiviert. Induktion des Promotors in Blättern transgener Rapspflanzen durch Salicylsäure- und PMG-Elizitor
Um die Wirkung von Salicylsäure und eines gereinigten PMG-Elizitors aus der Zellwand von Phytophthora sojae (Valent, 1978) auf die Promotoraktivität zu untersuchen, werden Blattrondelle mit einem Durchmesser von 14 mm mit Hilfe eines Korkbohrers aus den Blättern von Gewächshauspflanzen ausgestanzt. Die Verwendung von Blattrondellen erleichtert die Aufnahme der Salicylsäure bzw. des Elizitors über den Wundrand in das Blattgewebe. Jeweils 10 Blattrondelle aus Blättern der Transformanten AG5947-t38 und
AG5957-t48 werden in 90 mm großen Petrischalen in salicylsäurehaltigem Medium (LS- Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 0.5 mM SA), in PMG-elzitorhaltigem Medium (LS-Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 25 μg Elizitor/ml) oder in Kontrolimedium (LS-Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0) 16h bei 24°C inkubiert. Die Aktivität des Promotors wird wie bei Jefferson (1987) beschrieben durch eine quantitative
Bestimmung der GUS-Aktivität gemessen.
Wie in Tabelle 4 dargestellt, kann für die transgenen Linien AG5947-t38 und AG5957-t48 im Kontrollmedium eine Enzymaktivität von 24,47 bzw. 1 ,86 pMol Mu x min'1 x mg"1 nach- gewiesen werden. Die Inkubation der Blattrondelle in Gegenwart von 0,5 mM SA bzw. von 25 μg/ml PMG-Elizitor führt für die Transformante AG5947-t38 zu einer Reporterenzymaktivität von 485,3 bzw. 187,0 pMol Mu x min' 1 x mg "1 und für die Transformante AG5957-t48 zu einer Enzymaktivität von 17,2 bzw. 9,3 pMol Mu x min"1 x mg"1. Damit wird die spezifische Glucuronidaseaktivität der Transformante AG5947-t38 im Vergleich zu dem Kontrollansatz durch die Salicylsäurebehandlung um das 19,8 -fache und durch den
PMG-Elizitor um das 7,7-fache gesteigert. Für die Transformante AG5947-t38 beträgt der Induktionsfaktor für Salicylsäure 9,2 und für PMG-Elizitor 5. Histochemischer Nachweis der lokalen Promoteraktivierung
Zur Beschreibung des räumlichen Expressionsverhaltens des Promotors werden Blätter der Rapstransformante AG5947-t49 verwendet. Die Blätter werden von Gewächshaus- pflanzen abgetrennt und in einer durchsichtigen Plastikkiste auf naßes Filterpapier gelegt.
In die Mitte einer jeden Blatthälfte werden 20 μl Rhizopus Pektinase (10 u/ml) und Wasser als Kontrolle pipettiert. Die Blätter werden 16 h bei 24°C inkubiert und anschließend wird die GUS-Aktivität histochemisch nachgewiesen. Dazu werden die Blätter mit GUS-Färbelösung (2 mM 5-Bromo-4-Chloro-3-lndoyl-beta-Glucuronid, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 0,5% Triton X-100, 2 % N, N,-Dimethylformamid) für 15 sec vakuuminfiltriert und anschließend für 5 h bei 37°C inkubiert. Die Blaufärbung des Gewebes zeigt die Bereiche an, in denen hohe GUS-Aktivität vorliegt. Die elizitierte Blatthälfte der Transformante AG5947-t49 zeigt wie in Fig. 10 dargestellt eine räumlich stark begrenzte Blaufärbung und damit Promotoraktivität um die Auftrags- stelle der Pektinase. Die übrigen Gewebebereiche der enzymbehandelten Blatthälfte sowie die wasserinokulierte Blatthälfte der transgenen Linie weisen keine sichtbare GUS- Aktivität auf. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Induktion des Promoters auf die Inokulationsstelle mit dem elizitorerzeugenden System beschränkt ist. Der Promotor wird in den Blättern transgener Rapspflanzen lokal durch Elizitoren induziert.
Infektion transgener Pflanzen
Der Nachweis der Pathogeninduzierbarkeit des Promotors in transgenen Pflanzen erfolgt durch Infektion von Blättern der transgenen Rapslinien AG5947-t48 und AG5947-t49 mit dem Erreger der Umfallkrankheit des Rapses, Phoma Ungarn. Pflanzen der transgenen Linien AG5947-t48 und AG5947-t49 sowie der nichttransgenen Linie Drakkar werden unter Gewächshausbedingungen aus Saatgut angezogen. Nachdem die Pflanzen ein Alter von 6 Wochen erreicht haben, werden pro Pflanze jeweils 2 gleichgroße Blätter mit einem Nagelbrett lokal verwundet, um für den Pilz eine Eintrittspforte zu schaffen. Durch
Eintauchen der verletzten Blätter in eine Sporensuspension von Phoma Ungarn (100.000 Sporen/ml) werden die Blätter inokuliert. Für Kontrollzwecke werden Blätter transgener und nichttransgener Pflanzen verwundet und nur in Wasser eingetaucht. Die Pflanzen werden anschließend für 7 Tage unter einem Folientunnel im Gewächshaus bei 25°C und 90-100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Nach 7 Tagen wird der Folientunnel entfernt und nach 10 Tagen wird wie oben beschrieben ein histochemischer Nachweis der Promotoraktivität durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt zeigen die pilzinokulierten Blätter eine 6-8 mm große nekrotische Zone um die Verwundungsstellen während die wasserbehandelten Kontrollen nur eine 1-2 mm große Verbräunungsreaktion um die Wundstelle aufweisen. Die pilzinokulierten Blätter der transgenen Pflanzen zeigen um die Infektionsstellen eine lokale Blaufärbung hervorgerufen durch die örtlich beschränkte Promotoraktivität. Die pilzinfizierten Blätter der nichttransgenen Linie Drakkar sowie die verwundeten und wasser- behandelten Blätter der nichttransgenen und der transgenen Linien hingegen weisen keine Blaufärbung und damit Reportergenaktivität auf.
Aktivitätszunahme des Promotors in nichtinduzierten und induzierten Blättern transgener Pflanzen mit zunehmenden Pflanzenalter.
Zur Untersuchung der entwicklungsabhängigen Aktivität des Promotors in transgenen Pflanzen wird der Vektor pAG5957-trans in Anlehnung an das für Raps beschriebene Protokoll in Nicotianum tabacum cv. SR1 transformiert. Die produzierten Tabak- transformanten tragen die Bezeichnung PR1-52, PR1-54 und PR1-56.
Die Transformante PR1-52 wird vermehrt und in das Gewächshaus überführt. Nachdem die Pflanze eine Grosse von ca. 20 cm erreicht hat, wird die Aktivierbarkeit des Zucker- rübenpromotors in Abhängigkeit von dem Pflanzenalter analysiert. Dazu werden 6 Blätter unterschiedlichen Alters an der Pflanze ausgewählt. Das älteste, tiefstehendste Blatt erhält die Bezeichnung 1 und das jüngste, höchste Blatt die Bezeichnung 6. Aus der
Blatthälfte eines jeden Blattes werden mit Hilfe eines 14 mm Korkbohrers jeweils 15 gleichgrosse Blattrondelle ausgestanzt. Jeweils 5 Blattrondelle werden in 90 mm großen Pethschalen in salicylsäurehaltigem Medium (LS-Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 0.5 mM SA), in PMG-elzitorhaltigem Medium (LS-Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 1 unit Elizitor/ml) oder in Kontrollmedium (LS-Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0) 16h bei 24°C inkubiert. Am nächsten Tag werden aus jeder behandelten Blatthälfte nochmals 5 Rondelle für Kontrollzwecke ausgestanzt. Die Aktivität des Promotors in diesen Rondellen sowie in den über Nacht inkubierten Rondellen wird nach Jefferson (1987) durch eine quantitative Bestimmung der GUS-Aktivität gemessen. Nach 16 Tagen wird der entsprechende Versuch mit den noch intakten Blatthälften der Blätter 1-6 wiederholt. Die Tabakpflanze ist inzwischen geschosst und ca. 50-60 cm gross. Der Vergleich der Messwerte zeigt (s. Tabelle 4b), dass die Promotoraktivität in den Kontrollblättern für 5 der 6 analysierten Blättern in der Versuchswiederholung nach 16
Tagen (t=16 d) deutlich höher ist als zu dem ersten Untersuchungszeitpunkt (t = 0 d). Die Promotoraktivität nimmt mit zunehmenden Alter in den transgenen Pflanzen zu. Die Verwundung bzw. Elizitierung bzw. Saliycalsäureanwendung führt in der Reportergenpflanze mit höherem Pflanzenalter in allen untersuchten Blättern zu einer höheren Reportergen- und damit Promotoraktivität. Das Pflanzenalter hat jedoch keinen Einfluss auf die relative Induktion des Promotors durch Verwundung, Elizitierung oder Salicyl- säuregabe.
Aktivität von Promotordeletionsfragmenten in transgenen Pflanzen
Um den Einfluss der Promotordeletionen auf die Reportergenaktivität zu untersuchen werden die Vektoren pAG516 und pAG2339 mit Hilfe von A. tumefaciens in Tabak transformiert. Die unter Verwendung von pAG516 produzierten Transformanten tragen die Bezeichnung PR4-19, PR4-21 und PR4-22 sowie die mit Hilfe von pAG2339 erzeugten transgenen Pflanzen die Bezeichnung PR8-2, PR8-3 und PR8-12.
Klonplanzen der Transformanten PR4-19, PR4-21 , PR4-22, PR8-2, PR8-3 und PR8-12 sowie der Transformanten PR1-52, PR1-54 und PR1-56 werden in das Gewächshaus überführt. Nachdem die Tabakpflanzen eine Größe von 60 cm erreicht haben werden 30- 40 Blattrondelle aus einem Blatt ausgestanzt und wie beschrieben (s. Aktivitätszunahme des Promotors in nichtinduzierten und induzierten Blättern transgener Pflanzen mit zunehmenden Pflanzenalter.) auf ihre Reaktion gegenüber Wundreiz, Wundreiz und Pektinase bzw. Wundreiz und Salicylsäure analysiert.
Die drei mit pAG5947-trans transformierten Linien PR1-52, PR1-54 und PR1-56 zeigen eine leichte Zunahme der Reportergenaktivität nach Verwundung und eine deutliche Induktion der Promotoraktivität nach Elizitierung bzw. Salicylsäureapplikation (Tabelle 4c).
Die mit dem Konstrukt pAG2339 transformierten Pflanzen (PR8-2, PR8-3, PR8-12) zeigen keine signifikante Veränderung der Reportergenaktivität nach Verwundung, Elizitierung bzw. Salicylsäuregabe. Die mit dem Konstrukt pAG516 transformierten Pflanzen PR8-2, PR8-3 und PR8-12 zeigen lediglich eine geringe SA-Induzierbarkeit vor dem Hintergrund einer im Vergleich zu den PR1 -Pflanzen sehr geringen Reportergenaktivität.
Entwicklungsabhängige Aktivität des Promotors in nichtinfizierten Zuckerrüben
Zur Untersuchung der Aktivität des Promotors in den verschiedenen Organen der Zuckerrübe während der Pflanzenentwicklung wird Zuckerrübensaatgut im Feld ausgelegt. Im Verlauf einer mitteleuropäischen Vegetationszeit werden 4, 6, 10, 12, 16 und 22 Wochen nach der Aussaat jeweils 5 vollständige Zuckerrübenpflanzen geerntet. Die
Pflanzen zeigen zu keinem Zeitpunkt Krankheitserscheinungen. Gesamtzell-RNA wird nach Logemann et al. 1987 aus den Organen "sink" und "source" Blatt, Petiole, Seitenwurzel und Pfahlwurzel (Rübenkörper) isoliert. Die Aktivität des Promotors wird durch eine RNA-Blot Analyse bestimmt. Als Hybridisierungssonde wird ein Teil des sich an den Promotor anschließenden codierenden Bereichs verwendet. Dazu wird ein 1800 bp großes genomisches DNA-Fragment durch "inverse polymerase chain reaction (IPCR)" aus dem Pflanzengenom des Genotyps 1K0088 amplifiziert.
Die Klonierung der 1800 bp großen Hybridisierungssonde durch IPCR erfolgt in An- lehnung an die Arbeit von Does et al. (1991). Dazu wird zunächst genomische Pflanzen-
DNA aus Blättern des Genotyps 1K0088 entsprechend Saghai-Maroof et al. (1984) isoliert. Die genomische DNA (100 ng) wird mit der Restriktionsendonuklease ßg/ll geschnitten, mit Phenol/Chloroform extrahiert und ethanolgefällt. Die DNA wird anschließend in Ligationspuffer (Life Technologies GmbH, Karlsruhe) aufgenommen und in einem Gesamtvolumen von 15 μl in Gegenwart von 1 u T4 DNA Ligase (Life
Technologies GmbH, Karlsruhe) für 4 h bei 16°C entsprechend den Herstellerangaben religiert. Um einen Teil des sich an den 3'-Bereich des Promotors anschließenden codierenden Bereichs zu klonieren, wird eine PCR durchgeführt. Zu diesem Zweck wird der Oligonukleotidprimer R1 mit der Sequenz GTG GCT GCT ATA CGA AGA AAA TCT und der Primer R2 mit der Sequenz ACA CTA TTA TCT ACG CCT CTG ACT für die
PCR eingesetzt. Der Primer R1 bindet von Position 5732-5755 der Nukleotidsequenz von Abb.1 und damit 192 bp entfernt vom Transkriptionsstartpunkt des Promotors. Der Primer R2 bindet von Position 5148-5124 der Nukleotidsequenz von Abb. 1 und damit 254 bp hinter der einzigen Sg/Il Schnittstelle des Promotors. Die PCR Bedingungen lauten bei Verwendung von 5 μl des Ligationsansatzes, einer Primerkonzentration von 0.2 μM, 1.0 u Advantage KlenTaq-Poiymerase-Mix (Clontech Laboratories, Heidelberg) und 25 μl Reaktionsvolumen in einem Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, MA., USA) folgendermaßen:
1 x Schritt 1 : 4 min 95°C
35 x Schritt 2: 30 sec 95°C Schritt 3: 30 sec 57°C
Schritt 4: 4 min 72°C
1 x Schritt 5: 5 min 72°C
Die Anwendung dieser PCR-Bedingungen führt mit dem Primerpaar R1/R2 zu einem 1800 bp großen DNA-Fragment. Dieses DNA-Fragment kann mit Standardmethoden
(Sambroock et al., 1989) in dem Vektor pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wl., USA) subkloniert und das klonierte Fragment als Hybridisierungssonde eingesetzt werden.
Für die Untersuchung der entwicklungsabhängigen Promotoraktivität durch einen RNA-
Blot werden jeweils 10 μg Gesamtzell-RNA pro Organ und Zeitpunkt in einem denaturierenden Formaldehyd-Agarosegel, wie bei Sambrook et al. (1989) beschrieben, aufgetrennt. Die elektrophoretisch aufgetrennte RNA wird durch Kapillar-Blot Technik (Sambrook et al., 1989) auf eine Hybond N Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) übertragen. Die radioaktive Markierung von 20 ng des 1800 bp grossen
DNA-Fragmentes mit 50 μCi 32P-dATP (6000 Ci/mMol, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) erfolgt mit Hilfe des Prime-It II Random Primer Kit (Stratagene GmbH, Heidelberg) entsprechend der Herstellerangaben. Die anschließende Hybridisierung des RNA-Filters mit der markierten Sonde geschieht in 20 ml Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5 x SSC, 5 x Dendardts, 1% SDS, 0,1 mg Heringssperma-DNA, 40 mM
Natriumphosphatpuffer pH 6,8) bei 42°C in einem Hybridisierungsofen (Biometra GmbH, Göttingen) nach Sambrook et al. 1989. Nach der Hybridisierung wird die Nylonmembran auf einem Röntgenfilm (Kodak BioMax MS, Kodak AG, Stuttgart) in Gegenwart einer Verstärkerfolie (Kodak BioMax MS Intensifying Screen, Kodak AG, Stuttgart) 6-24 h bei 80°C exponiert. Die Entwicklung des Röntgenfilm geschieht in Röntgenfilm-Entwickler und Röntgenfilm-Fixierer (Tetenal Photowerk GmbH und Co., Norderstedt).
Der RNA-Blot zeigt, daß der Promotor im Feld unter Nichtbefallsbedingungen in 4, 6, 10,
12, 16 und 22 Wochen alten Zuckerrüben in Abhängigkeit vom Entwicklungszustand in den einzelnen Pflanzenorganen unterschiedlich stark aktiv ist (Abb. 11). Der RNA-Blot wurde mit einem Phosphoimager (Bioimaging Analyzer BAS 1000, Fujiy Japan) ausgewertet, um die Transkriptakkumulation zu quantifizieren. Die Daten der Quantifizierung sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
Die Akkumulation eines mit der durch IPCR-Sonde nachweisbaren Transkriptes und damit die Promotoraktivität ist in den Blättern von 4 Wochen alten Pflanzen nur schwach ausgeprägt, nimmt mit zunehmendem Alter der Pflanzen zu und erreicht nach 22 Wochen ein Maximum. Dieser altersabhängige Anstieg der Expression gilt sowohl für "sink-" als auch für "source"- Blätter. So beträgt die Transkriptmenge in "source"- Blättern nach 22
Wochen das 28-fache im Vergleich zur Transkriptmenge nach 4 Wochen. Für die "sink"- Blätter läßt sich nach 22 Wochen eine 14-fach höhere Transkriptmenge als nach 4 Wochen feststellen. Die Transkriptmengen in den 16 bzw. 22 Wochen alten Blättern liegen deutlich über den Mengen, die zu irgendeinem Zeitpunkt in den anderen unter- suchten Organen gefunden werden können. Im Gegensatz zu den Blättern unterliegt die
Aktivität des Promotors in den Wurzeln, Seitenwurzeln und Petiolen über die gesamte Vegetationszeit (4-22 Woche) keinen großen Schwankungen. In der Pfahlwurzel ist die Transkriptmenge zum Zeitpunkt 4. Woche so gering wie in den Blättern, steigt bis zur 6. Woche auf das Doppelte an und fällt danach bis zur 16 Woche kontinuierlich ab, um bis zur 22. Woche wieder auf 2,7-fache des 4. Wochen-Wertes anzusteigen. Die Transkriptmenge in den Seitenwurzeln steigt von der 6. bis zur 10. Wochen leicht an und fällt dann bis zur 22. Woche unter den 4. Wochen-Wert ab. In der Petiole bleibt die Transkriptmenge zwischen der 4-16. Woche konstant, um dann bis zur 22. Woche deutlich abzufallen. Die Promotoraktivität ist in den Petiolen bis zur 12. Woche im Vergleich zu den anderen Organen am höchsten. Während die Transkriptmenge in den "sink"-Blättem jedoch kontinierlich und in den "source"-Blättern ab der 12. Woche mit dem Pflanzenalter stark ansteigt, ist dieser Alterseffekt für die Petiolen nicht zu beoabachten. Expressionsverhalten unter Befallsbedingungen in Zuckerrüben
Aktivierung des Promotors in Zuckerrübenblättern korreliert mit dem Befall durch den Blattfleckenerreger Cercospora beticola
Für die Infektion von Zuckerrüben mit dem Blattfleckenerreger C. beticola werden Zuckerrüben des toleranten Genotyps 1 K0088 und des anfälligen Genotyps 3S0057 unter Gewächshausbedingungen angezogen. Zwei Wochen vor der geplanten Inokulation werden 20 V8-Gemüsesaftplatten (40% Albani-Gemüsesaft) mit vier verschiedenen C. beticola Isolaten beimpft und bei 25°C inkubiert. Unmittelbar vor der Inokulation wird der pilzbewachsene Agar zusammen mit 0,5 I Wasser in einem Hochleistungsrührwerk (UM5 Universal, Stephan) homogenisiert. Die Konzentration an Myzelfragmenten und Pilzsporen in dem Homogenat wird mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt. Die Inokulum- dichte wird durch Verdünnen mit Wasser auf eine Konzentration von 100.000 Fragmente/ml eingestellt. Das verdünnte Homogenat wird mit Hilfe einer Rückenspritze
(Gloria 176T) auf die 12 Wochen alten Zuckerrüben gesprüht. Zu Kontrollzwecken werden Pflanzen mit einem pilzfreiem Agarhomogenat besprüht. Die Pflanzen werden nach der Inokulation für 4 Tage bei 25°C und 95% Luftfeuchtigkeit in einem Gewächshaus inkubiert. Nach dem vierten Tag wird die Luftfeuchtigkeit auf 60-70 % reduziert. Vier, sieben und neun Tage nach der Inokulation werden Blätter von den pilz- und agar- inokulierten Pflanzen abgenommen und in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Danach wird Gesamtzell-RNA nach Logeman et al. 1987 isoliert. Die Aktivität des Promotors in den Blättern wird durch eine RNA-Blot Analyse bestimmt. Als Hybridisierungssonde wird das durch IPCR klonierte 1800 bp große genomische DNA-Fragment eingesetzt, das einen Teil des sich an den Promotor anschließenden kodierenden Bereich des Gens enthält.
Die Aktivierung des Promotors ist, wie in Fig. 12 dargestellt, in Blättern bereits 4 Tage nach der Inokulation in noch symptomfreien Blättern (-) nachzuweisen. Mit dem Auftreten der Schadsymptome (nach 7 bzw. 9 Tagen) (+ bzw. ++) kommt es zu einer drastischen Akkumulation eines spezifischen Transkriptes. Hierbei ist in stärker befallenen Blättern eine höhere Transkript-Akkumulation zu beobachten als in schwächer befallenen Blättern.
Die Korrelation zwischen Genexpression und Befallsgrad gilt sowohl für den C. beticola toleranten (1 K0088) als auch für C. beticola anfälligen Genotyp (3S0057). Toleranter und anfälliger Genotyp unterscheiden sich jedoch in der Expressionshöhe des Gens in gesunden Blättern. Während eine schwache konstitutive Expression des Gens in gesunden Blättern des toleranten Genotyps zu beobachten ist, ist eine Genexpression in den gesunden Blättern des anfälligen Genotyps nicht nachweisbar.
Schnelle Aktivierung des Promotors in kleinen und großen Rübenblättern in der frühen Infektionsphase nach C. beticola Befall.
Um die Aktivierung des Promotors in Zuckerrübenblättern während der frühen Infektions- phase zu analysieren wurden Zuckerrüben des Genotyps 1K0088 in einem Versuchsfeld aus Saatgut angezogen. Jeweils eine Versuchsparzelle mit 96 Pflanzen, die 12 Wochen alt sind, wurde mit einem C. beticola Agar Gemisch bzw. zu Kontrollzwecken nur mit einem Agargemisch inokuliert. Unmittelbar nach der Inokulation und anschließend im täglichen Abstand wurden kleine Blätter (Blattlänge <10 cm) und große Blätter (Blattlänge >20 cm) von den pilzinokulierten und den nur agarinokulierten Pflanzen abgenommen, sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren anschließend bei -80°C eingelagert. Gesamtzell-RNA wurde wie beschrieben isoliert und eine RNA-Blot Analyse durchgeführt. Die entsprechenden RNA-Blots wurden mit einem Phosphoimager (Bio-imaging Analyzer BAS 1000, Fujiy Japan) ausgewertet, um die Transkriptakkumulation zu quantifizieren. Pro Zeitwert und für jeden Blattyp wurde aus den Transkriptmengen, die für Kontroll- und für die infizierten Pflanzen ermittelt wurden, ein Induktionsfaktor berechnet (Tabelle 6). Dieser Induktionsfaktor ist ein Maß für die Aktivierung des Promotors durch Pilzbefall. Die Aktivität des Promotors wurde sowohl in kleinen als auch in großen Blättern schnell induziert. Bereits nach dem 1. Tag, dem ersten Meßzeitpunkt nach der Inokulation, wurde eine 3,8-fache Induktion des Promotors in großen Blättern beobachtet. In kleinen Blättern war eine 5,2-fache Induktion erst am 2. Tag zu beobachten. Eine lichtmikroskopische Untersuchung der Blattoberfläche zeigte, daß die Pilzhyphen erst am 4. Tag nach der Inokulation auf den Blättern auswachsen. Diese Beobachtung legt den Schluß nahe, daß bereits am 1. bzw. 2 Tag Signalsubstanzen des Pilzes erkannt und zur frühen Aktivierung des Promotors führen.
Nach der ersten Aktivierung des Promotors läßt sich in beiden Blattypen wenn auch zeitversetzt ein ähnliches transientes Aktivitätsverhalten beobachten. Die Promotoraktivität fällt am 2. Tag in den großen Blättern und am 3. Tag in den kleinen Blättern stark ab, um dann in den großen Blättern am 3. Tag und in den kleinen Blättern am 4. Tag wieder auf 3,5- bzw. 5,3-fache der Kontrollpflanzen anzusteigen. Nach diesem erneuten Anstieg fällt die Aktivität ein zweites Mal in den großen Blättern am 4.Tag und in den kleinen Blättern am 5. Tag ab. Danach steigt die Promotoraktivität bis zum 6.Tag in den kleinen Blättern wieder auf das 2,2-fache und in den großen Blättern auf das 3,4-fache an. Am 7. Tag ist die Promotoraktivität sowohl für die kleinen als auch für die großen Blättern in den infizierten Pflanzen nicht viel höher als in den nichtinfizierten Pflanzen. Mit dem Auftreten erster sichtbarer Schadsymptome am δ.Tag kommt es dann in den ausschließlich unter- suchten großen Blättern zu einer steten Zunahme der Promotoraktivität, die mit einer 26- fach höheren Aktivität in den infizierten Pflanzen am 10. Tag das Maximum in dieser Untersuchung darstellt.
Vergleich der Promotoraktivität verschiedener Zuckerrübengenotypen nach der Entwicklung einer C. beticola Infektion.
Drei verschiedene Zuckerrübengenotypen wurden unter Feldbedingungen mit C. beticola infiziert bzw. zu Kontrollzwecken nur mit Agar behandelt, um die Aktivität des Promotors während der sichtbaren Etablierung der Battfleckenkrankheit zu untersuchen. Die Genotypen sind neben der Linie 1K0088, der Spenderpflanze für den Promotor, die Linien 4T0057 und 9B3734. Große Blätter (> 20 cm) wurden unmittelbar vor der Inokulation (0. Tag) bzw. 10, 14 , 17 und 21 Tage nach der Inokulation von jedem Genotyp geerntet und bei -80°C eingefroren. Gesamtzell-RNA wurde für jeden Zeitpunkt aus den Blattproben isoliert und eine RNA-Blot Analyse durchgeführt. Die Transkriptmenge wurde mit Hilfe eines Phosphoimagers quantitativ bestimmt. Die relative Transkriptmenge war, wie in Tabelle 7 dargestellt, für den Genotyp 1K0088 sowohl in den Kontroll- als auch in den infizierte Pflanzen zu jedem Zeitpunkt höher als in den Pflanzen der Genotypen 4T0057 und 9B3734. Rhizoctonia solani
Für die Infektion von Zuckerrüben mit dem Wurzelpathogen Rhizoctonia solani werden Zuckerrüben des Genotyps 1 K0088 zunächst in einem Versuchsfeld aus Saatgut ange- zogen. Die Anzucht im Feld garantiert die Ausbildung einer kräftigen Hauptwurzel, die bei der Anzucht unter Gewächshausbedingungen nicht gegeben ist. Nach 3 Monaten werden die Pflanzen vorsichtig ausgegraben, einzeln in erdgefüllte 10 I Plastikeimer überführt und für weitere 2 Monate im Gewächshaus kultiviert.
Die Pilzinfektion erfolgt an 5 Monate alten Zuckerrüben in einer Phytozelle. Dazu werden jeweils 5 Löcher mit einem Durchmesser von 1 cm in 5 cm Abstand um die Rübe in die Erde gedrückt. Die Löcher werden mit R. solani bewachsenen Gerstenmehl gefüllt. Im Fall der Kontrollpflanzen werden die Inokulationslöcher nur mit Gerstenmehl gefüllt. Die Pflanzen werden bei 25°C, guter Bewässerung und einem 16/8 stündigen Licht/Dunkelwechsel inkubiert.
Nach 14, 20 und 45 Tagen werden jeweils 3 pilzinokulierte und 3 Kontrollpflanzen ausgegraben und die Rübenkörper gesäubert. Während die infizierten Pflanzen nach 14 Tagen noch symptomfrei waren, zeigten sie nach 20 bzw. 45 Tagen deutliche unter- irdische Krankheitssymptome. Die Peripherie der Rübenkörper war durch eindringende
Pilzhyphen im Durchschnitt 1 bzw. 3 cm tief verbräunt. Die Kontrollpflanzen hingegen zeigten zu keinem der untersuchten Zeitpunkte Krankheitssymptome. Aus jedem Rübenkörper wurde eine 1 cm dicke Gewebescheibe herausgeschnitten. Die Rübenscheiben der infizierten und nichtinfizierten Pflanzen wurden jeweils zu einer Mischprobe zusammengefaßt und Gesamtzell-RNA wurde nach Logemann et al. (1987) isoliert.
Jeweils 10 μg Gesamtzell-RNA wurden durch einen RNA Blot Analyse untersucht. Die anschließende Hybridisierung zeigte, daß in den Kontrollpflanzen nach 14, 20 und 45 Tagen keine Transkripte nachzuweisen waren (Fig. 13). Im Fall der infizierten Pflanzen konnten erste Transkripte nach 20 Tagen nachgewiesen werden. Die Transkriptbildung nach 45 Tagen war noch deutlicher ausgebildet. Zum Zeitpunkt 14 Tage waren keine
Transkripte nachweisbar. Der Zeitpunkt und die Intensität der Transkriptbildung korreliert mit dem Ausmaß der sichtbaren Krankheitssymptome, d. h. der Promotor wird durch R. so/an/-Befall spezifisch in der Rübenwurzeln induziert. Ein stärkerer Pilzbefall führt zu einer stärkeren Aktivierung des Promotors in der Pflanze.
Aktivierung des Promotors in Blättern von Zuckerrüben durch Verwundung und
Salicylsäure
Um die Reaktion des Promotors in Zuckerrübenblättern auf abiotische Reize wie Verwundung bzw. auf die Wirkung von Resistenzinduktoren wie Salicylsäure zu untersuchen, wurden Blattrondelle (1 cm Durchmesser) aus 12 Wochen alten Zuckerrüben mit Hilfe eines Korkbohrers ausgestanzt. Jeweils 100 Blattrondelle wurden in Kontrollmedium (LS- Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0) oder in salicylsäurehaltigem Medium (LS- Medium ohne Sucrose, 5 mM MES pH 7.0, 2.0 mM SA) 16 h bei 24°C inkubiert. Gesamtzell-RNA wurde isoliert und eine RNA-Blot Analyse wie zuvor beschrieben durch- geführt. Die Intensität der Hybridisierungssignale auf dem RNA-Blot wurde mit Hilfe eines
Phosphoimager quantifiziert. Die Promotoraktivität der Rondelle in dem Kontrollansatz ist über die Versuchszeit nicht konstant (Tabelle 8). Bezogen auf den 0 h-Wert fällt die Promotoraktivität im Kontrollansatz nach 3 h leicht ab, um dann über 6 h und 11 h bis zum 24 h Wert anzusteigen. Nach 24 h ist die Transkriptmenge im Kontrollansatz ca. 3 fach höher als zu Versuchsbeginn (0 h). Dieser Anstieg der Promotoraktivität ist auf die mit dem Ausstanzen der Blattrondelle verbundene Verwundung des Blattgewebes zurückzuführen. Der Promotor zeigt somit eine Wundinduzierbarkeit in den Blättern. In dem salicylsäurehaltigen Medium kommt es ebenfalls zu einem Anstieg der Transkriptmenge in Abhängigkeit von der Zeit (Tabelle 8). Allerdings ist die Transkriptmenge ab- gesehen von dem Zeitpunkt 0 h zu allen anderen Versuchszeitpunkten deutlich höher als in den Kontrollansätzen. So beträgt die Transkriptmenge nach 24 h ca. das 8,5-fache der 0 h-Wertes. Ursache für die höhere Aktivität des Promotors in dem salicylsäurehaltigem Medium ist eine Induzierbarkeit des Promotors durch Salicylsäure. Tabelle 1
Übersicht über die durch PCR-Techniken erzeugten Promotorderivate
Bezeichnung und Bezeichnung und Plasmidbezeichnung und
Bindungsstelle der Primer in Grosse der PCR- Sequenzbereich der der Promotorsequenz von Produkte (in Promotorderivate nach
Abb.1 Klammern) Subklonierung des nebenstehenden PCR- Produktsl
PO (5941-5947)
P4480 (1464-1489) P0/P4480 pA4480, 1468-5947 (4503 bp)
P4047 (1894-1921) P0/P4047 pA4047, 1901-5947 (4073 bp)
P3017 (2920-2949) P0/P3017 pA3017, 2931-5947 (3047 bp)
P2661 (3282-3311) P0/P2661 pA2661 , 3286-5947 (2685 bp)
P2339 (3600-3629) P0/P2339 pA2339, 3609-5947 (2366 bp)
P1889 (4054-4079) P0/P1889 pA1889, 4059-5947 (1913 bp)
P1777 (4164-4193) P0/P1777 pA1777, 4171-5947 (1800 bp) 1777* (4164-4193) P0/P1777* pA1777*, 4171-5947 (1800 bp)
P814 (5124-5194) P0/P814 pA814, 5134-5947 (843 bp)
P368 (5570-5599) P0/P368 pA368, 5580-5947 (397 bp)
1 PCR-Fragmente wurden mit den Restriktionsendonukleasen Sall und Smal geschnitten und in den mit Sa/I und Smal behandelten Vektor pBluescriptll KS+ kloniert. Tabelle 2
Elizitorinduzierbarkeit des Zuckerrüben-Promotors in transgenen Rapspflanzen
Blätter von transgenen (Transformationsvektor AG5947-t) und nichttransgenen Gewächshauspflanzen werden in Gegenwart (Induktionsmedium) oder Abwesenheit (Kontrollmedium) eines elizitorfreisetzenden Enzyms 16 h inkubiert. Die Aktivität des Promotors wird durch eine quantitative Bestimmung der ß-Glucuronidaseaktivität gemessen.
Genotyp Kontrollmedium Induktionsmedium Induktions¬
Spezifische GUS- Spezifische GUS- faktor
Aktivität Aktivität
(pMol Mu x min"1 x (pMol Mu x min"1 mg"1) x mg"1)
Nichttransgene 6,68 6,61 1 ,0
Linie Drakkar
AG5947-t48 14,0 247,6 17,7
AG5947-t49 138,7 1507,9 16,9
Tabelle 3
Aktivierung des Promotors in Blättern, Sproß und Wurzeln der transgenen Rapslinie AG5947-t49 nach Verwundung und Elizitierung durch Pektinase.
Kontrolle Abgetrennt Abgetrennt+ WundElizitor¬
Elizitor induktion2 induktion3
Spez. GUS- Spez. GUS- Spez. GUS-
Aktivitätl Aktivitätl Aktivitätl
Blatt 14,3 75,5 5404,0 5,3 72,0
Spross 158,0 1315,4 4546,3 8,3 3,5
Wurzel 72,0 520,0 4714 7,2 9,0
1 Spezifische gus-Aktivität: pMol Mu x min 1 x mg"1
2 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der abgetrennten Blätter zu der spez. Aktivität der Kontrollblätter.
3 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der abgetrennten Blätter zu der spez. Aktivität der abgetrennten und elizitierten Blätter.
Tabelle 4
Induktion des Zuckerrüben-Promotors in Blättern transgener Rapspflanzen durch
Salicylsäure- 1 und PMG-Elizitor
AG5947-t38 AG5947-t48
Spezfische Induktion Spezifische Induktion
GUS-Aktivität1 GUS-Aktivität1
Kontrolle 24,47 1,86
SA (0,5 mM) 485,3 19,8 17,2 9,2
PMG-Elizitor 187,0 7,7 9,3 5,0
(25 μg/ml)
Spezifische GUS-Aktivität: pMol Mu x min'1 x mg"
Tabelle 4b
Anstieg der Promotoraktivität in Blättern einer transgenen PR1-52 Tabakpflanze mit zunehmenden Pfanzenalter.
Kontrolle Abgetrennt Abgetrennt Abgetrennt Wund- Elizitor- SA-
+ Elizitor + SA Induktion1 Induktion2 Induktion3
Spez.GUS- Spez.GUS- Spez. GUS- Spez. GUS-
Aktivität* Aktivität* Aktivität* Aktivität*
Blatt 1 t = 0 d 59,46 238,00 327,9 314,92 4,0 5,5 5,3 t = 16 d 28,25 325,17 394,28 861 ,82 11 ,5 14,0 30,5
Blatt 2 t = 0 d 14,98 116,37 130,17 205,53 7,8 8,7 13,6 t = 16 d 76,75 160,12 1166,49 2358,18 2,1 15,2 30,7
Blatt 3 t = 0 d 10,38 83,31 270,19 225,07 8,0 26,0 21 ,7 t = 16 d 63,38 204,38 863,05 555,62 3,2 13,6 8,8
Blatt 4 t = 0 d 4,59 48,87 172,53 117,97 10,6 37,6 25,7 t = 16 d 35,06 141,6 482,88 1561,3 4,0 13,8 44,5
Blatt 5 t = 0 d 4,78 58,24 185,6 140,37 12,2 38,8 29,4 t = 16 d 134,96 426,23 512,63 1220,71 3,2 3,8 9,0
Blatt 6 t = 0 d 0,33 37,11 121 ,41 106,35 111 ,5 364,6 319,4 t = 16 d 21,33 146,74 1069,58 1003,47 6,9 50,1 47,0
'Spezifische GUS-Aktivität: pMol Mu x min-1 x mg"1 1 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der abgetrennten Blätter zu der spez. GUS- Aktivität der frisch geernteten Kontrollblätter. 2 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der frisch geernteten Kontrollblätter zu der spez. GUS-Aktivität der abgetrennten und elizitierten Blätter.
3 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der frisch geernteten Kontrollblätter zu der spez. GUS-Aktivität der abgetrennten und Salicylsäure behandelten Blätter.
Tabelle 4c
Promotoraktivität der Deletionskonstrukte pAG 516 und pAG2339 sowie der translationeilen Fusion pAG5947-trans in Blättern transgener Tabakpflanzen. Die Pflanzen PR1-52, PR1-54 und PR1-56 wurden mit dem Konstrukt pAG5947-trans transformiert. Weiterhin wurden die Pflanzen PR4-19, PR4-21 und PR4-22 mit pAG516 und die Pflanzen PR8-2, PR8-3 und PR8-12 mit dem Konstrukt pAG2339 transformiert. SR1 ist die nichttransgene Ausgangslinie.
Kontrolle Abgetrennt Abgetrennt Abgetrennt Wund- ElizitorSA-
+ Elizitor + SA Induktion1 induktion2 Induktion3
Spez.GUS- Spez. GUS- Spez. GUS- Spez. GUS-
Aktivität* Aktivität* Aktivität* Aktivität*
PR1-52 15,1 35,96 199,21 218,93 2,4 13,2 14,5
PR1-54 20,87 43,29 216,38 167,83 2,1 10,4 8,0
PR1-56 80,07 475,82 938,61 661,19 5,9 11,7 8,3
PR4-19 7,4 2,9 4,0 16,6 0,4 0,5 2,3
PR4-21 36,6 38,8 23,7 21 ,3 1 ,1 0,7 0,6
PR4-22 5,4 2,7 4,0 19,3 0,5 0,8 3,6
PR8-2 8,4 0 0 1 ,7 0 0 0,2
PR8-3 26,9 31 ,0 0 0 1,2 0 0
PR8-12 0 5,3 0 0 0 0 0
SR1 7,9 0 2,8 6,2 0 0,4 0,8
* Spezifische GUS-Aktivität: pMol Mu x min"1 x mg"1 1 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der abgetrennten Blätter zu der spez. GUS- Aktivität der frisch geernteten Kontrollblätter.
2 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der frisch geernteten Kontrollblätter zu der spez. GUS-Aktivität der abgetrennten und elizitierten Blätter. 3 Verhältnis der spezifischen GUS-Aktivität der frisch geernteten Kontrollblätter zu der spez. GUS-Aktivität der abgetrennten und Salicylsäure behandelten Blätter. Tabelle 5:
Vergleich der entwicklungsabhängigen Aktivität des Promotors in 5 verschiedenen Organen der Zuckerrübe
Gesamtzell-RNA wurde nach der Aussaat zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten (4, 6, 10 12, 16, 22 Wochen) aus "sink"- und "source"-Blättem, aus Petiolen, Pfahlwurzeln und Seitenwurzeln von Zuckerrüben isoliert und durch eine RNA-Blot Analyse untersucht. Als Hybridisierungssonde wurde ein 1800 bp großes durch IPCR gewonnenes DNA- Fragment eingesetzt. Die durch die Promotoraktivität gebildete Transkriptmenge wurde mit Hilfe eines Phosphoimager quantifiziert und in der Tabelle für jeden Versuchszeitpunkt dargestellt.
Organ 4 6 10 12 16 22
Wochen Wochen Wochen Wochen Wochen Wochen "source" 43 98 ΪÖ9 86 774 1191
Blatt
"sink" 362 44 74 136 356 502
Blatt
Petiole n.b.3 162 195 198 201 61
Pfahl- 49 100 78 38 42 132 wurzel
Seiten- n.b.3 83 140 62 74 46 wurzel
1 Als "source" Blatt wurde bei den 4 Wochen alten Zuckerrüben das erste Blattpaar gewählt.
2 Als "sink" Blatt wurden bei den 4 Wochen alten Zuckerrüben die Keimblätter ausgewählt.
3 n.b. = nicht bestimmt. Tabelle 6
Induktion des Zuckerrüben-Promoters in kleinen und grossen Zuckerrübenblättern nach
Cercospora beticola Befall
Gesamtzell-RNA aus pilzinokulierten und Kontrollpflanzen wurde durch eine RNA-Blot Analyse untersucht. Die durch die Promotoraktivität gebildete Transkriptmenge wurde mit Hilfe eines Phosphoimager quantifiziert. Der Quotient aus der Transkriptmenge der Kontrollpflanzen und der Transkriptmenge der inokulierten Pflanzen wurde als Induktionsfaktor bezeichnet (1 = keine Induktion, 2 = zweifache Transkriptmenge usw. ).
Zeitpunkt nach Kleine Blätter (< 10 cm) G Grrooßße Blätter (>20 cm)
Inokulation Induktionsfaktor Indul
(Tage)
0 1 ,1 1 ,5
1 1 ,0 3,8
2 5,2 1 ,4
3 1,1 3,5
4 5,3 1 ,6
5 1 ,6 2,0
6 2,2 3,4
7 1 ,1 1 ,1
8 1 ,9
9 2,9
10 26,0 Tabelle 7
Vergleich der Aktivität verschiedener Allele des Promotors in drei verschiedenen
Zuckerrübengenotypen nach Cercospora beticola Befall
Gesamtzell-RNA aus pilzinokulierten und Kontroll pflanzen wurde durch eine RNA-Blot Analyse untersucht. Die durch die Promotoraktivität gebildete Transkriptmenge wurde mit Hilfe eines Phosphoimager quantifiziert und in der Tabelle für jeden Versuchstag dargestellt. Die Ergebnisse der Kontrollpflanzen sind mit (-) und die Ergebnisse der pilzinokulierten Pflanzen mit (+) gekennzeichnet, n.b. = nicht bestimmt.
Genotyp 0 10 14 17 21
Tage Tage Tage Tage Tage
4T0057 (-) 3231 332 225 254 633
4T0057 n.b. 756 790 1920 3444
(+)
9B3734 (-) 265 277 432 576 477
9B3734 n.b. 781 6303 7653 10685
(+)
1K0088(-) 1753 n.b. 787 4492 2762
1K0088 n.b. n.b. 10152 8537 22598
(+)
Messwerte sind in PSL (photo stimulated Iuminescence)-Einheiten angegeben.
Tabelle 8
Aktivierung des Promotors in Blättern von Zuckerrüben durch Verwundung und Salicylsäure
Blattrondelle von Zuckerrüben wurden entsprechend der angegebenen Zeitdauer in Flüssigmedium in Gegenwart und in Abwesenheit von 2,0 mM Saliyclsäure inkubiert. RNA wurde aus den Rondellen isoliert und eine RNA-Blot Analyse durchgeführt. Die durch die Promotoraktivität gebildete Transkriptmenge wurde mit Hilfe eines Phospho- imager quantifiziert und in der Tabelle für jeden Versuchszeitpunkt dargestellt.
Zeit Kontrolle Kontrolle +
(h) 2,0 mM Salicylsäure
0 1071 81
3 61 107
6 214 284
11 211 513
24 339 688
Messwerte sind in PSL (photo stimulated Iuminescence)-Einheiten angegeben.
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Claims

Patentansprüche
1. Nukleotid-Sequenz zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogen- befall, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotid-Sequenz mindestens zwei verschiedene cis-Elemente, ausgewählt aus der Gruppe der cis-Elemente a) L-Box oder L-Box ähnliche Sequenz mit der Hexanukleotid-Sequenz CCTAc/aC b) GCC-Box c) W-Box enthält und die Eigenschaft eines Promotors besitzt.
2. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne cis- Elemente in Wiederholungen, unabhängig von ihrer Orientierung auf dem Nukleotid- Doppelstrang, vorliegen.
3. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cis- Element a) in dreifacher Wiederholung vorliegt.
4. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das cis- Element b) zweifach und in reverser, komplementärer Orientierung zur TATA-Box vorliegt.
5. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das cis- Element c) zweifach, einmal in normaler und einmal in reverser, komplementärer Orien- tierung, vorliegt.
6. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotid-Sequenz ein weiteres cis-Element enthält, welches für eine Salicylsäure- Induzierbarkeit verantwortlich ist.
7. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem weiteren cis-Element um ein Fragment handelt, das ein SAR-Element enthält.
8. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich das SAR- Element in reverser, komplementärer Orientierung in direkter Nähe zu einer W-Box befindet.
9. Nukleotid-Sequenz (Seq. ID. No. 1) gemäß Fig. 1 oder eine von dieser abgeleitete
Sequenz.
10. Derivate einer Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 9, dadurch erhältlich, daß man ausgehend von einer Sequenz gemäß Fig. 1 eine Subklonierung und anschließend eine Polymerasekettenreaktion mit einem der folgenden Primerpaare a) P0/P4480 b) P0/P4047 c) P0/P3017 d) P0/P2661 e) P0/P2339 f) P0/P1889 g) P0/P1777 h) P0/P1777* i) P0/P814 j) P0/P368 und anschließend eine Subklonung durchführt, wobei
PO mit der Sequenz ACT GAC CAC CCG GGG TGG ATT TAT TG
P4480 m t der Sequenz CCG GGT CGA CGC CGG GCC TCC CCA AA P4047 m t der Sequenz TCC AAT TGT CGA CAA TAA AAT TC P3017 m it der Sequenz TAT AAC AAG AAG TCG ACA GGA GAA CAT ATT
P2661 m t der Sequenz GTG AAG TCG ACT GAC AAT TTT GGC AGT CAT C P2339 m t der Sequenz TTA TTG AAG GTC GAC CAC TGT TTT GCA ACC P1889 m t der Sequenz AAT ATG TTG ACC TAT GGA AAA TAA TC P1777 m t der Sequenz GTT CGA GGT CGA CCT TTG ACC GTT AAT TAC P1777* mit der Sequenz GTT CGA GGT CGA CCT TAG ACT GTT AAT TAC
P814 mit der Sequenz AGT CAG AGG CGT CGA CAA TAG TGT GC und P368 mit der Sequenz TAT AAT TCA TGT TGA CGT GTT AGT CCT TCC oder einer jeweils hiervon abgeleiteten Sequenz bindet.
11. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 bis 10 zur Sekretion exprimierter Proteine in Apoplasten, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotid-Sequenz transkriptioneil mit der Signalsequenz des apoplastischen Invertase-Inhibitors aus Tabak fusioniert wurde.
12. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 1 bis 10, die mit einer Nukleotid-Sequenz am 3'- Bereich translationell erweitert wurde.
13. Nukleotid-Sequenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine translationeile Fusion mit Hilfe einer Nukleotid-Sequenz aus der Sequenz nach Fig. 5 durchgeführt wurde.
14. Genkonstrukt, das ein Gen und einen Promotor enthält, wobei das Gen ein Pathogenabwehrgen ist und der Promotor eine Nukleotid-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13 aufweist.
15. Genkonstrukt nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen direkte oder indirekte antifungale Wirkung zeigt.
16. Verwendung einer Nukleotid-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur
Herstellung einer pathogentoleranten Pflanze.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekenneichnet, daß die Nukleotid-Sequenz zu einer lokalen Genexpression in Blättern, Sprossen, und/oder Wurzeln nach Pathogen- befall führt.
18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression in den Blättern altersabhängig, insbesondere verstärkt altersabhängig erfolgt.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekenneichnet, daß die altersabhängige
Genexpression sowohl in Blättern mit "sink" als auch in Blättern mit "source"-Charakter, unabhängig von der Blattgröße, auftritt.
20. Verfahren zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Genom der Pflanze ein Genkonstrukt nach Anspruch 14 oder 15 stabil etabliert.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Erhöhung der Abwehrreaktion durch biotische und/oder abiotische Faktoren auslöst.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß man als abiotischen Faktor eine chemische Substanz, insbesondere Salicylsäure, verwendet.
23. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß man als biotischen Faktor ein pflanzliches Pathogen, insbesondere ein pilzliches Pathogen, verwendet.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das pilzliche Pathogen von einem Pilz stammt, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend
Plasmodiophoromycetes, Oomycetres, Ascomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.
25. Pflanzenzellen, die eine Nukleotid-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthalten.
26. Transgene Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 25.
27. Transgene Pflanze nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
28. Transgene Pflanze nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Fabaceae (Pisum, Vicia, Phaseolus, Glycine), Ranunculaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceen (Beta), Solanaceen (Nicotiana, Solanum tuberosum), Lycopersicon, Daucus, Gossypium, Helianthus.
29. Transgene Pflanze nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
30. Transgene Pflanze nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt ist aus der Gruppe der Poaceae, umfassend Zea mays, Triticum, Avena, Seeale, Oryza.
31. Samen von transgenen Pflanzen nach einem der Ansprüche 26 bis 30.
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