WO1996020706A1 - Thrombolytic agent - Google Patents

Description

明 細 害 血 栓 溶 解 薬 技術分野

本発明は、 6 —ア ミ ジ ノ ー 2 —ナフチル 4 一 [ ( 4 , 5 — ジ ヒ ドロ 一 1 H — イ ミ ダゾールー 2 — ィ ル） ァ ミ ノ ] ベ ンゾエー ト若 し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩を 含有する、 経口投与可能な血栓溶解薬に関する。

背景技術

心 ¾あるいは血管内において血液が凝固 して生じた塊 を血栓といい、 こ の血栓の形成に伴う病的現象を、 血栓 症という。 血栓症には脳梗塞、 心筋梗塞、 肺梗塞など、 各種の病態が存在する。

本来、 血栓の形成は、 何らかの原因によ って血管が障 害を受け、 この障害部分から血液が漏出するおそれが生 じる と、 それを防ぐために働 く 機構であ り、 血液成分の 変化、 血流の異常、 血管壁の性状の変化が密接に関与 し ている。 すなわち、 何らかの損傷を受けた血管が存在す る と、 その損傷部分に血小板が粘着及び凝集 して凝集塊 を作り、 出血を防ごう とする。 さ らに、 血小板は、 血小 板自身の凝集によ り、 血液中に存在する凝固因子を活性 化する物質を放出 し、 よ り 強固な血栓へと血栓形成を進 める。 この凝固因子は多数存在 し、 一つの酵素が次の酵 素を活性化するカ スケー ド反応によ って進むという複雑 な活性化機構を有している （血液凝固系） 。 また、 凝固 因子の中には傷口や損傷を受けた組織などによ って直接 活性化される因子も存在し、 多面的に凝固は進んでい く しか し、 血中には凝固の進行を抑制する物質が各種存在 し、 異常な凝固の亢進を抑制している。 血栓は必要に応 じて形成されるが、 止血作用が不要とな った段階で血中 の血栓を溶解する酵素 （線溶系酵素） によ って溶解され 血管は元の状態に戻る （線溶系） 。

このよ う に血栓の形成には様々 な要因が関与 している しかし、 最も直接的に血栓形成に関与する ものは、 血小 板、 血液凝固因子及び線溶系因子等の血液成分であり 、 従来よ り、 異常な血栓の存在によ って生じる血栓症の治 療には、 上記血液成分に作用する薬剤が開発され、 用い られている。

血栓症の治療方法は、 その作用機序から 2 つに大別さ れる。 すなわち、 血栓の形成を防 ぐ抗血栓療法と、 形成 した血栓を溶解させる血栓溶解療法である。

抗血栓療法は、 さ らに抗血小板療法と抗凝固療法の 2 つに分類されている。

抗血小板療法は、 血栓形成の初期の段階に関与する血 小板の機能を抑制する こ とを目的と しており、 古く はァ ス ピ リ ンから、 多 く の経口投与可能な薬剤が開発されて いる。 これらは現在、 脳梗塞、 心筋梗塞症等の再発予防 各種バイ パス手術後の閉塞予防および冠状動脈形成術後 の再狭窄予防等に用い られている。 すなわち、 血栓症の 治療という よ り も、 むしろ血栓形成の予防薬と して使用 されている。 これらは、 薬効発現に個人差がある こ と、 さ らに長期間服用 しなければな らないため、 出血傾向等 の問題がある。

抗凝固療法は、 血液凝固因子の抑制によ り血栓形成を 阻害する こ とを目的と しており、 凝固因子の活性を阻害 する薬剤および凝固因子の生成を抑制する薬剤に大別さ れる。 前者には、 へパ リ ンや酵素阻害剤などがある。 こ れらはいずれも注射剤であるため、 静脈内投与によ り抗 凝固作用を示す。 しかし、 医師のコ ン ト ロール下での使 用が義務付け られており、 出血傾向等の問題もある。 後 者は生体内で凝固因子の産生に必要な ビタ ミ ン Kに拮抗 する こ とによ り凝固因子の生成を抑制 し、 凝固能全体を 抑制する方法であ り 、 代表と してヮ ルフ ア リ ンが用い ら れている。 ヮ ノレフ ア リ ンは経口での使用が可能であ り 、 長期投与が必要な慢性疾患に用い られているが、 副作用 と して出血傾向が多い。

抗血栓療法と異なった作用機序で血栓症を治療する方 法が、 血栓溶解療法である。 この療法は抗血栓療法のよ う に血栓の形成機序を抑制する こ とを目的と しているの ではな く 、 血管内の血栓を溶解し、 血管閉塞を解除する こ と によ り血流を再開通させる こ とを目的と している。

その作用機序は、 血液線溶系調節因子の前駆体である プラ ス ミ ノ ーゲ ンをブラ ス ミ ンへと活性化させ、 このプ ラ ス ミ ンが血管内で血栓を形成しているフ イ ブ リ ンを分 解する こ とによ って血栓を溶解し、 閉塞部位を開通させ る と考え られている。 この血栓溶解療法に使用される薬 剤と しては、 ブラ ス ミ ノ ーゲンをブラ ス ミ ンに活性化さ せるプラ ス ミ ノ ーゲン活性化因子である組織ブラ ス ミ ノ 一ゲンァ ク チべター （ t 一 P A ) 、 ゥ ロキナーゼ （ U K ) 等の生体内物質、 スタ フ イ ロキナーゼ、 ス ト レブ トキナ ーゼ等の菌体産生物質およびそれらの遺伝子組換え体な どが知 られているが、 いずれも注射剤であり 、 経口投与 剤は知 られていない。

t 一 P A等は、 一般に静脈内投与で有効である と され ている。 しかし、 血中半減期が短く 、 速やかに肝糠よ り 除去される。 また、 生体内には阻害因子が存在 している こ と もあり、 血栓の生じている局所における これらの血 栓溶解作用は、 大量投与を必要とする。 この血栓溶解剤 の一過性の大量投与は、 全身的に血栓溶解作用を著し く 高め、 閉塞部位を開通させる こ とが期待される一方、 生 じたブラ ス ミ ンがフ イ ブリ ノ ゲンや血液凝固因子を分解 し、 血管壁を損傷して重篤な出血性症状を呈する こ とな どが報告されている。 また、 心筋梗塞時の冠状動脈血栓 に対する血栓溶解剤の局所投与は、 非常に有効な治療法 ではあるが、 血管内へのカテーテル挿入等は特殊な方法 であ り 、 患者への負担が非常に大きいこ とが問題とな つ ている。 更に、 これら血栓溶解剤の投与によ り一時的に 閉塞部位を開通させても、 再閉塞を生じやすいという こ とが動物実験および臨床例から報告されている。 以上の理由から、 血栓症の治療には、 血栓症の直接的 な原因である血管内に生じた血栓を溶解する作用を有 し、 従来の血栓溶解剤の問題点である出血等の重篤な副作用 を発現せず、 さ らに患者への負担を軽く するために経口 投与可能な薬剤の開発が望まれていた。

発明の開示

本発明者らは上記目的を達成するため、 鋭意研究した 結果、 意外に も、 6 — ア ミ ジ ノ ー 2 — ナフ チル 4 —

[ ( 4 , 5 — ジ ヒ ドロ ー 1 H — イ ミ ダゾールー 2 — ィ ル） ァ ミ ノ ] ベンゾエー トが優れた血栓溶解作用を有する こ とを見出 し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は上 記本発明化合物も し く はその薬学上許容し得る酸付加塩 を含有する血栓溶解薬に関する。 本発明化合物は、 特開 昭 6 1 一 3 3 1 7 3 号明細害に記載された抗 ト リ ブシ ン 剤、 抗プラ ス ミ ン剤、 抗カ リ ク レイ ン剤、 抗ス ロ ン ビ ン 剤および抗補体剤と して有用な、 既知の化合物である。 しか し、 後述する薬理試験から明 らかなよ う に、 本発明 化合物が、 線溶系を活性化させて血栓を溶解する こ と は、 本発明者らが今回初めて見いだ したこ とであ り、 本発明 化合物も し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩を含有す る血栓溶解薬は、 血栓が原因で生じる疾患に有効である。 すなわち、 静脈血栓症、 心筋梗塞症、 肺塞栓症、 脳塞栓 症、 緩徐に進行する脳血栓症、 血管手術および血液体外 循環に伴う血栓塞栓の治療並びに血流障害の改善、 儍性 動脈閉塞症に伴う諸症状の改善、 虚血性脳血管障害に伴 う血栓 · 塞栓の治療等、 血栓 · 塞栓症全般の治療薬と し て使用する こ とができ る。

産業上の利用の可能性

本発明化合物は、 線溶系を活性化 して血栓を溶解させ る こ とを以下の薬理試験例によ って示すよ う に、 血栓が 原因で生じる疾患、 たとえば静脈血栓症、 心筋梗塞症、 肺塞栓症、 脳塞栓症、 緩徐に進行する脳血栓症、 血管手 術および血液体外循環に伴う血栓塞栓の治療並びに血流 障害の改善、 慢性動脈閉塞症に伴う諸症状の改善、 虚血 性脳血管障害に伴う血栓 · 塞栓の治療等、 血栓 ， 塞栓症 全般の治療薬と して使用する こ とができ る。

以下、 本発明化合物 （ 6 —ア ミ ジ ノ ー 2 — ナ フ チル 4 - [ ( 4 , 5 — ジ ヒ ド ロ ー 1 H — イ ミ ダ ゾー ルー 2 — ィ ル） ァ ミ ノ ] ベ ンゾエー ト メ シ ル酸塩） について各 種薬理試験を示す。

( 1 ) マ ウ ス肺血栓致死モ デルに対する致死改善効果 実験には、 6 時間絶食 した d d y系雄性マ ウ スを用い 本発明化合物を 1 0 mgZ k g経口投与 した。 対照群には水 を経口投与 した。 6 時間後、 尾静脈よ り ト ロ ン ビ ン 1 0 単位/マウス を静脈内投与 して血栓を惹起 し、 ト ロ ン ビ ン 惹起 1 6 時間後に生死を判定した。 本発明化合物によ る 致死改善効果は生存率で示 した。 結果を表 1 に示す。 表 1 化合物 生存率 （％) 発明化合物 6 6

水 9

( 2 ) 合成基質を用いた血中プラ ス ミ ン様活性測定試験 実験には、 一晚絶食 した S D系雄性ラ ッ トを用いた。 本発明化合物 3 0 mg/kgを経口投与 し、 下行大動脈よ り 経時的にクェン酸加血と して採血し、 遠心分離 して血漿 を得た。 また、 対照群には水を経口投与 し、 同様に して 血漿を得た。

得られた血漿を 0. 1Mホウ酸緩衝液 （ pH 8.5) および 0. lmM Boc-Val-Leu-Lys-MCA と共に 3 7 で 3 0 分間ィ ンキュペー ト し、 1 5 %酢酸を加えて反応を停止させた 後、 蛍光強度を測定 し、 プラ ス ミ ン様活性を求めた。

こ の結果、 本発明化合物投与群 は 、 対照群 0. 358 n mol 分 mlに対 し、 0.968n mo 1 Ζ分ノ m 1と きわめて 強いプラ ス ミ ン様活性の上昇を示 した。

( 3 ) 合成基質を用いた組織ブラ ス ミ ノ ーゲン ' ァ ク チ ベータ一 （ t 一 P A ) 様活性測定試験

上記試験例 2 で得られた血漿を 0.1Mホウ酸緩銜液 （pH 8.5) および 0. lmM Phy- Gly- Arg- MCAと共に 3 7 °Cで 3 0 分間イ ンキュベー ト し、 1 5 %酢酸を加えて反応停止 後、 蛍光強度を測定 し、 t 一 P A様活性を求めた。 この 結果、 対照群 0.648 n mol /分 Zmlに対し、 本発明化合 物投与群は、 1.351 n mol /分 /mlと きわめて強い t 一 P A様活性の上昇を示 した。

( 4 ) 血中ブラ ス ミ ノ ーゲン ' ァ ク チベータ一 ' イ ン ヒ ビター （ P A I — 1 ) 抗原量の測定試験

実験には、 一晚絶食 した S D系雄性ラ ッ トを用い、 本 発明化合物 3 O ngZkgを経口投与 し、 下行大動脈よ り経 時的にク ェ ン酸加血と して採血 し、 遠心分離 して血漿を 得た。

あ ら力、じめ P A I 一 1 に対するモ ノ ク ローナル抗体の 10mM炭酸緩衝液希釈溶液を 96穴マイ ク ロ タイ タ一 · プレ ー ト上に 1 0 0 1 ずつ加え、 4 °C下 1 6 時間放置 した 0.1% T een 20 を含む 10 mM リ ン酸緩衝液にて 4 回洗浄 後、 標準液および血漿サ ンプルを添加 した。 室温にて 2 時間放匱 し、 再び 4 回洗浄 した後、 酵素標識 した P A I 一 1 ポ リ ク ローナル抗体を 1 0 0 〃 1 添加 し、 室温にて 2 時間反応させた。 4 回洗浄によ り 、 余分な抗体を洗浄 した後、 1 0 mg 0- フ ヱニ レ ン ジァ ミ ン、 0. IX過酸化水 素を含むク ェ ン酸緩銜液を 1 0 0 1 添加 し、 3 0 で 3 0 分間放置 し発色させた。 2 N硫酸を 5 0 1 添加 し て反応停止後、 マイ ク ロブレー ト リ ーダ一にて 4 0 5 n mの吸光度を測定 し、 血漿サ ンプル中の P A I 一 1 抗 原量を求めた。 結果を図 1 に示す。

血栓溶解の制御機構において、 血漿中に放出された t 一 P Aは、 ほとんどが速やかにその特異的阻害因子であ る P A I 一 1 によ って阻害され、 活性を消失するため、 P A I 一 1 量の減少は結果と して血栓溶解作用の亢進を もたらす。 本発明化合物は、 図 1 に示すよ う に、 線溶阻 止因子である P A I — 1 の血中濃度を明 らかに低下させ た。

( 5 ) 活性化部分 ト ロ ンボプラ スチ ン時間 （ A P T T ) の測定

予め蒸留水に溶解した活性化部分 ト 口 ンボプラ スチ ン 測定用試薬 （ブラテ リ ン A - オー ト） 1 0 0 / 1 に上記 試験例 4 で得られた血漿 1 0 0 fi 1 を加え、 3 7 て下で 約 3 分間放置 した。 その後、 予め 3 7 に加温 した 0 . 0 2 5 M塩化カノレ シ ゥ ム 1 0 0 β 1 を添加 し、 血液凝固 計 （ K C一 1 0 Α、 ァ メ ルン グ社） にてフ イ ブ リ ン塊を 生成するまでの時間を測定 した。

この結果、 対照 20.2秒に対 し、 本発明化合物投与群は 20.3秒で凝固 し、 A Ρ Τ Τの延長は認められなかっ た。

次に、 ヒ トへの経口投与試験を行っ た。

( 6 ) ヒ ト部分活性化 ト ロ ンボブラ スチ ン時間

( A P T T ) の測定

健常人に本発明化合物を経口投与 し、 経時採血を行い . 血漿を得た。

あ らか じめ蒸留水に溶解した活性化部分 ト 口 ンボブラ スチ ン測定用試薬 （ブラ テ リ ン A - オー ト ） 1 0 Ο χί 1 に上記で得られた血漿 1 0 を加え、 3 7 て下で約 3分間放匿 した。 その後、 あらかじめ 3 7でに加温した 0. 0 2 5 M塩化カ ルシウ ム 1 0 0 1 を添加 し、 血液 凝固計 （K C一 1 0 A、 ァメ ルング社） にてフ イ ブ リ ン 塊を生成するまでの時間を測定したと ころ、 A P T Tの 延長は認められなかっ た。 対照は 18.5秒であ り、 本発明 化合物は 18.4秒であ った。

( 7 ) ヒ ト P A I — 1 抗原量測定試験

上記試験例 6で得られた血漿を用い、 上記試験例 4 と 同様の方法で P A I 一 1 抗原量を測定 したと こ ろ、 血中 P A I — 1 抗原量は著 し く 低下 した。 結果を図 2 に示す。

( 8 ) ヒ ト P I C抗原量測定試験

また、 上記試験例 6で得られた血漿について、 体外診 断用医薬品 「 P I Cテス ト 」 （販売元 ： 帝人） を用いて プラ ス ミ ン · α ₂ — ブラ ス ミ ンイ ン ヒ ビタ ー複合体

( P I C ) 抗原量を測定したと こ ろ、 P I C量が明 らか に增加 した。 結果を図 3 に示す。

血栓溶解においてはブラ ス ミ ノ一ゲン · ァ ク チベータ ― ( P A ) 、 ブラ ス ミ ンを介する線溶反応が重要な役割 を果たす。 α ₂ —ブラ ス ミ ンイ ン ヒ ビター （ α ₂ — P I ) は、 生理的に最 も重要なプラ ス ミ ンの阻害因子で血栓溶 解の制御因子と して働いている。 P I Cは、 正常人血漿 中にはほとんど存在せず、 生体内でブラ ス ミ ンが産生さ れる と生成されるため、 P I C量の增加は全身的な線溶 系の亢進を示す。

すなわち、 本発明化合物は、 経口投与した場合には、 きわめて強力な血栓溶解作用を発現する。

さ らに、 本発明化合物の血栓溶解作用の有効性を証明 するため、 あ らかじめ血管内に血栓を作製 した実験モデ ルを用いて、 本発明化合物と抗凝固剤であるへパ リ ンと の効力を比較した。

( 9 ) ラ ッ ト血栓モデルにおける抗凝固剤 （へパ リ ン） との比較試験

麻酔下でラ ッ トの頸静脈を狭窄 し、 狭窄部位に血栓を 生じさせる血栓モデル （参考文献 ： Wessler Stanford, et al. , J. Appl. Physiol, 14 (6) ; 943-946 ( 1959) ) を 用いて、 本発明化合物と抗凝固剤であるへパ リ ンとの効 力比較実験を行った。 この実験モデルは、 血栓溶解剤と して使用されている t 一 P Aや U Kの有効性を証明する ために使用 されている実験モデルである。

実験には、 S D系雄性ラ ッ トを用いた。 ラ ッ ト は麻酔 下で頸静脈を露出させた後、 直径 2 mm針金状のものと一 緒に結紮 した。 血管内に ト ロ ン ビ ン 5 0 0 単位ノ mlを注 入 し、 結紮 した血管内に ト ロ ン ビ ン血栓を生じさせ、 血 栓作製 5 分後に針金を抜き取り開頸部を縫合 した。 正向 反射の回復後、 本発明化合物 1 0 0 mg/ kgを経口投与 し た。 一方、 抗凝固剤のへパ リ ンは、 静脈内投与を行った ₍ 薬物投与 3 時間後にラ ッ トを屠殺 し、 血栓を生成した頸 静脈を摘出 した。 その摘出血管内に残存する血栓を下記 のスコア リ ングをも とに集計し、 薬物の有効性を判定 し 結果を表 2 に示す。

判定基準 ： ス コ ア 0 血栓な し

ス コ ア 1 微小血栓

ス コ ア 2 小血栓塊が数個見られる ス コ ア 3 数個の大きな血栓塊

ス コ ア 4 血餅とな っ た血栓塊

表 2 化合物 ス コ ア 本発明化合物 1

水 4

へ ノく リ ン 4 以上の試験結果よ り 、 本発明化合物は、 抗凝固剤では 効果のない血栓に対 し、 きわめて有効である こ とが証明 された。

なお、 健常人に本発明化合物を経口投与 しても、 自覚 所見 · 他覚所見 ' 臨床検査値において、 何ら異常は認め られず、 安全性においても問題のないこ とが確認された 図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明化合物を経口投与 したと きのラ ッ ト血 中 P A I 一 1 抗原量の変化を示 したものである。 横軸は 投与後の時間を表 し、 縦軸は投与直後の血中 P A I 一 1 濃度を 1 . 0 と したと きの比を表す。 図 2 は、 本発明化合物をヒ 卜 に経口投与したと きの血 中 P A I 一 1 抗原量の変化を示 した ものである。 横軸は 投与後の時間を示 し、 縦軸は血中 P A I 一 1 抗原量（ng/ m l ) を示す。

図 3 は、 本発明化合物を ヒ 卜に経口投与 したと きの血 中 P I C抗原量の変化を示 した ものである。 横軸は投与 後の時間を示 し、 縦軸は血中 P I C抗原量（ng/m l ) を示 す。

本発明化合物は一般的には医薬組成物の形態で投与す る。 前記組成物の例と しては錠剤、 散剤、 カプセル剤、 シロ ッ プあるいは水溶液があげられる。 経口組成物には 通常の賦形剤、 滑沢剤、 崩壌剤、 湿潤剤等の添加剤を用 いる こ とができ る。 経口用液剤は、 水性または油性懸濁 液、 溶液、 乳濁液、 シロ ッ プ、 エ リ キ シル等の形態であ つてもよ く 、 あるいは使用前水ま たは他の適当な溶媒で 再調整する為の ドラ イ シロ ッ プと して供されて も良い。 前記の液剤は、 懸濁化剤、 香料、 希釈剤あ る いは乳化剤 のよ う な通常の添加剤を含有でき る。 また、 直腸内投与 する場合には坐剤と して投与する こ とができ る。 坐剤は、 カ カオ脂、 ラ ウ リ ン脂、 マ ク ロ ゴール、 グ リ セ ロゼラ チ ン、 ウ イ テ ツ ブゾール、 ステア リ ン酸ナ ト リ ウムまたは それらの混合物など、 適当な物質を基剤と し、 必要に応 じて乳化剤、 懸濁化剤、 保存剤等を加える こ とができ る 発明を実施するための最良の形態

本発明化合物は、 哺乳類 （ ヒ ト患者を含む） に対し経 口投与剤若し く は直腸投与剤と して投与する こ とができ る。 血栓が原因で生じる種々 の疾患を治療する 目的でヒ ト に投与される と きの投与量は、 1 0 0 〜 1 0 0 0 wg Z 曰 Z人、 好ま し く は 2 0 0 〜 8 0 O mgZ日 人、 さ らに 好ま し く は 4 0 0 〜 7 0 O mgZ日 Z人であるが、 病気の 重篤度、 年齢あるいは体重等によ り適宜調節される。

Claims

請求の範囲

1 . 6 — ア ミ ジ ノ ー 2 —ナフ チル 4 一 [ ( 4 , 5 — ジ ヒ ドロ ー 1 H —イ ミ ダゾールー 2 — ィ ル） ァ ミ ノ ] ベ ンゾエ ー ト も し く はその薬学上許容し得る酸付加塩を含 有する血栓溶解薬。

2 . 請求項 1 に記載の化合物若し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩および薬学上許容 し得る担体からなる血 栓溶解薬。

3 . 請求項 1 に記載の化合物若 し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩を含有する線溶活性化薬。

4 . 請求項 1 に記載の化合物若 し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩および薬学上許容 し得る担体からなる線 溶活性化薬。

5 . 請求項 1 に記載の化合物若 し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩の血栓溶解薬と しての用途。

6 . 請求項 1 に記載の化合物若 し く はその薬学上許容 し得る酸付加塩の線溶活性化薬と しての用途。

7 . 血栓溶解療法に用いる請求項 1 または 2 に記載の 血栓溶解薬。

8 . 血栓溶解療法に用いる請求項 3 または 4 に記載の 線溶活性化薬。

9 . 急性心筋梗塞の治療に用いる、 請求項 1 または 2 に記載の血栓溶解薬。

1 0 . 急性心筋梗塞の治療に用いる、 請求項 3 または 4 に記載の線溶活性化薬。

1 1 . 請求項 1 または 2 に記載の血栓溶解薬を投与す る こ とを特徼とする血栓溶解療法。

1 2 . 請求項 3 ま たは 4 に記載の線溶活性化薬を投与 する こ とを特徵とする血栓溶解療法。

1 3 . 請求項 1 1 または 1 2 に記載の血栓症の治療方 法

1 4 . 請求項 1 1 ま たは 1 2 に記載の急性心筋梗塞の ί口 法。