TW201210610A - Method for controlled release of parathyroid hormone from encapsulated poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres - Google Patents

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201210610 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種生產控制釋放微小球的方法，以及一種利用該方 法製備的控制釋放微小球及該微小球的用途，該微小球係用於控制釋 放藥學上有效劑量的生物活性多肽，且此多肽與副甲狀腺素之活性相 近。 【先前技術】 人類副甲狀腺素〈parathyroid hormone，PTH〉是由84個胺基酸構 成的多肽，其序列如 SEQ ID NO: 1〈 Keutmann. HT，Sauer. MM，Hendy. GN, O Riordan. JLH, Potts. JT. Complete amino acid sequence of human parathyroid hormone, Biochemistry 17;1978; 5723〉所示，副甲狀腺素直 接作用於骨骼及腎臟，是人體鈣平衡中最重要的調控者。近期研究報 告指出特定的副甲狀腺素相似物在人體内可在骨骼合成代謝中產生作 用〈Podbesek R, Edouard C, Meunier PJ，Parsons JA，Reeve J，Stevenson RW, et al. Effects of two treatment regimes with synthetic human parathyroid hormone fragment on bone formation and the tissue balance of trabecular bone in greyhounds. Endocrinology 1983; 112:1000-6〉，並在 用來治療骨骼疾病方面引起高度關注。 PTH〈1-34〉、PTH〈1-31〉及PTH〈1-38〉在成骨細胞中之表現 可與PTH〈1-84〉有一樣完整的活性。近年來有許多方法已應用副甲 狀腺素於疾病治療臨床試驗上〈Neer RM，Amaud CD，Zanchetta JR， 201210610

Prince R, Gaich GA, Reginster J-Y, Hodsman AB, Eriksen EF, Ish-Shalom S, Genant HK, Wang O, Mitlak BH. Effect of parathyroid hormone < 1 - 34 > on fractures and bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis. Engl J Med 2001;344:1434 - 41〉。一個近期報導的方法強 調口服施用PTH〈1-34〉可表現出生物活性。然而和皮下注射相比， 其生物有效性只有 5%和 2.1%〈 Leone-Bay A，Sato M，Paton D, Hunt AH，

Sarubbi D, Carozza M, Chou J, McDonough J, Baughman RA. Oral delivery of biologically active parathyroid hormone. Pharm Res 2001;18 〈7〉：964-70)。另一方面，以氣管灌注或乾粉吸入PTH〈1-34〉等 經肺部路徑則分別有41%及34%的生物有效性〈Codrons V，Vanderbist R, Verbeeck RK, Arras M, Lison D, Preat V, Vanbever R. Systemic delivery of parathyroid hormone (1-34) using inhalation dry powders in rats. J Pharm Sci 2003;92〈 5〉：938 - 50〉。除此之外，間歇性 PTH 投予 還包括了計晝性滲透壓幫浦給藥〈programmed administration by osmotic pump > 及搏動性經皮給藥〈Suzuki γ，Nagase γ，Iga K，Kawase M，〇ka M，

Yanai S,Matsumoto Y, Nakagawa S, Fukuda T, Adachi H, Higo N, Ogawa Y. Prevention of bone loss in ovariectomized rats by pulsatile transdermal iontophoretic administration of human PYH < 1 - 34 > . J Pharm Sci 2002;91:350-61〉。副甲狀腺素對骨路合成影響中，上述兩種給藥方 式均與皮下給藥有相當的作用效果，而人類副甲狀腺素ρτΗ〈138〉 亦有相似的結果。相對於此’針對局部副甲狀腺素給予的研究工作就 較少見。值得注意的是’這些少見的研究指出，直接經由基因傳遞來 局部投予副f狀腺素在治时祕陷上是-财益處的 〈Bonadio J， 4 201210610

Smiley E, Patil P, Goldstein S. Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration. Nat Medl999;5:753 - 9>。 PTH〈 1-34〉亦稱做 teriparatide，商品名 FORTEO®，是由 EliLilly, Indianapolis，Ind藥廠生產在市場上銷售，可用於停經後骨折高危險群 的婦女’治療骨質疏鬆症〈Zhang，S，Eli Lilly and company, Indianapolis, IA〈US〉. US patent No. US6590081-B1〉。此藥物是以每日一次皮下 注射PTH〈 1-34〉配方（醋酸緩衝液、甘露醇、及間甲酚於水中，pH 4) 的方式給予。然而許多人對於注射會有不良反應，因此變成不想遵從 PTH的處方劑量。 最近’申請人發現PTH〈 1-34>會作用於關節軟骨細胞，抑制其最 終分化’同時亦可在在大鼠中抑制木瓜蛋白酵素導致的關節炎 〈papain-induced osteoarthritis〉的作用〈Chang. JK，Chang. LH，Hung. SH，

Wu. SC, Lee. HY, Lin. YS, Chen. CH, Fu. YC, Wang. GJ, Ho. ML,

Arthritis&Rheumatism. 2009; 60; 3049-3060〉。然而其治療需要三天投 藥一次’會對接受治療的病人帶來更多的痛苦及不便。因此為了減低 病人的痛苦’有需要發展一個新的副甲狀腺素胜肽控制釋放載體配 方，其具有適當的生物有效性，使其能達到有效治療副甲狀腺素相關 疾病的治療濃度。 然而普遍而言’蛋白質和胜肽在腸胃道當中都不穩定、半衰期短、 且其水性配方之生物有效性相當低〈Fix，ja. 〇ral controlled release 201210610 technology for peptides: status and future prospects, Pharm. Res. 1996 Dec;13〈12〉：1760-4 >〇這些特性使得蛋白質和胜肽在臨床有效應用上 面臨挑戰。 【發明内容】 天然及合成的聚合載體〈微米及奈米球體〉已發展成為一種控制包 覆蛋白釋出並避免其被降解的有效方法〈Lu L，Stamatas GN，Mikas Ad Controlled release of transforming growth factor betal from biodegradable polymer microparticles. J Biomed Mater Sci 2000;50:440-51〉。在這些載 體中’由於聚乳酸-甘醇酸（p〇ly (lactic_c〇_glyC〇iic肛叫，pLGA)及聚 乳酸〈PLA〉在通過自然途徑時具有極佳的生物適應性和生物降解性， 因此更適合用於藥物的傳送。因此本發明提供一種製造可長時間穩定 控制釋放副甲狀腺素（PTH)、並維持其治療濃度和生物有效性的方法。 本發明揭示了一種製造用於控制釋放的PLGA微小球的方法，該 微小球包覆有具生物活性並穩定的副甲狀腺素。副曱狀腺素成功的被 包覆在兩種不同組成的PLGA中。發明這些組成是為了使副甲狀腺素 在長期的控制釋放過程中能穩定存於微小球中。製造出的pLGA微小 球可釋放具有生物活性、非聚集的副甲狀腺素，並維持有效的治療濃 度範圍在1 X 10·7Μ至5 X ΙΟ·9 Μ之間，持續21天。釋出的副甲狀腺 素已證明穩定且在長期控制釋放過程中均具有生物活性。 本發明有對包覆於PLGA微小球中穩定控制釋放的ρΤΗ〈134〉 進行製造及研究。ΡΤΗ〈 1-34〉在溫度及pH改變下會變不穩定，因此 6 201210610 本發明提供了可使ΡΤΗ〈1·34〉能長_穩定包覆的方法。 本發明說町以PLGA㈣方式_控制局部投予ρτΗ〈134〉 並維持固定濃度的可行性。包覆PTH U_34〉的PLGa微小球能於一 定期間内持續傳送有效濃度細的PTH U_34〉，因此可作為一潛在用 於PTH < 1-34〉傳送系統的載體。包覆pTH〈⑼〉的ριχ}Α微小球 能用於治療副甲狀腺素不足症、疏鬆、及骨_炎等。 本文中所使用的術語意義除非另有特別界定，否則均與熟習此項技 藝者的普遍認知相同。本巾請案中使用的術語其意義如下所列： PTH〈 1-34〉」意指具有34個胺基酸序列的多肽，是由seqjj^nq: 1中從第1個至第34個胺基酸所構成。更清楚來說，SEQ][DNa 2就 疋PTH〈1-34〉的多肽序列。 「PTH〈 1 -31〉」意指具有31個胺基酸序列的多肽，是由SEQ耵N〇: 1中從第1個至第31個胺基酸所構成。 「卩丁11〈1-38>」意指具有38個胺基酸序列的多肽，是由3£(51〇1^〇: 1中從第1個至第38個胺基酸所構成。 「PTH〈 I-84〉」意指完整的人類副甲狀腺素，其多肽序列就如seq ID NO: 1 所示。 退化性骨骼疾病」意指一系列疾病，其特徵為骨骼質量減少和/ 或由於結構不完整而增加骨折的風險。許多退化性骨骼疾病都是骨質 的生成和再吸收失衡所造成。這些失衡可能源自於成骨細胞骨質生成 減低、财細射質再吸收增加、或是成骨細胞與辦細胞兩者共同 201210610 的活性改變。 月質疏鬆」意才曰種退化性骨路疾病，其特徵包括骨路質量減低 以及骨驗織微結構的惡化’導致骨舰弱容易騎。她骨質疏鬆 是指與其他疾絲關、只與老化和其造成雜腺械減低有關成的骨 胳質U。减骨質疏鬆包含停經後骨質賴和老年骨質疏鬆兩種 型式’另外也包括了無潛麵素、也查無其他引起«退化次發原因 的原發性«Μ。次魏„賴是鎌了統造成㈣魏化以 外，其他疾病所導致的骨質疏鬆^界衛生組蚊義骨密度低於骨密 度參考標準〈關3〇歲的健料輕成人為鮮〉25健杉以下即 為骨質疏鬆。 「骨壞死」意指因血流供應至骨齡^不足而導致倾塌陷的疾 病。在活體組織當中，胁也需要—定妓的血流以供轉正常功能。 當缺乏足夠血流時，發生嚴重的骨壞死可引起骨驗織的死亡。 「骨關節炎」〈簡寫OA ’也就是退化性關節炎或退化性關節疾病〉 是才曰-些疾病及力學上異常引發的關節退化，包括了關節軟骨及在旁 的軟骨下骨〈subehondralbone〉。骨卿炎的臨床特财關節疼痛、觸 痛、僵硬、發出軋軋聲、關節閉鎖和時而局部發炎。軟骨做為強而有 力的蛋白質基質可潤滑並緩和關節衝擊，在骨關節炎中，許多潛在因 素’像遺傳、生長發育、代謝及力學上的影響都會導賴始軟骨流失 的過程。 因此本發明提供一種控制釋放微小球，其平均粒徑大於5〇卿。該 微小球係藉由以下方法製造：製備一包含有内水層的油包水乳劑 201210610 〈water-in-oil〈 w/o > emulsion〉，該内水層含有藥學上有效量的生物活 性多肽，該多肽活性與副甲狀腺素相近；製備一含有聚乳酸_甘醇酸 (PLGA)之聚合物質的油層；接著將油包水乳劑倒入聚乙烯醇 〈polyvinyl alcohol〈PVA〉〉水溶液中以形成水包油包水雙乳劑 < water-in-oil-in-water〈 w/o/w〉double emulsion〉並接著將油層中的 溶劑脫附（desorb)掉。在較佳實施例中’聚乳酸-甘醇酸為plga〈50:50〉 或PLGA〈 65:35 >，且多肽之胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其被 固定於含有鹽酸和牛血清白蛋白之儲備溶液中。較佳地，該鹽酸濃度 為約1 mM到約8 mM，牛血清白蛋白之濃度為約〇.〇1%到約5%。更 佳地’鹽酸濃度為約2 mM到約6 mM，牛金清白蛋白之濃度為約〇.05 %到約 0.15%。 在一較佳實施例中，該多肽係以範圍約1 X 1 〇-7 ]y[到約5 X 10·9Μ 的有效治療濃度釋放至少21天，該聚乙烯醇水溶液之重量百分比濃度 為約0.1%到約5%，且生物活性多肽之包封率不低於約6〇%。較佳地， 聚乙烯醇水溶液之重量百分比為約0 5%到約1 5〇/〇。 本發明進一步提供一種製造平均粒徑大於5〇微米之控制釋放微小 球的方法，包含.製備一油包水〈w/〇〉乳劑，其包含一内水層，該内 水層並含有藥學上有效量的生物活性多肽，此生物活性多肽之活性與 副甲狀腺素類似；製備一含有聚乳酸_甘醇酸之聚合物質的油層；接著 緩慢將油包水乳劑加入聚乙烯醇水溶液中以形成水包油包水〈w/〇/w〉 雙乳劑並接著將油層中的溶劑脫附掉。較佳地，聚乳酸_甘醇酸為pLGA 〈50:50〉或PLGA〈65:35〉’且多肽之胺基酸序列如SEQroN〇:2所 201210610 示，其被固定於含有鹽酸和牛血清白蛋白之儲備溶液中。較佳地，該 鹽酸濃度為約1 mM到約8 mM，牛血清白蛋白之雜為約讀％到約 5%。更佳地，該鹽酸濃度為約2 mM到約6 mM，牛血清白蛋白之濃 度為約0.05 %到約0.15%。 在一較佳實施例中’該多肽係以範圍約1 χ 1〇-7m到約5 χ 1〇-9m 的有效治療濃度釋放至少21天，該聚乙烯醇水溶液之重量百分比濃度 為約0.1%到約5% ’且生物活性多肽之包封率不低於約_。較佳地， 聚乙烯醇水溶液之重量百分比為約0.5%到约1.5%。 本發明更進一步提供一種控制釋放投遞具治療性多肽至一對象之 方法，包含向該對象投予平均粒徑大於50哗之控制釋放微小球，該微 小球係藉由以下方法製造：製備—包含有内水層的油包水乳劑，該内 水層含有藥學上有效量的生物活性多肽，該多肽活性與副甲狀腺素相 近；製備一含有聚乳酸-甘醇酸之聚合物質的油層；接著將油包水乳劑 倒入聚乙鱗水溶液巾以形成水包油包水魏継接著將油層中的溶

劑脫附掉。在較佳實施例中，聚乳酸-甘醇酸為PLGA〈 50:50〉或PU5A <65:35〉’且多肽之胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，其被固定於含 有鹽酸和牛血清自蛋白之儲備毅中。較佳地，該酿濃度I約！ _ 到約8 ’牛血清白蛋白之濃度為約0.01%到約5%。更佳地，瞄酸 濃度為約2福到約6 mM，牛血清白蛋白之濃度為約_ %到約〇 15 %。 在一較佳實施例中，該多肽係以範圍約1 X 1〇-7 Μ到約5 χ 1(γ9μ 的有效治療濃度觀至少U天，該聚乙麟水溶液之重量百分比濃度 201210610 為約〇·ι/。到❸5%。較佳地，聚乙稀醇水溶液之重量百分比為約 到約1.5%。 I &佳實施例中’觸象係患有副甲狀腺功能不全症、骨疾病或 軟月疾病。在-更佳實施例巾，該骨疾病為骨質疏鬆症或骨壞死症； 該軟月疾病騎關節炎。在另-更佳實施例中，該對象係人類。 在傳統的雙乳劑技術中，人們使用250至400 mL的1-5 % PVA溶 (Y.-Y. Yang et al., Biomaterials 22 (2001) 231-241 and G. 勤 et al. / Biomaterials 25 (2〇〇4) 345—352)，但本發明僅使用 2〇 此的 1 %PVA作為水相β 通常雙乳劑技術需要至少4小時的製備時間（γ·_γ. Yang et al，

Biomaterials 22 (2001) 231-241)，但本發明的方法僅需要2小時的製備 時間。因此本發明也降低了製備所需時間。 US 465244卜 US 4954298、US 5271945、US 5330767、US 5611971 及US 5651990揭露了製備用於延長釋放的微小球的方法，然而，本發 明的技術優於彼等之處在於：（1)較少的製備時間（2小時之内）：（2) 微小球的尺寸較適於關節内注射；（3)可重複性較高且較重要；（4) 微小球可釋放PTH〈1-34〉至少21天並均落在有效治療濃度範圍内。

Anthony 等人（Journal of Pediatric Surgery，40, 81-85 (2005)) and

Fong et al. (Journal of Surgical Reserch, 143, 195-199 (2007))揭露 了用於 副曱狀腺低能症的控制釋放系統’其PTH的釋放濃度為1〇〇〇_6〇〇〇微 微克（1微微克=l(T12g)且在第一天（24小時）内有非常高的爆發性釋 11 201210610 放。他們的製備方法需要4小時以及大量的PVA。本發明僅需要2小 時以及少量的PVA。除此之外，本發明的PTH釋放濃度為20-400微克 (1 微克=l(T6g)e 因此’本發明的特徵在於降低PVA溶液的量以及百分比，並使用 700 ipm以產生粒徑大於50 μιη的微小球，其大小適合關節内注射。本 發明的關鍵步驟或發現是在於使用20 mL的1 % PVA作為水相，以700 rpm的攪拌速度仍能產出適當尺寸的微小球（根據Butoescu N, J〇rdan O, Doelker. Ε, Intra-articular drug delivery systems for the treatment of rheumatic diseases: A review of the factors influencing their performance European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2009; 73; 205-218，關節内注射適合的粒徑為直徑35至i〇5聰）以釋放具有治 療濃度的PTH超過三星期的時間。 【實施方式】 以下實例並非作為限制，僅代表本發明的各種面相與特徵。 實例1微小球的製備和特徵 本研究中使用兩種不同的PLGA組成一PLGA〈 50:50 >和PLGA 〈65:35〉。微小球以w/o/w雙乳劑技術製造〈圖1〉。簡言之，90 ul的PTH 〈1-34〉儲備溶液〈PTH^HmMHCl/0.1%牛血清白蛋白〈BSA〉溶液〉 在10%二氯甲烷〈DCM〉聚合物溶液中被乳化，並在冰浴中使用輸出 功率為15W之超聲波探針〈Virsonicl00，Cardiner，NY〉20秒以形成最 初的油包水(w/o)乳劑。逐步將油包水乳劑加入2〇 mi的1%聚乙烯醇 12 201210610 〈PVA〉水溶液中，並同時用力授拌（轉）以形成水包油包水的 雙乳劑。在室溫下攪拌該溶液3〇分鐘以硬化微小球，接著在吸水狀態 下將二氣甲m然後離⑽_舰小球。將所生成的微小球以 蒸顧水清洗3次並冷;東乾燥。該微小球的整體形態會在微小球樣本於顯 微鏡載台〈stub〉上以金包覆後，以掃描電子顯微鏡〈SEM〉<Hitachi S3200, Tokyo, Japan〉研究’微小球的平均尺寸則會被粒徑分析儀測量。 使用4mM鹽酸和生理食鹽水〈〇.9%NaC1〉以及〇1%的BSA作 為穩定劑以保護被包封在微小球中的PTH <^34〉。為了控制釋放被包 覆在微小球中的藥劑，微小球之表面必須要是平滑的。掃瞄式電子顯 微鏡的觀察確認PLGA微小球是平滑的，且在降解過程中也維持此現 象。文獻報告強調’用於在大鼠關節内注射之微小球適當大小為351〇5 μηι (Butoescu. N, Jordan. O, Doelker. E, Intra-articular drug delivery systems for the treatment of rheumatic diseases: A review of the factors influencing their performance European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics，2009; 73; 205-218 >，粒徑分析儀的數據顯示以本研究 中之本方法可成功製造出多於90%的平均粒徑為45-80 μιη之微小球 〈圖2及圖3a〉。 實例2包封和釋放動力學 將裝有10毫克PTH〈1-34>之微小球懸浮於〇.9 %的1 mL氣化鈉與 200 uL二氣甲烷混合液中，並於室溫下震盪培養丄小時。pTH〈丨_34〉 標準溶液<0.1 ml>也藉由加入0.9%氣化鈉與0.1 %bsA來製備。以市 13 201210610 售的免疫試劑套組，根據製造商的指示測量PXH〈丨_34〉之農产 質的裝載與包封效率〈Encapsulation efficiency〉則分別以方 和⑵計算〈表1〉。 '程式〈1〉 方程式⑴：蛋白質裝載〈w/w%>=微小球中蛋白質的總量/ 小球總量 微 方程式<2〉：蛋白質包封效率〈％〉=〈被測量之蛋白質濃度/ 白質濃度之理論值〉XI〇〇 蛋 表1 PLGA微小球中PTH〈1-；34〉之包封效率 PLGA PTH〈ng/mL> 濃 度理論值 測量的PTH 〈ng/mL> 濃度 包封效率 50:50 1800 1319.0 73.3 % 65:35 1800 1129.4 62.7 % 實例3生物趙外之ρτΗ〈1-34〉釋放 在生物體外由PLGA微小球釋放PTH〈丨以〉的釋放曲線由下述方 法測定《將ίο毫克的微小球懸浮在lmlPBS〈pH = 74〉中，微小球懸 浮液被靜置培養在4、25、37 °C下，在設定的時間間隔下’藉由離心收 集lml的培養液’並以等量的新鮮pBS替換。以具有ρτΗ抗體塗層之培 養格的PTH〈 1-34〉ELISA套組 San Clemente，CA> ’ 遵 201210610 從廠商建議來測量經釋出之培養液中的PTH〈 1-34〉濃度。每個時間點 都使用二個培養格作二重複。使用微量盤讀取儀(micr〇titer plate reader ) 在450nm測直吸光度，並使用程式以i〇g_i〇git法搭配標 準曲線〈standard curve〉計算出PTG之濃度〈G mphpad s〇ftware，San Diego, CA〉。 發明人近期的研究報告提出，治療被木瓜酶誘導之大鼠骨關節炎之 有效劑重PTH〈 1-34〉為1〇·8 μ，注射頻率為每三天一次連續五週。 來自ΡΤΗ〈1-34〉特定ELISA分析的釋放動力學數據顯示，在37 下’ PLGA〈65:35〉微小球可釋放所欲濃度範圍ι〇-7_1〇_8 μ的ρτΗ 〈1-34〉兩週〈圖4>。相較於1>1/(3八〈5〇:5〇〉，1)1^〈65:35〉在哪 中37.°C模擬生理條件下，在超過17天後顯示一致的釋放曲線。 4 MTT (3- <4,5-d^methylthiazo^2-yl> -2,5-diphenyltetrazolium bromide)分析法 在處理MC3T3-E1〈成骨細胞〉時，ρΐΉ〈_> MTT分析測試。簡言之，如先前所述，藉由轉換Μττ成為甲腾 (formazan) ’以偵測培養格中培養的MC3T3_m的粒線體活性，大量 的甲膳產齡釋人培魏巾，而這直接與培養格巾的活細胞數量呈正 比’且可在490nm藉由吸光度測定而測得。在指定的時間間隔内，以 體積比1 : 5〈MTT :培養液〉將Μχτ稀釋於標準培養基中，並將該 新鮮製備的ΜΤΤ加入含有細胞的培養格中，然後在37 %下以 再培養四小時。經過額外培養後，每—個培養格巾，釋人培養液且被 15 201210610 轉換之100 ul MTT會從中被轉移到96孔培養盤，使用微孔盤讀取儀 〈PathTech〉記錄在490nm的吸光度，並使用KCjunior軟體分析〈圖 3b〉。 實例5釋放之PTH〈 I-34〉之生物活性 藉由測量經釋放的PTH〈 1 - 34〉處理之細胞内所含的環填酸腺甘 〈cAMP〉，以測定控制釋放之PTH〈l-34>之活性。為了這些實驗， 將MC3T3-E1培養於添加有1〇%胎牛血清和50 mg/mL抗壞血酸之 α-ΜΕΜ内。將細胞以每孔5〇,〇〇〇個細胞的密度培養於24孔盤〈24-well plates〉上。與從微小球釋放之ρτΗ〈 ^4〉培養六小時後，加入〇 1N 之鹽酸與0.5 mM之霍亂毒素〈isobutylmethylxanthine〉讓細胞在培養 基中直接被水解，以保護所產生之cAMP。以市售的ELISA套組 〈Endogen/Pierce，Rockford，IL〉按照廠商說明測量細胞内之cAMP。生 物活性數據顯示經釋放的PTH〈 1-34〉處理的MC3T3-E1細胞在第一 和第三天都有增加cAMP的生產，表示釋放的PTH〈1-34〉具有生物 活性〈圖5〉。 實例6統計分析 測试二個為了生化分析而獨立培養的樣本。每個實驗都重複至少三 次，並顯示出具代表性之實驗之數據〈表示為平均值±標準差〉。以單 因子變異數分析〈ANOVA〉評估統計顯著性，並使用薛費法進行多重 比較。p<0.05被認為是顯著的。 201210610 實例7生物體内（/«vivo)實驗 方法： 動物實驗 動物實驗經高雄醫學大學之動物實驗管理小組核准。由樂斯科生物 科技股份有限公司〈BioLASCO Taiwan〉購入54隻12週大的雄性 Spmgue-Dawley大鼠〈250-300 gm>，並將其飼養在標準的實驗室條 件下〈溫度24°C ’曰夜週期12小時〉且可自由的取用食物和水。實 驗動物會在實驗室中適應一星期，之後再進行實驗。 骨關節炎誘發與PTH處理 每個被視作對側控制關節之左膝’均施加未以PTH處理或進行〇a 誘發的媒液’右膝為被研究之關節。大鼠會被分至五個組別： Non-OA+PTH組〈以PTH〈 1-34〉處理但不進行〇A誘發〉〈n=6〉、 Non-OA+PTH/PLGA組〈以PTH/PLGA微小球處理但不進行〇A誘發〉 〈n=6〉、OA組〈進行OA誘發但不以PTH〈1_34〉處理〉〈n=6〉、 OA+PTH組〈以PTH〈 1-34〉處理過後’再進行〇A誘發〉〈n=6〉和 OA+PTH/PLGA組〈以PTH/PLGA微小球處理過，再進行〇A誘發〉 〈n=6〉。OA組與OA+PTH組之大鼠’右膝關節内會被注射20μ1之 4%木瓜酶溶液以及20μ1之0.03 Μ半胱胺酸，使0Α被誘發。這些關 節會於實驗曰之第卜4和7天以26-gauge針頭透過膝蓋肌腱注射（美 國專利號US 659081)。在OA+PTH組，在OA被誘發後至將大鼠犧牲 17 201210610 刖，每隔二天會注射4〇μ1之10nM PTH〈 1-34〉至右膝關節内。在ρτΗ 組，在沒有OA被誘發的情況下進行同樣的pTH〈丨_34>處理。在 0A+PTH7PLGA group組，在〇A被誘發後之第1天與第15天，將〇 4 mg的PTH/PLGA微小球注射至右膝關節内。在5週後的同一個時間 點，以過量二氧化碳吸入的方式將大鼠犧牲。 組織學 進行犧牲後，採取每個大鼠的膝蓋，收集脛骨平台連同關節軟骨， 並於組織實驗準備前先以10%中性緩衝福馬林固定。接著以1〇%甲酸/ PBS緩衝液將樣本脫鈣，將脫鈣後之脛骨關節樣本以石蠟包埋，並製備 5叫的冠狀面微切片。〇八0以番紅速綠〈8也肪丨11_〇-1^贫-〇1沈11〉（1〇/〇 番紅以0.75%蘇木精接著1%速綠作對比染色〉〈Sigma，沿丄〇心，M〇〉 染色。局部之第二型膠原蛋白與χ型膠原蛋白則被免疫染色。 組織形態計量學研究 將 GAG 以番紅染紅，以 Image-Pro plus 5.〇 軟體〈Media Cybemetics

Inc. MD，USA〉測量每個脛骨近端之關節軟骨内所有區域與被染紅的區 域〈圖6C〉。計算各組中被染為紅色之_在所有區域巾的比例〈紅/ 全部〉。 免疫組織化學 將該腔骨關節切片再次水合（re七yetted)，並以3%過氧化氫阻塞 201210610 組織中内生的過氧化酶。樣本在與初級抗體靜置培養前，為了抗原表 位回復（epitoperetrieval〉會先以酵素分解。該酵素分解的方法是修改 先刖的報告（Butoescu. N，Jordan. 0, Doelker. E，Intra-articular drug delivery systems for the treatment of rheumatic diseases: A review of the factors influencing their performance European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2009; 73; 205-218)而來。酵素分解第二型膠原 蛋白免疫染色之最佳條件’疋在372(11下2.5%玻尿酸酶〈hyluronidase〉 與於PBS〈 pH 7.4〉〈 Sigma，St. Louis, MO > 中的 1 mg/ml 鍵蛋白酶之 混合物中1小時。x型膠原蛋白免疫染色之最佳條件，是在〇1 u/ml的軟 骨速分解酵素〈chondroitinase ABC〉（Sigma, St Louis，MO)中 1 小時以 及在37SC下於1 mg/mltris-HCl (pH3.0)中的胃蛋白酶中15分鐘。接著 將切片以胎牛血清阻塞1小時，並於37SCTF，以針對第二型膠原蛋白的 初級抗體〈小鼠早株抗體〉〈Chemicon International，Temecula, CA〉與 針對X型膠原蛋白的初級抗體〈大鼠之多株抗體〉〈1:2〇〇〉〈C0SM0, Tokyo, Japan >培養4小時。將第二型膠原蛋白以生物素標記的羊抗鼠免 疫球蛋白〈DAKO，Carpinteria，CA〉進行二抗培養，X型膠原蛋白則以 生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白〈Biocare medical，Walnut Creek，CA〉 進行二抗培養，並再加入生物活性酶〈Streptravidin-HRP〉〈鏈黴印白 素（streptavidin )偶聯辣根過氧酵素（horseradish peroxidase )〉（ Biocare medical，Walnut Creek，CA〉。再以含有0.01%過氧化氫之3,3，-二胺基聯 苯胺〈3,3’-diaminobenzidine〉溶液染為褐色，最後，將切片以蘇木素 做背景染色〈counterstained〉並以顯微鏡做觀察。免疫染色之相對密度 19 201210610 〈社、度/面積’面積25.44± 2.77 mm2〉會以Image-Pro plus 5.0軟體〈Media Cybernetics Inc· MD，USA〉進行測量〈圖7C〉。 結果： 大鼠關節軟骨節的組織學及組織形態計量學研究

在對側控制、Νοη-0 A+PTH、Non-0 A+PTH/PLGA、OA、OA+PTH

和OA+PTH/PLGA、组中的經番紅染色的大鼠關節之關節軟骨的代表 性照片顯示於圖6〈A&B〉。測量經番紅染色之區域在所有區域中的 比率〈紅色：全部〉並於分組中做比較〈圖6C〉。各組之間，對侧控 制關節中的紅色：全部比率並沒有顯著差異。對側控制關節中軟骨 的紅色：全部比率’以及Non-OA+PTH和Non-OA+PTH/PLGA兩組的 研究關節中的紅色：全部比率也並沒有顯著差異〈圖6(：〉。〇八組中， 研究關節之軟骨的紅色：全部比率，顯著比經〇A誘導五個星期之對 側控制軟骨的紅色：全部比率來得低〈P <〇.〇1〉〈圓6C〉。經五個禮 拜的PTH〈 1-34〉處理後，OA+PTH組之軟骨並沒有與對側控制組之 軟骨有明顯差異〈圖6C〉。五週後，oa+PTH/PLGA組的紅色：全部 比率則顯著高於OA組〈Ρ<〇.〇1〉〈圖6C〉。除此之外，〇A+PTH/pLGA 組的紅色：全部比率與對侧控制軟骨也沒有顯著差異。在第五週時， OA+PTH組、OA+PTH/PLGA組和對侧控制軟骨組之間，沒有顯著差 異〈圖6C〉。 大鼠關節軟骨節之第π型應·原蛋白之免疫組織化學研究 在對側控制、Non-OA+PTH、Non-OA+PTH/PLG A、OA、ΟΑ+ΡΊΉ 201210610 矛OA+PTH/PLGA組巾之大鼠關節之關節軟骨的第二郷原蛋白染 色〈染成棕色〉之代表性顯微照片顯示於圖7〈八、師〇〉。測量第 二型膠原染色區蘭全部區域之比率〈棕色：全部〉並做各組間比 較〈圖7D〉。對側控麵節的標^全魏率於各組之職無顯著差 異；對侧控制關節内之軟骨的標色：全部比率，以及Ν(>η_〇Α+ρτΗ 和Non-OA+PTH/PLGA組中所研究之關節也都沒有顯著差異〈圖 7D〉c〇A組之研究關節軟骨中的棕色：全部比率則顯著低於以〇a誘 導五週的對側控制軟骨中的棕色：全部比率〈p<〇〇1〉〈圖7D〉。經 PTH〈1-34>處理五週後之〇A+PTH組之軟骨與對側控制軟骨並無顯 著差異〈®7D〉。五週後’ qa+pth/plgA組之棕色：全部比率則顯 著咼於OA組的掠色：全部比率〈p <〇.〇】〉〈圖〉。除此之外， OA+PTH/PLGA組之棕色：全部比率也與對侧控制軟骨無顯著差異。 在第五週’ OA+PTH、OA+PTH/PLGA和對側控制軟骨組之間沒有顯 著差異〈圖7D〉。 大鼠關節軟骨節中X型勝原之免疫組織化學研究 對側控制軟骨中，並沒有發現明顯的X型膠原蛋白染色之軟骨細胞 〈圖8A和8B>。免疫定位之X型膠原蛋白〈染成棕色〉主要在0A組之 關節軟骨細胞中被發現，但在處理五週後之OA+FTH和OA+PTH/PLGA 組軟骨中’則很少發現陽性染色（positive stained〉之細胞〈圖8A和8B〉。 一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目 21 201210610 標’並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發 明中之微小球及其製造鱗與方法乃較雜關的代表，其為示範性 且不僅侷赚本咖賴。熟知此技藝者时想職巾可修改之處及 其他用途。這些修改都蕴含在本發明的精神中，並在申請專利細中 界定。 本發月的内谷敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者 能夠製造及制本伽’即使其巾有各種獨的改變、料、及進步 之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。 說月曰中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般 技供為準所有專利和皱品都在此被納人_的參考程度，就如同 每-個個別ίϋ版品都被賊且侧地指㈣入參考。 在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許 多要件、關條件或並麵絲本文中所揭示的限制航下實施。所 ’同時並無意圖使用 使用的名概表達是作為·書之描述而非限制 這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需 認清的是，在本發明的專利中請範_有可能出現各種不_改變。 因此應了解獅然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發 明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的内容，諸如此類 的修改和變化仍在本發明之”專利範圍内。 22 201210610 【圖式簡單說明】 圖1 :包覆ΡΤΗ〈1-34〉之聚乳酸-甘醇酸〈PLGA〉微小球製造示意圖。 圖2 :包覆PTH〈1-34〉之聚乳酸-甘醇酸微小球之掃描式電子顯微鏡 (SEM)影像。 圖3 :〈a>為以粒徑分析儀〈particle size analyzer〉分析之微小球大小； 〈b〉以MTT分析之PTH〈1-34〉細胞毒性。 圖4 : PLGA〈50:50〉及PLGA〈65:35〉的累積釋放曲線。 圖5 :PLGA微小球釋出之ΡΤΗ〈1-34〉對MC3T3-E1細胞的生物活性 圖6:以番紅（Saftanin-O)染色的關節軟骨看其GAG量的組織分析圖。 這些圖分別為對側控制組、Non-OA+PTH、Non-OA+PTH/PLGA、OA、 OA+PTH和OA+PTH/PLGA組之被Safranin-O染色之大鼠對側脛骨近 端的關節軟骨。OA組中的OA+PTH組以PTH〈 1-34〉〈 10·8Μ〉每3 天處理1次，而〇A+PTH/PLGA0.4mg組每15天進行處理2次，同時 所研究之大鼠關節也列於圖中。每一個橫條分別代表八個樣本之平均 數土標準差。數據以單因子變異數分析〈〇newayanalysis()fvarianee， ANOVA〉’並使用薛費法〈Scheffe’smethod〉進行多重比較。 〈**〉P<0.01 ’於每個時間點，對側控制組與實驗組樣本做比較。〈##〉 p<0.01 ’於每個時間點，0A組中之實驗組樣本做比較。 圖 7 :對側控制組、N〇n_OA+PTH 組、Non-OA+PTH/PLGA 組、OA 組、 ΟΑ+ΡΤΉ組和OA+PTH/PLGA組中被染色之關節軟骨之第二型膠原蛋 白〈COL.II〉_織學分析結果。〇錄中代表性的為大鼠對側關節之 23 201210610 脛骨近端免疫染色關節軟骨，OA+PTH組以PTH〈 1-34〉〈 10-8M〉每 天處理1次，而OA組中的OA+PTH/PLGA 0.4mg組每ls天處理2 顯示的圖為所研究的大鼠關節。將生長板軟骨染色以作為正抑制 有以-抗染色之生長板與關節軟骨作為負鮮卜將第二型膠原蛋白染 為棕色。每—個碰分職表八麵本之平均數±縣差。轉以翠因 子變異數分析，並使用薛費法進行多重比較。 Ρ<0·01’於每個時間點’對側控制組與實驗組樣本做比較。〈細〉 ρ<0.01 ’於每個時間點，〇Α組中之實驗組樣本做比較。 圆《 .對惻控制組、Νοη_ΟΑ+ΡΊΉ組、Ν〇η_〇Α+ρ着遍組、〇α組、 晰ΤΗ組和OA+PTH/PLGA組中被染色之關節軟骨之乂型膠原蛋白 〈〇>^〉的_學分析縣。以财代表性的為大鼠對侧節之腔 骨近端免疫染色關節軟骨，0A+PTH組以PTH⑴4〉⑽8M〉每3 天處理i次，而OA組中的0A+PTH/PLGAG 4mg組每15天處理2次。 將生長板軟跑觸卿，咖之通與關節軟 骨作為負控制將X型膠原蛋白染為掠色。以箭頭指出X型膠原蛋白 被染色之軟f*每-個橫條分別代表八個樣本之平均數土標準差。數據 以單因子變異數分析，並使__進射重比較。 〈〉P<G.G1 ’於每個時間點，對側控制組與實驗組樣本做比較。〈絲〉 P<_’於每個時間點，〇A組中之實驗組樣本做比較。 附件1 ·圖1之彩色示意圖。 24 201210610 附件2 :圖6A之彩色示意圖。 附件3 :圖6B之彩色示意圖。 附件4 ·圖7A之衫色不意圖。 附件5 :圖7B之彩色示意圖。 附件6 :圖7C之彩色示意圖。 附件7 :圖8A之彩色示意圖。 附件8 :圖8B之彩色示意圖。 25 201210610 序列表 <110>高雄醫學大學 <120>由聚乳酸-甘醇酸（P0LY(LACTIC-C0-GLYC0UC ACID))微小球控制釋放副甲狀 腺素之方法 <130> 1183-KNU-US <160> 2 <170> Patentln version 3.4

<210> 1 <211> 84 <212> PRT <213> 人類(Homo sapiens) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(84) <400> 1

Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15 201210610

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45

Gin Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60

Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asn Val Asp Val Leu Thr Lys 65 70 75 80

Ala Lys Ser Gin <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> 人類(Homo sapiens) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(34) 201210610 <400> 2

Ser Val Ser Glu lie Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe

Claims (1)

1. 201210610 七、申請專利範圍： 1. -種控制釋放微小球，其平均粒徑大於5〇μπι。該微小球係藉由以下方 法製造：製備-包含有内水層的油包水〈w/o〉乳劑，該内水層含有藥 學上有效量的生物活性多肽，該多肽活性與副甲狀腺素相近；製備一 含有聚祕甘雜（PLGA)之聚合婦_層；接祕純水乳劑倒 入聚乙稀醇〈PVA>水溶液中以形成水包油包水〈w/Q/w〉雙乳劑並接 著將油層中的溶劑脫附掉。 2. 根據申請專利範圍第1項所述之微小球，其中該聚乳酸一甘醇酸〈pLGA〉 為 PLGA〈 50:50〉或 PLGA〈 65:35〉。 3. 根據申請專利範圍帛i項所述之微小球，其中該多狀的絲酸序列如 SEQ ID NO: 2 所示。 4. 根據帽專利細第丨鶴述之微小球，其中該多肽細定於含有鹽 酸和牛血清白蛋白之儲備溶液中。 5. 根據申請專利範圍帛i項所述之微小球，其中該鹽酸濃度為約imM到 約8mM ’牛血清白蛋白之濃度為約〇 〇1%到約5%。 6. 根據申請專利範圍第i項所述之微小球，其中該聚乙稀醇水溶液之重 量百分比濃度為約0.1%到約5%。 7. 一種製造平均粒徑大於50微米之控制釋放微小球的方法，包含：製備 一油包水〈w/ο〉乳劑，其包含一内水層，該内水層並含有藥學上有效 里的生物活性多肽，此生物活性多肽之活性與副曱狀腺素類似；製備 一含有聚乳酸__甘醇酸之聚合物質的油層；接著緩慢將油包水乳劑加入 聚乙烯醇水溶液中以形成水包油包水〈w/o/w〉雙乳劑並接著將油層中 201210610 谷削贶附掉 8.:::::::項―一醇一〉 、川·50> 或 PLGA〈65:35〉。 9·根據申請專利 仍肌2所示。 方法其中該多肽的胺基酸序列如SEQ 範圍第—法，其， 和牛血清白蛋白之儲傷溶液中。 巧孤酸 。項所述之方法，— 、 牛血/月白蛋白之濃度為約ο·οι%到約5%。 12·減_阶嫩微，㈣鳩咖約咖 Μ到約5 X 1〇 9M的有效治療濃度槪至少以天。 丨3.根射糊侧7項所述之方法，射娜烯醇水溶液之重量 百分比濃度為約0.1%到約5%。 14 .根據申請專卿第7項所述之方法，射該嫌性肽之包封率不 低於約60%。 15· -種控制釋放投遞具治療性多肽至—對象之方法，包含向該對象投予 平均粒徑大於5_之控懈放微姆，該微小球储由以下方法製 造：製備-包含有内水層的油包水乳劑，該内水層含有藥學上有效量 的生物活性多肽，該多肽活性與卿狀腺素相近；製備―含有聚乳酸_ 甘醇酸之聚合物質的油層；接著職包水乳綱人聚乙烯醇水溶液中 以形成水包油包水雙乳劑並接著將油層中的溶劑脫附掉。 16.根據申請專利範圍第15項所述之方法，其中該多狀的胺基酸序列如 201210610 SEQ ID NO: 2 所示。· 17. 根據申請專利範圍第15項所述之方法，其中該對象係患有副甲狀腺功 能不全症、骨疾病或軟骨疾病。 18. 根據申請專利範圍第17項所述之方法，其中該骨疾病為骨質疏鬆症或 骨壞死症。 19. 根據申請專利範圍第17項所述之方法，其中該軟骨疾病為骨關節炎。 20. 根據申請專利範圍第15項所述之方法，其中該對象係人類。