TW200835699A - Crystalline anti-hTNFalpha antibodies - Google Patents

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200835699 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用於使抗-hTNFa抗體結晶之批次結晶、去， 其允許以工業規模製備該抗體；如根據該方法獲得之抗體 晶體；含有該等晶體之組合物以及該等晶體及組合物之使 用方法。 【先前技術】 a)抗體晶體 目則有起過100種單株抗體正處於臨床研究第2期或第3 期評估，mAb市場可視為最具前景之生物醫藥市場之一。 由於該等藥物必須以通常超過100 mg之單劑量傳遞，因此 急需發現滿足穩定性、安全性及患者順應性之適當調配策 略。 然而，高度濃縮之液態mAb調配物展示增加之黏度、阻 礙注射器通過患者友好細針之能力。此外，當與中度濃縮 之溶液相比時，mAb分子在該等高濃度下之聚集趨勢呈指 數增加。總之，就安全性及穩定性要求而言，其不可接 受。 因此，高mAb劑量之傳遞受限於大體積，其通常必須經 由輸液傳遞。此給藥方式成本高且顯著降低患者之順應 性。 因此，高度需要用於皮下注射之醫藥學上可應用之低體 積mAb晶體懸浮液。理論上’歸因於蛋白質結構運動受阻 之晶格之剛性，影響mAb完整性之降解途徑應顯著減速。 125704.doc 200835699 此二’可預期當將高度濃縮之晶體懸浮液與液體調配物相 =黏度增加將顯著降低1於持續釋放，可能以使蛋白 :曰曰體進人患者體内時緩慢溶解之方式產生或改造蛋白質 曰曰體自於將防止損害mAb結構之賦形劑及方法廣泛應 用=此此舉將為傳遞持續釋放型調配物之極適宜方式。 儘管制蛋白f晶料為藥物具有極大潛力，但已進行 少數嘗試以系統地評估此策略。

ay沾知實例為胰島素，其在數十年以前已成功結晶。現 I已充刀私述胰島素晶體懸浮液之用途，其提供已在市 ^充刀Α "心之麵定且長效之調配物。開發胰島素晶體與 使所有其他蛋白質結晶之間的差異可能與有序胰島素聚集 田在胰腺中天然形成之事實有關。因&,當使胰島素與過 量鋅離子接觸時，胰島素晶體易於獲得。多數其他蛋白質 i向於形成無序沉澱物而非晶體，且因此發現蛋白質之結 晶條件為耗時且不簡單之任務。 k &對收集蛋白質晶體用於X射線繞射分析已產生極大 ，注’但由於基本上任何蛋白f均表現不同，因此發現適 田、、口日日條件之探索仍為經驗科學。至今，尚未發現可僅藉 由理性可罪地預測所選蛋白質之成功結晶條件的通則。因 獲得給疋蛋白質之晶體始終被稱為稍後無論設計任何 預定應用之"瓶頸”。 為使事物甚至更具挑戰性，歸因於分子之可撓性，抗體 經描述為尤其硬以便結晶。 ^而，長時間以來已知免疫球蛋白晶體之實例。J 5 〇年 125704.doc 200835699 前由英國醫師Henry Bence Jones描述免疫球蛋白晶體之第 一個實例，其自骨髓瘤患者之尿中分離出異常Ig輕鏈二聚 體之晶體（Jones 1848)。自此，該等異常Ig被稱作Benee Jones蛋白質。1938年，來自骨髓瘤患者血清之不同異常Ig 之自發結晶得以描述（von Bonsdorf，Groth等人1938)，其 顯然為Ig重鏈寡聚物（MW 200 kDa)。 在接下來的三十年裏，描述具有正常結構（兩個重鍵與 兩個輕鏈相連接）之結晶型人類免疫球蛋白，其亦主要自 骨髓瘤患者（Putnam 1955)分離。Davies及合作者最先使用 X-射線晶體繞射表徵稱為nDob”之完整人類骨髓瘤抗體之 結構（Terry，Matthews等人1968)，且在1971年確定其三維 結構（Sarma，Silverton等人1971)。其他人繼續其先行工

作，得到 IgG f’Kol”（Huber，Deisenhofer 等人 1976)、IgG ”Meg”（Rajan，Ely 等人 1983)及犬淋巴瘤 IgG2a(HaniS

Larson等人1992)之晶體結構。 免疫球蛋白晶體在再溶解後保留其特殊免疫學活,丨生。 Nisonoff等人於1968年報導易於結晶之兔抗·對-氮雜笨甲 酸酯抗體ΠΧ4”。抗體X4在結晶前以及在晶體再溶解後經廣 泛表徵。發現[1251]-對-碘苯甲酸酯與再溶解之Χ4特異性地 且有效結合；再溶解之晶體亦顯示對未純化兔血清典型之 多特異性 Ouchterlony 免疫擴散反應（Nisonoff，Zappacosta 等人1968)。Connell及合作者描述稱為"Tem”之人類骨髓瘤 γ-免疫球蛋白-lK(IgG-K)，其在低溫下自血清自發地結晶 (Connell，Freedman等人1973)。發現Tem晶體充分形成且 125704.doc 200835699 具有菱面體對稱。含有Tem之血清經瓊脂糖免疫擴散技術 廣泛表徵。Tem晶體之再溶解溶液之電泳及免疫擴散展示 其與藉由冷凍沉澱法獲自血清之物質相同且與分離之骨髓 瘤蛋白相同（Connell，Freedman等人 1973) 〇

Mills及合作者於1983年報導由白蛋白之人類單株抗體導 致的異常晶體冷球蛋白血症（Mills，Brettman等人1983)。 此處，自兩個患者中分離到極相似立方形晶體。將晶體再 溶解接著進行電泳及免疫電泳指示該等晶體包含兩種比率 為1之蛋白質組份，單株IgG-λ及人類血清白蛋白 (Jentoft，Dearborn等人1982)。藉由溶解原始晶體接著進行 管柱層析以製備規模分離該等組份。儘管任一分離組份自 身並不結晶，但重組合後原始二分複合物重新形成且隨後 結晶。再溶解、分離之IgG及其Fab片段與人類血清白蛋白 之獨特沉澱特徵及免疫學反應性之深入研究指示兩個再溶 解、分離之組份之重新締合在性質上具有免疫性，亦即結 晶型抗體再溶解後仍具有其原生之高度特異性（對於人類 血清白蛋白）結合特徵（Mills，Brettman等人1983) 〇 近來，Margolin及合作者報導結晶型抗體之潛在治療用 途（Yang，Shenoy等人2003)。其發現治療性單株抗體曲妥 珠單抗（trastuzumab)(Herceptin®)可結晶（Shenoy，Govardhan 等人2002)。結晶型曲妥珠單抗懸浮液在小鼠腫瘤模型中 具有治療功效，因此證明結晶型曲妥珠單抗保留其生物活 性（Yang，Shenoy 等人 2003)。 b)結晶技術 125704.doc 200835699 不同於某些其他科學或工程學努力，各種蛋白質之結晶 不能使用確定之方法或演算法成功進行。當然，如世界著 名蛋白質結晶專家A· McPherson所解釋，在最近2〇-3〇年間 存在極大技術進步。McPherson提供關於大分子結晶之策 略、對策、試劑及裝置之廣泛細節。然而其並未提供轉保 任何給定大分子實際上可藉由熟習此項技術者以合理成功 期望值結晶之方法。McPhers〇n說明（例如）··，，無論任何程 序必須投入精力改善並優化系統（包括溶劑與溶質兩者）之 參數，以促使且促進分子之間的特異性結合相互作用且使 其形成後穩定。問題之此後_方面通常依賴於所結晶的特 定蛋白質或核酸之特定化學及物理特性，，（Mcphers^ 1999 ，第 159頁）。 蛋白質結晶技術内熟習此項技術者廣泛公認不存在獲得

所關注之新蛋白質、應用確定加工步驟且由此獲得所需晶 體之演算法。 M 數種市售筛選系統（例如Hampt〇n !及2、认叩 允許以微升規模篩選特定蛋白質之潛在適當結晶條件。然 而’遠4選系統獲得之陽性結果未必允許以較大、工業上 可應用之批次規模成功結微升尺度之結晶試驗向工業 尺度之轉化經描述為具有挑戰性之任務（參見Jen等人， 2001) 〇 ^aldock等人（1996)報導微批次與汽相擴散用於初始筛選 =s曰條件之比較。使用一組結晶溶液篩選六種市售蛋白 貝。使用最普通汽相擴散法及三種微批次結晶法之變化形 125704.doc 200835699 式（包括新穎蒸發技術）進行該等篩選。在所鑑別出之58個 結晶條件中43個（74%)由微批次鑑別出，而41個（71%)由汽 相擴散鑑別出。26個條件由兩種方法共同發現，且若根本 未使用微批次則17個（29%)條件將錯失。此展示最通常用 於初始結晶篩選之汽相擴散技術並不保證陽性結果。 c)hTNFa抗體晶體 認為人類TNFa(hTNFci)為許多疾病之病原體。因此存在 對治療該等hTNFa相關病症之適當方法的巨大需要。一種 具有前景之治療方法包含投予醫藥學上有效劑量之抗人類 TNFa抗體。近來命名為D2E7或通稱名為阿達木單抗 (adalimumab)之一種該抗體已進入市場且以商標HUMIRA® 銷售。 WO-A-02/072636揭示完全、完整抗體利妥昔單抗 (Rituximab)、英利昔單抗（Infliximab)及曲妥珠單抗 (Trastuzumab)之結晶。以毒性尚不清楚之化學品進行多數 結晶實驗，如咪唑、2-環己基-乙烷磺酸酯（CHES)、甲基 戊二醇、硫酸銅及2-嗎啉-乙烷磺酸酯（MES)。多數實例使 用晶種以啟始結晶。 WO-A-2004/009776揭示使用沉滴汽相擴散技術藉由混 合等體積（1 μΐ)之不同結晶緩衝液及D2E7 F(ab)’2或Fab片 段進行之微升規模之結晶實驗。儘管報導該等片段中之每 一者的數種實驗條件，但未報導完全、完整D2E7抗體之 成功結晶。 因此不可獲得製備任何給定抗人類TNFa完全抗體、尤 125704.doc -11 - 200835699 其D2E7之晶體的方法。 因此根據本發明待解決之問題為開發用於抗_hTNFa抗 體、尤其人類抗-hTNFcx抗體咖7之冑當批次結晶條件， 且確定可應詩對於X業抗體晶體製倚相關之體積之結晶 過程條件。同時應確定並不利用可負面影響該等抗體之醫 藥適用性的毒性劑之結晶方法。 【發明内容】 意外地，藉由以下觀測結果解決上述問冑：可能藉由應 用生理學上可接受之無機磷酸鹽作為結晶誘導劑，以高於 微升規模之批次結晶體積獲得完全抗如服抗體之晶體。 較佳實施例 本發明之第-態樣係關於用於使抗_hTNFa抗體結晶之批 次結晶法，其包含以下步驟： Θ如⑼#)藉由混合該抗體之水溶液（其中抗體較佳以溶解 形式存在）與包含作為結晶劑之呈溶解形式之無機磷酸 鹽的水性結晶溶液，或者藉由添加該呈固體形式之結晶 劑，提供遠抗體與作為結晶劑之無機磷酸鹽混合的水溶 液；及 b)培育該水性結晶混合物直至形成該抗體之晶體。 通吊在、.、勺pH 3至約5、尤其約3.5至約4 5或約3 7至約ο 之範圍内的該水性結晶混合物之p H值下執行本發明之結晶 方法。 此外’該水性結晶混合物可含有至少一種緩衝劑。該緩 衝劑可尤其包含乙酸鹽組份作為主要組份，尤其鹼金屬 125704.doc -12- 200835699 ^ 尤其乙酸鈉。藉由添加酸、尤其乙酸將該鹽調節至所 需PH值。在結晶方法之一較佳實施例中，該水性結晶混合 物中之緩衝劑濃度（總乙酸鹽）為〇至約〇·5 M或約〇〇2至約 0 · 5 Μ，例如約〇 · 〇 5至約〇 · 3 μ或約〇 · 15至約〇 · 2 Μ。 在本發明之結晶方法之另一特定實施例中，用作沉澱劑 之填酸鹽係選自磷酸氫鹽，諸如磷酸單氫鹽或磷酸二氫 鹽、尤其銨鹽或鹼金屬鹽，例如含有Na+或κ+離子之鹽或 其包含至少兩種不同鹽之混合物。適當實例為：

NaH2P〇4、Na2HP〇4、Κη2ρ〇4、κ2Ηρ〇4、NH4H2p〇4、 (ΝΗ4)2ΗΡ04及其混合物。 尤其’結晶混合物中之填酸鹽濃度在約1至約6 Μ之範圍 内’例如約1.0至約4.0 Μ或約1.0至約3·0 Μ或約1_5至約2.8 Μ或約2.0至約2.6Μ之範圍内。 在本發明之一較佳實施例中，以約1:1之比率組合蛋白 質溶液及結晶溶液。因此，原始結晶溶液中緩衝劑/結晶 劑之莫耳濃度約高達結晶混合物中之2倍。 通常，以約1 ml至約20000卜或1 ml至約15〇〇〇卜或！ ml至約12000卜或約！ mi至約1000〇丨，或i ml至約6〇〇〇 1，或1 ml至約3000 1，或1 ml至約1〇00 !，或！ ml至約ι〇〇 1，例如約50 ml至約8000 ml，或約1〇〇 mi至約5000 m卜或 約1000 ml至約3000 m卜或約1 1至約1〇〇〇 1，或約10 !至約 5 00 1範圍内之批次體積執行結晶方法。 另外，可執行本發明之結晶方法以便獲得以下其他結晶 條件中之至少一種： 125704.doc -13- 200835699 a) 執行培育歷時約1小時至約60天之間，y , 1例如約1至約30天 或約2至1〇天； 王天 b) 在介於約〇。〇與約50°c之間，例如 下執行培育； 。之溫度 c) 結晶混合物中之抗體濃度（亦即蛋曲 / ^ , 曰貝，辰度）在約1至200 mg/ml或1至100 mg/ml之範圍内， I甘备仏 上·5至2〇 mg/m卜 H勺2至15 mg/mUe10 mg/ml範圍内。可 白貝測定之標準程序測定蛋白質濃度。 根據一尤其較佳方法，在以下結 結晶： 磷酸鹽： NaH2P04 緩衝劑： 總乙酸鹽 pH: 3.6至 4.2 抗-hTNFa濃度： 3 至 10 mg/ml 溫度： 18至 24X： 批次體積： 1 至 100 1 攪拌： 無 持續時間： 4至15天 至 2.5 Μ 0至 〇·3 Μ k吊精由添加在溶液中或呈固 曰· 日日此合物之條件下執行 砹形式之結晶劑至蛋白質 >谷液中來獲得如上文概述之社曰、日 貝 ^ 又概迷之、、Ό日日混合物。兩種溶液可但不 必經緩衝。由於結晶混合物經蛋白皙+ y ,,錘Μ η 貝溶液稀釋，因此原 二：：：中之結晶劑莫耳濃度及緩衝劑莫耳濃度通常高 於、、、口日日化合物中之濃度。 在另一實施例中，本發明 不乂月1、、、〇晶方法可進一步包含乾燥 125704.doc -14- 200835699 所得晶體之步驟。適當乾燥方法包含蒸發式乾燥、喷霧乾 無：冷象乾燥、真空乾燥、流化床乾燥、噴霧冷柬乾燥、 近^界乾燥、超臨界乾燥及氮氣乾燥。 在另一實施例中，本發明之6士 s 士、 、 A月之結晶方法可進一步包含藉由 離心、透濾、、超滤或其他當用 吊用緩衝液交換技術以不同緩衝 液交換結晶母液之步驟，例如含 〜划3有其耳質量在約3〇〇至 8000道爾頓（Dalton)範圍內夕取7 _ Μ固円之聚乙二醇（PEG)或PEG混合物 的緩衝液。

本發明亦係關於可藉由如M t 柯田如以上所定義之結晶方法獲得的 抗_hTNFa抗體之晶體且一妒丄 股而吕係關於抗-hTNFa抗體之 晶體。 本發明之晶體之特徵通常在於針狀形態，其最大長度】 為約2-500，或約刚·3〇〇 _，且1/d比率為約3至3〇，但 亦可具有其他幾何外觀。 該晶體可獲自多株抗體或較佳獲自單株抗體。 詳言之，該抗體係選自由非篏合或嵌合抗體、人類化抗 體、非糖基化抗體、人類抗體及小鼠抗體組成之群。詳言 之，待結晶之抗體為視情況進一步加工以便改良抗原結合 性之非嵌合人類抗體。 較佳地’該等晶體係獲自IgG抗體，諸如IgG1、IgG2、

IgG3或IgG4抗體。詳言之，該抗體為群IgG1之完全抗人頬 TNFa抗體。 在一較佳實施例中，晶體係自分離人類抗體製備，該分 離人類抗體藉由表面電漿共振測定以1><1〇·8 M或更低、更 125704.doc -15- 200835699 佳lxio·9 Μ或更低且甚至更佳5χ10·1() Μ或更低之KdA 1χ1(Γ3 s·1或更低之Ka速率常數與hTNFa解離，且在標準活 體外L929檢定中以lxl〇·7 Μ或更低之ICso中和hTNFa細胞 毒性。 詳言之，該等晶體可自分離人類抗體以以下特徵製備： a)如藉由表面電漿共振測定以ixi〇_3 s·1或更低之k()ff速率常 數與人類TNFa解離；b)具有輕鏈CDR3域，其包含SEQ ID N〇: 3或藉由在位置i、4、5、7或8經單個丙胺酸取代或藉 由在位置1、3、4、6、7、8及/或9經1至5個保守胺基酸取 代自SEQ ID NO: 3修飾之胺基酸序列；c)具有重鏈cdr3 域’其包含SEQ ID NO: 4或藉由在位置2、3、4、5、6、 8、9、1〇或U經單個丙胺酸取代或藉由在位置2、3、4、 5、6、8、9、10、11及/或12經1至5個保守胺基酸取代自 SEQ ID NO: 4修飾之胺基酸序列。 、 更佳地，抗體或其抗原結合部分以5xl〇·4 s·1或更低之 koff與人類TNFa解離。甚至更佳地，抗體或其抗原結合部 分以xl〇-4 s·1或更低之]^與人類TNFa解離。 在一尤其較佳實施例中，自具有包含SEq ID NO: 1之胺 基酸序列的輕鏈可變區（LCVR)及包含SEQ ID N〇: 2之胺基 酉文序列的重鏈可變區（HCVR)之分離人類抗體製備該等晶 體。 最佳為如WO-A-97/2913 1所揭示自抗體D2E7或其功能等 效物製備之晶體。該抗體係在中國倉鼠卵細胞（Chinese hamster 0vary cell)中重組產生且其包含seq ι〇 n〇: 6之重 125704.doc -16 - 200835699 鏈序列及SEQ ID NO: 5之輕鏈序列。 在另f施例中，本發明係關於固體、液體或半固體醫 藥組合物，其包含⑷如請求項15至26中任一項之抗初邮 抗體之aa體’及⑻至少_種醫藥學上可接受之穩定維持該 等抗體晶體之賦形劑。 本發明之另一態樣係關於固體、液體或半固體醫藥組合 物，其包含：⑷如本文中所定義之抗_hTNFa抗體之晶 體；及（b)至少一種醫藥學上可接受之囊封或包埋該等抗體 晶體之賦形劑。該組合物可進—步包含⑷至少—種醫藥學 上可接受之穩定維持該等抗體晶體之賦形劑。此外，可聯 合執行囊封及包埋。 詳言之，該等組合物可具有高於約【mg/ml、尤其約2〇〇 11^/1111或更冋、例如約2〇〇至約6〇〇111§/1〇1或約3〇.〇至約5〇〇 mg/ml之抗體晶體濃度。 該等賦形劑可包含至少一種聚合型、視情況可生物降解 之載劑或至少一種油劑或脂質載劑。 該等聚合型載劑可為選自由以下各物組成之群中之一或 多者之聚合物··聚（丙烯酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚（胺基 酉夂）、聚（酐）、聚（縮肽）、聚（g旨）、聚（乳酸）、聚（乳酸_共_ 乙醇酸）或PLGA、聚（β-羥基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二 噁酮）、聚（乙二醇）、聚（羥丙基）甲基丙烯醯胺、聚（有機） 磷氮烯、聚（原酸i旨）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯。比咯啶_)、順 丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多元醇、白蛋白、 海藻酸S旨、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋 I25704.doc 17 200835699 白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚糖、硫酸化多醣、 其摻合物及共聚物。 該等油（或油性液體）可為選自由以下各物組成之群中之 一或多者之油（或油性液體）：油性杏仁油、玉米 油、油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油、 輕質礦物油、辛基十二烷醇、橄欖油、花生油、杏仁油、 芝麻油、大豆油、角鯊烷、液體甘油三酯、液體壤、高級 醇。

該脂質載劑可為選自由以下各物組成之群中之一或多者 之脂質：脂肪酸及脂肪酸鹽、脂肪醇、脂肪胺、脂肪酸之 單甘油醋、甘油二醋及甘油三醋、磷脂、醣脂、留醇=蠟 及相關類似物質。蠟進一步分類為天然及合成產品。天然 物質包括獲自植物、動物或礦物來源之蠟，諸如蜂蠟、巴 西蠟棕或褐煤蠟。氯化萘及烯系聚合物為合成蠟產品之實 例0 在-較佳實施例中’該組合物為包含如以上所定義抗 hTNFa抗體晶體且抗體晶體濃度在約1()至約彻或約5〇至 約300 mg/ml範圍内之可注射組合物。 在另-態樣中，本發明係關於包含如以上所定義之抗_ hTNFa抗體晶體且抗體晶體濃度高於約i⑽、例如為 約15〇至約_ mg/ml或約至約4〇〇 一之晶體聚液。 本發明亦係關於用於#落者 ^ ，口廉_礼動物之方法，其包含向該 甫礼動物技予有效里之如以上所定義完全抗抗體晶 體或有效量之如以上所定義組合物之步驟。較佳地，藉由 125704.doc -18- 200835699 非經腸途徑、經口途徑或藉由注射投予該組合物。 此外，本發明係關於治療個體中hTNFa相關病症之方 法其包含投予治療有效量之如以上所定義之抗體晶體。 詳言之，該hTNFa相關病症係選自： 自體免疫疾病，尤其類風濕性關節炎、類風濕性脊椎 炎、骨關節炎及痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化症、 自體免疫性糖尿病、自體免疫性葡萄膜炎及腎病症候群； 感染性疾病、移植物排斥或移植物對抗宿主疾病、惡性疾 病、肺部病症、腸道病症、心臟病症、發炎性㈣病症、、 骨再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴發型肝炎、 凝血障礙、燒傷、再灌注損傷、瘢痕瘤形成、瘢痕組織形 成、發熱、牙周疾病、肥胖症及輻射毒性；脊椎關節病、 肺部病症、冠狀動脈病症、代謝障礙、貧血、疼痛、肝病 症、皮膚病症、指甲病症或脈管炎、白塞氏病（Behcet，s chsease)、強直性脊椎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、特發性肺纖維化（IPF)、再狹窄、糖尿病、貧 血、疼痛、克羅恩氏病（Crohn’s disease)相關病症、青年類 風濕性關節炎（JRA)、C型肝炎病毒感染、牛皮癖、牛皮癬 性關節炎、慢性斑塊牛皮癬、年齡相關惡病質、阿茲海默 氏症（Alzheimer’s disease)、腦水腫、發炎性腦損傷、慢性 疲勞症候群、皮肌炎、藥物反應、脊髓中及/或其周圍水 腫、家族性週期性發熱、費爾提氏症候群（FeUy，s syndrome)、纖維化、絲球體腎炎（例如鏈球菌感染後絲球 體腎炎或IgA腎病）、假肢鬆動、顯微鏡下多血管炎、混合 125704.doc -19- 200835699

型結缔組織病症、多發性骨髓瘤、癌症及惡病質、多器官 病症、骨髓發育不良症候群、睪丸炎性（orchitism)、骨質 溶解、包括急性、慢性及胰膿腫之胰腺炎、牙周疾病、多 發性肌炎、進行性腎衰竭、假性痛風、壞疽性膿皮病、復 發性多軟骨炎、風濕性心臟病、類肉瘤病、硬化性膽管 炎、中風、胸腹主動脈瘤修復（TAAA)、TNF受體相關週期 性症候群（TRAPS)、與黃熱病疫苗接種有關之症狀、與耳 相關之發炎性疾病、慢性耳部炎症或小兒耳部炎症、葡萄 '炎、坐骨神經痛、前列腺炎、子宮内膜異位、脈絡膜新 血官生成、狼瘡、修格蘭氏症候群（SjGgren，s —me)及 濕性黃斑退化。 匕卜本發明係關於如以上所定義之完全抗_hTNFa抗體 曰曰體用於製備用以治療如以上所定義之π，相關疾病之 醫藥組合物的用途。 最後，本發明提供如以上所定義適用於藥物之抗-hTNFcx 抗體晶體。 【實施方式】 A.定義 ”批次結晶方法，，包含向待結晶之抗體溶液中添加包/ 仫呈/奋解形式之結晶劑的結晶溶液之步驟。 可基於（例如）汽相#散之，，小規模結晶方法"包含以一 升範圍内小體積之抗體溶液與含有結晶 —滴該混合物鄰近於該儲液器緩衝液3 刀…i於—密封容器中；允許液滴與儲液器之間· 125704.doc -20- 200835699 劑藉由汽相擴散交換，在此期間該液滴之溶劑含量變化且 若達到適當結晶條件則可觀測到結晶。 在磷酸鹽存在情況下，”結晶劑”有利於待結晶抗體之晶 體形成。 ”結晶溶液π含有該呈溶解形式之結晶劑。較佳地，該溶 液為水性系統，亦即其液體組份主要由水組成。例如，8〇 至100 wt%或95至1〇〇 wt%或98至100 wt%可為水。 抗體B曰體為該蛋白質之一種固態物質形式，其與第二 固體形式（亦即基本上呈無組織、異質固體形式存在之非 晶形狀態）不同。晶體具有規則三維結構，通常稱為晶 格。抗體晶體包含抗體分子之規則三維陣列。參見Giege， R·及 Ducruix，A· Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第二版，第 i-i6 頁， Oxford University Press，New York (1999) 〇 如根據本發明結晶之，，完全，，或，1完整，，抗-hTNFa抗體為能 夠在活體外及/或活體内識別其抗原人類TNFa且與其抗原 人類TNFa結合的功能抗體。抗體可啟始與抗體與其抗原 結合相關的患者之後續免疫系統反應，尤其直接細胞毒 性、補體依賴型細胞毒性（CDC)及抗體依賴型細胞毒性 (ADCC) 〇抗體分子具有由兩個彼此共價結合之相同重鏈 (MW各為約50 kDa)及兩個各與重鏈中之一者共價結合的 相同輕鏈（MW各為約25 kDa)組成之結構。4條鏈以典型 ΜΥΠ基元排列。各重鏈由重鏈可變區（本文中縮寫為HCVR 或VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個域（CHI、CH2 125704.doc -21 - 200835699 及CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區（本文中縮寫為lCVR或 VL)及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個域。乙組成。vh 及VL區可進一步再分成稱為互補判定區（CDR)之高變區， 其中散布有稱為框架區（FR)之較保守區域。各vh及VL包 含3個CDR及4個FR，其自胺基末端至羧基末端按以下順序 排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。完 整抗體分子具有兩個抗原結合部位，亦即其為”二價的，，。 忒兩個抗原結合部位對於一種hTNFa抗原具有特異性，亦 即該抗體具有”單特異性”。 單株抗體π為獲自B淋巴細胞（b細胞）之單純系且識別同 一抗原決定子之抗體。完全單株抗體為彼等具有上述包括 兩個完整重鏈及兩個完整輕鏈之典型分子結構之抗體。通 常藉由融合產生抗體之Β細胞與永生骨髓瘤細胞以產生在 細胞培養物中持續產生單株抗體之Β細胞融合瘤來製備單 株抗體。可利用其他製備方法，例如在細菌、酵母、昆蟲 或哺乳動物細胞培養物中使用噬菌體顯示技術表現單株抗 體；在諸如已經修飾以含有且表現全部人類Β細胞基因組 的牛、山羊、豬、兔、雞或轉殖基因小鼠之遺傳修飾之動 物中活體内製備；或在諸如煙草及玉米之遺傳修飾之植物 中製備。可根據本發明結晶來自所有該等來源之抗_hTNh 抗體。 待根據本發明結晶之單株抗體包括，，嵌合”抗_hTNh抗 體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與獲自特定物種或屬於 特定抗體類別或子類的抗體之相應序列一致或同源，而鏈 之其餘部分與獲自另一物種或屬於另一抗體類別或子類的 125704.doc -22· 200835699 抗體之相應序列一致或同源。舉例而言，可提及含有鼠類 抗體之可變抗原結合部分及獲自人類抗體之恆定部分的小 鼠/人類嵌合體。 亦涵蓋非人類（例如鼠類）抗-hTNFα抗體之，，人類化，，带 式。其為含有獲自非人類免疫球蛋白的最小序列之嵌合抗 體。在很大程度上，人類化抗體為使來自人類免疫球蛋白 之互補決定區（CDR)或高變環（HVL)的殘基經來自諸如小 鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物的非人類物種之具有所 需功能性之CDR或HVL的殘基置換之人類免疫球蛋白。人 類免疫球蛋白之框架區（FR)殘基可經相應非人類殘基置換 以改良抗原結合親和力。此外，人類化抗體可包含相應人 類或非人類抗體部分中均不存在之殘基。該等修飾對於進 一步改良抗體功效而言可為必需的。 ’’人類抗體”或"完全人類抗體”為具有對應於由人類產生 或重組產生之抗體之胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。如 本文中所用，術語”人類抗體”意欲包括具有獲自人類生殖 系免疫球蛋白序列的可變及恆定區之抗體。本發明之人類 抗體可在例如CDR且尤其CDR3中包括並非由人類生殖系 免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如在活體外藉由隨 機或位點特異性突變誘發或在活體内藉由體細胞突變而引 入的突變）。然而，如本文中所用，術語，，人類抗體，，不欲包 括已將獲自諸如小鼠之另一哺乳動物物種之生殖系的Cdr 序列接枝於人類框架序列上之抗體。 如本文中所用，術語，，重組人類抗體，，意欲包括藉由重組 方法製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用 125704.doc -23 · 200835699 轉染入宿主細胞之重組表現載體表現之抗體，自重組、組 合人類抗體文庫分離之抗體，自人類免疫球蛋白基因轉殖 基因動物（例如小鼠）分離之抗體（參見例如Tayl〇r，L.D·，等 人（1992) Nucl· Acids Res· 20:6287-6295)，或藉由任何其 他涉及剪接人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之方 式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具 有獲自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變及恆定區。然而 在某些實施例中，該等重組人類抗體係經受活體外突變誘 發（或當使用人類Ig序列轉殖基因動物時，則為活體内體細 胞突變誘發）且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為 當獲自人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系Vh及vl 序列相關時在活體内可不天然存在於人類抗體生殖系庫内 之序列。 如本文中所用，”中和抗體”（或，，中和hTNFa活性之抗 體”）意欲指與hTNFa之結合引起hTNFa之生物活性受抑制 的抗體。可藉由量測hTNF a生物活性之一或多種指標評估 hTNFa生物活性之該抑制，該或該等指標諸如hTNFa誘發 之細胞毒性（活體外或活體内）、hTNFa誘發之細胞活化及 hTNFa與hTNFa受體之結合。可藉由在此項技術中已知之 數種標準活體外或活體内檢定中之一或多者評估hTNFa生 物活性之該等指標。較佳地，藉由抑制L929細胞中hTNFa 誘發之細胞毒性來評估抗體中和hTNFa活性之能力。作為 hTNFa活性之另一或替代性參數，可評估抗體抑制hTNFa 誘發之ELAM-1在HUVEC上表現的能力，以作為hTNFcx誘 125704.doc •24· 200835699 發細胞活化之量度。 ”親和力成熟”抗-hTNFa抗體為一或多個高變區中具有一 或多種使得與親本抗體相比抗體對抗原之親和力改良的變 化之抗體。親和力成熟抗體對標靶抗原將具有奈莫耳或甚 至皮莫耳之親和力值。藉由在此項技術中已知之程序產生 親和力成熟抗體。Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述藉由VH及VL域改組進行親和力成熟。Barbas等 人，Proc· Nat· Acad· Sci. USA 91:3809-3813 (1994) ; Scier 等人，Gene 169:147-155 (1995) ; Yelton等人，J. Immunol. 155:1994-2004 (1995) ; Jackson等人，J· Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995);及 Hawkins 等人，J. Mol Biol. 226:889-896 (1992)描述CDR及/或框架殘基之隨機突變誘發。 如本文中所用，”分離抗體’’意欲指大體上不含具有不同 抗原特異性之其他抗體的抗體（例如特異性結合hTNFa之分 離抗體大體上不含特異性結合除hTNFa以外之抗原的抗 體）。然而特異性結合hTNFa之分離抗體可對其他抗原（諸 如來自其他物種之hTNFa分子）具有交叉反應性。此外，分 離抗體可大體上不含其他細胞物質及/或化學品。 如本文中所用，術語π人類TNFa"(本文中縮寫為hTNFa 或簡寫為hTNF)意欲指以17 kDa分泌形式及26 kDa膜結合 形式存在之人類細胞激素，其生物學活性形式包含非共價 結合分子之三聚體。hTNFa之結構進一步描述於（例 如）Pennica，D.，等人（1984) Nature 312:724-729 ; Davis， J_M.，等人（1987) Biochemistry 26:1322-1326 ;及 Jones， 125704.doc -25- 200835699 Ε·Υ·，等人（1989) Nature 338:225-228 中。術語人類 TNFa 意欲包括重組人類TNFa(rhTNFa)，其可藉由標準重組表 現方法製備或在市面上購得（R&D Systems，目錄號21〇_ TA，Minneapolis，MN)。 如本文中所用，術語，，k〇ff”意欲指抗體自抗體/抗原複合 物解離之解離速率常數。 如本文中所用，術語，’Kd"意欲指特定抗體_抗原相互作 用之解離常數。

如根據本發明結晶之特異性"親本"抗·hTNFa抗體之"功 能等效物"為展示相同抗原特異性，然而關於"親本"抗體 在胺基酸水平或糖基化程度方面分子組成不同之抗體。然 而°亥等差異可僅使得結晶條件並未偏離如本文中揭示之 參數範圍。 ^ 抗體晶體之"囊封π係指所併入晶體經至少-層塗層物質 個別塗佈的調配物。在-較佳實施例中，t亥等塗佈晶體可 具有持續溶解速率。 抗體晶體之"包埋"係指經囊封或未經囊封之晶體以分散 方式併人固體、液體或半固體載劑中之調配物。該等包埋 結晶抗體分子可以受控、持續方式自載劑中釋放或溶解。 B ·結晶方法 本發明之結晶方法原則上可適用於任何抗-hTNFa抗體 該等抗體可為多株抗體或較佳為單株抗體。該抗體可為 ，抗體、人類化抗體、人類抗體或例如小鼠抗體之非人 抗體，其各呈糖基化或非糖基化形式。該方法尤其適用 D2E7及其功能等效物。 125704.doc -26 - 200835699 較佳地，該抗-hTNFa抗體為IgG抗體，尤其群1§(}1之抗 人類TNFa抗體。 除非另作說明，否則本發明之結晶方法利用在此項技術 中熟知之技術設備、化學品及方法。然而，如上文所說 明，本發明係基於以下意外觀測結果：特定結晶條件之選 擇、尤其特定結晶劑之選擇視情況進一步與特定pH條件 及/或相應試劑（緩衝劑、抗體、結晶劑）之濃度範圍組合首 次允許可再現地且以大規模製備針#hTNFa之抗體、尤其 非肷合人類抗體之穩定晶體，其可經進一步加工以形成優 良、咼度有利醫藥組合物之活性成份。 執行該結晶方法之起始物質通f包含待結晶抗體之濃縮 溶液。蛋白質濃度可（例如）在約5至75 mg/ml範圍内。該溶 液可含有使該溶解抗體穩定之添加劑，且預先移除該等添 加劑可為明智的。可藉由執行緩衝液交換步驟實現此舉。 較佳地，該用以執行結晶之起始物f含有於具有經調節 在約3.2至8.2或約4.0至8·0、尤盆约4 A《土 ^ 八、、0 4.5至6·5、較佳約5.0至 5 · 5範圍内之pH值的水溶液中之於辨 ^ 之抗體。可藉助於以約1至50 mM、尤其約1至10 mM之最終澧声座田 、辰度應用之適當緩衝劑調節 pH值。該溶液可含有如鹽、糖、 ^ 糖％及界面活性劑之添加 劑’例如其比例以溶液之總重量 卞為約0·01至15或0.1至5 或〇 · 1至2 Wt%，以進一步稃定、、交、、右 乂1疋/合液。職形劑較佳選自生理 上可接受之通常應用於醫藥製劑 可槎另a , χΤ Μ之化口物。非限制性實例 τ徒及鹽，如NaC1 ;界面活 取 如聚山梨醇酯80(吐溫 ⑽）、聚山梨醇酯20(吐溫20);糖， 庶糖、海澡糖；糖 125704.doc -27- 200835699 I如甘祕ι山梨糖醇；及緩衝劑，如嶙酸鹽基缓衝 ，如以上所定義之鱗酸氫納及填酸氫卸緩 酸 ，緩衝液、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、TRIS緩衝 2::::二:f緩衝液或丁二酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝 ，夜，胺基酸，如組胺酸、精胺酸及甘胺酸。 可藉助於例如滲析或超濾之常規方法執行緩衝液交換。

用作起始物質之水溶液之初始蛋白質濃度應在約至 、’、、2〇〇或約1至約50 mg/mi範圍内。 =定最終批次量（其可在1 ml至20000(二萬）公升範圍 疋’將初始體積之該水性抗體溶液置於由惰性材料 T如破璃、聚合物或金屬）製成之適當容器（例如管狀容 :、瓶或槽）中。該水溶液之初始體積可對應於最終批次 1之約30至80%、通常約50〇/〇。 、必要時，填充入該容器後可使溶液達至標準化條件下。 尤其，將溫度調節為在約4。〇及約37〇c範圍内。 =著將視情況以與抗體溶液相同之方式預先調節的含有 適當濃度之結晶劑之結晶溶液添加至抗體溶液中。 視情況在適度攪拌下持續或間斷地進行結晶溶液之添加 乂促進兩種液體之混合。較佳地，在振盪下在提供蛋白質 洛液之條件下進行添加且以受控方式添加結晶溶液（或呈 固體形式之結晶劑）。 精由應用如以上所定義之磷酸鹽、尤其磷酸氫鹽且較佳 至屬里或至少兩種不同驗金屬鹽之混合物作為結晶劑來 體曰曰體之形成。結晶溶液含有濃度足以在該結晶混 125704.doc -28 - 200835699 合物中提供範圍在約1至6 Μ内的磷酸鹽之最終濃度之結晶 劑0 較it地’結晶溶液另外含有酸性緩衝劑，亦即不同於抗 體溶液之緩衝劑之緩衝劑，其濃度適於允許將結晶混合物 之pH值調節至約3至5之範圍内。 在該結晶溶液之添加完成後，可將因此獲得之混合物進 一步培育約1小時至約6〇天以獲得最高產量之抗體晶體。

右適當，則混合物可（例如）經攪拌、適度攪拌、橫搖或以 本身已知之方式移動。 敢後可藉由已知方法、例如過濾或離心分離所獲得之 曰曰體例如藉由在室溫或4°C下在約200-20000 rpm、較佳 5 00 2000 rpm下離心。可拋棄或進一步處理剩餘母液。 若必要’則可洗滌且隨後乾燥因此所分離之晶體，或可 ^適於儲存及/或最終使用懸浮於其中之抗體的不同溶劑 系統交換母液。 根據本發明形成之抗體晶體形狀可變化。形狀通常可包 括針狀、錐狀、球狀及海膽狀形狀。晶體之尺寸可為高於 ，晶體尺寸 ，晶體之尺 晶體之尺寸 ^11至mm尺寸級（例如長度）。在一些實施例 為至少約10 μιη且裸眼可見。對於治療性投 寸將視投藥途徑而不同，例如對於皮下投藥 可大於用於靜脈内投藥之晶體尺寸。 如先前關於蛋白質晶體及低分子量有機及無機分子之晶 -所描述’可藉由向結晶混合物中添加特定其他添加劑來 改變晶體之形狀。 125704.doc -29- 200835699 若必要，則可驗證晶體實際上為該抗體之晶體。可以顯 被鏡分析抗體之晶體之雙折射。一般而言，除非為立方體 内部對稱晶體，否則晶體將使偏振光之偏振平面旋轉。在 另一方法中，可分離、洗滌、再溶解且藉由sds、page分 析晶體且視情況以抗Fc受體抗體將晶體染色。視情況，亦 可使用標準檢定測試再溶解抗體與其hTNFa之結合。 如根據本發明獲得之晶體亦可彼此交聯。該交聯可增強 _ 晶體之穩定性。交聯晶體之方法描述於（例如）美國專利第 M49,296號中。可使用諸如戊二醛之雙官能試劑交聯晶 體。父聯後，可將晶體冷凍乾燥且儲存以用於（例如）診斷 或治療性應用中。 在些^况下，可需要乾燥晶體。可藉助於如氮氣之惰 性乳體、真空爐乾燥、冷凍乾燥、蒸發、盤式乾燥、流化 床乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥或滾筒乾燥來乾燥晶體。適 當方法為熟知的。 • 可將根據本發明形成之晶體維持於原始結晶溶液中，或 其可經洗滌且與如惰性載劑或成份之其他物質組合，以形 成匕έ本發明晶體之組合物或調配物。該等組合物或調配 物可用於（例如）治療性及診斷應用中。 杈佳實施例為以使得調配物之晶體經賦形劑包埋或囊 封之方式組合適當載劑或成份與本發明之晶體。適當載劑 Υ取自以下非限制性群··聚（丙烯酸）、聚（氰基丙烯酸 ㈤、聚（胺基酸）、聚（酐）、聚（縮肽）、聚（自旨）、聚（乳酸）、 聚（礼1_共_乙醇酸）或plGA、聚（β·羥基丁酸酯）、聚（己内 125704.doc -30- 200835699 醋）、聚（二°惡_)、聚（乙二醇）、聚（羥丙基）甲基丙烯醯 胺、聚（有機）磷氮烯、聚（原酸酯）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯 吼洛咬s同）、順丁烯二酸酐烷基乙烯基醚共聚物、複合多 元醇、白蛋白、海藻酸酯、纖維素及纖維素衍生物、膠原 蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻糖醛酸、寡醣、甘胺基聚 糖、硫酸化多醣、其掺合物及共聚物、SAIB、脂肪酸及脂 肪酸鹽、脂肪醇、脂肪胺、脂肪酸之單甘油酯、甘油二酯 • 及甘油二自曰、磷脂、醣脂、留醇及蠟及相關類似物質。蠟 進步刀類為天然及合成產品。天然物質包括獲自植物、 動t或礦物來源之蠟，諸如蜂蠟、巴西蠟棕或褐煤蠟。氣 化奈及烯系聚合物為合成蠟產品之實例。 C.組合物 本發明之另一態樣係關於包含抗-hTNFa抗體晶體與至少 一種載劑/賦形劑組合之組合物/調配物。 《等調配物可為固體、半固體或液體。 • 藉由以懸浮液形式混合具有必要純度之抗體與生理上可 …λ!、、力W 如載劑、賦形劑及/或穩定劑（參看例如

Remmgt〇nls Pharmaceutical sciences，第 16版，〇s〇1，Α•編 (198〇、)）’1^4於儲存及/或使用<形式製備本發明之調配 、、另方式凍乾或乾燥。亦可視情況併入其他活性成 份’例如不同抗辦、&私ι人7 ^ U机體生物分子、化學合成或酶促合成之低 分子量分子。 可接又之添加劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒 性。其非限制性實例包括： 125704.doc • 31 - 200835699 -酸化劑，如乙酸、擰檬酸、反丁烯二酸、鹽酸、蘋果 酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸、酒石酸。 -氣溶膠推進劑，如丁烷、二氯二氟甲烷、二氣四氟乙 烷、異丁烷、丙烷、三氣單氟甲烷。 -空氣置換劑，如二氧化碳、氮； -醇變性劑，如甲基異丁基酮、蔗糖八乙酸酯；

•驗化劑，如氨溶液、碳酸銨、二乙醇胺、二異丙醇 胺、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、删酸納、碳酸納、氫氧化鈉、 三乙醇胺； -消泡劑，如二甲聚矽氧烷、聚二甲矽氧烷。 -抗菌防腐劑，如氯苄烧銨、氯苄烧銨溶液、氣苄硫 銨、苯甲酸、苄醇、對羥基苯甲酸丁酯、氣化十六烷基吡 錠、氯丁醇、氯甲酚、曱酚、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸乙 酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸甲酯鈉、苯酚、苯 乙醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸鉀、山梨酸鉀、對羥 基苯甲酸丙酯、對羥基苯曱酸丙酯鈉、苯甲酸鈉、脫氫乙 酸鈉、丙酸鈉、山梨酸、硫柳汞、瑞香草酚。 -抗氧化劑，如抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酯、丁基化羥 基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、次填酸、單硫代甘油、沒 食子酸丙醋、甲酸合次硫酸氫納、偏亞硫酸氫鈉、硫代硫 酸鈉、二氧化硫、生育酚、生育酚賦形劑； -緩衝劑，如乙酸、碳酸銨、鱗酸銨、侧酸、檸檬酸、 乳酸、磷酸、檸檬酸鉀、偏填酸鉀、礙酸二氫鉀、乙酸 鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉溶液、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、 125704.doc -32- 200835699 組胺酸。 -螯合劑，如依地酸二鈉、乙二胺四乙酸及鹽、依地

-塗佈劑，如魏甲基纖維素納、乙酸纖維素、鄰笨二甲 酸乙酸纖維素、乙基纖維素、明膠、醫藥包糖衣、羥丙基 纖維素、羥丙基曱基纖維素、鄰苯二甲酸經丙基甲基纖維 素、甲基丙烯酸共聚物、甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙酸 乙烯酯鄰苯二甲酸酯、蟲膠、蔗糖、二氧化鈦、巴西棕櫚 蠟、微晶蠟、玉米蛋白、聚胺基酸、如PLGA等之其他聚 合物及SAIB。 -著色劑，如氧化鐵。 -錯合劑，如乙二胺四乙酸及鹽（EDTA)、依地酸、龍膽 酸乙醇醯胺、硫酸經基喧淋。 -乾燥劑，如氯化鈣、硫酸鈣、二氧化矽。 -乳化及/或增溶劑，如阿拉伯膠、膽固醇、二乙醇胺（助 劑）、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、單甘油酯及 甘油二酯、單乙醇胺（助劑）、油酸（助劑）、油醇（穩定劑）、 泊洛沙姆（pol〇xamer)、聚氧化乙烯5〇硬脂酸酯、聚烴氧35 蓖麻油、聚烴氧40氫化蓖麻油、聚烴氧1〇油基醚、聚烴氧 20十六基十八基醚、聚烴氧4〇硬脂酸酯、聚山梨醇酯2〇、 聚山梨醇自旨40、聚山梨醇醋6G、聚山梨醇㈣、丙二醇二 乙酸醋、單硬脂酸丙二醇醋、月桂基硫酸納、硬脂酸納、 脫水山梨糖醇單月桂酸醋、脫水山梨糖醇單油酸輯、脫水 山梨糖醇單棕櫚酸酯、脫皮 曰脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、硬脂 酸、三乙醇胺、乳化蠟。 125704.doc -33- 200835699 -助濾劑’如粉末狀纖維素、純化之矽藻土。 _香料及芳香劑，如大茴香 、本甲醛、美番_ 薄荷腦、水揚酸甲酯、麩胺 土杳蘭素、 薄荷油、薄荷精'玫瑰油 胡椒“、 /辰玫瑰水、瑞香草酚、吐，备 脂町、香草、香草蘭酉丁、香蘭素。 ㈣土，、香 -助流劑及/或防結塊劑， 化石夕、滑石。 如石夕酸約、石夕酸鎂、膠狀二氧 -保濕劑，如甘油、己二醇、 丙一知、山梨糖醇； 幸“基貝如平毛脂、無水羊毛脂、親水性軟膏、白 色軟膏、黃色軟膏、聚乙二 、 ^幸人用白 白色石电、玫瑰水軟膏、角装烧。 嘴 -增塑劑，如蓖麻油、羊 基节輯、氣丁醇、鄰苯二ψ 油、石墩、甲酸节 —乙酯、山梨糖醇、二乙醯 化早甘油酯、鄰苯 ,,,„ 甲酉欠一乙酯、甘油（glycerin、 ^ ^化早甘油酯及二_乙醯化單甘油酯、聚 夕醇丙一醇、二乙酸甘油酯、檸檬酸三乙酯、乙醇。 夕狀’如低分子量多肽（少於約10個殘基）； 蛋白貝，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白· -聚合物臈，如乙酸纖維素膜。 ’ 吞J如丙酉同、醇、稀醇、水合戍稀、苯甲酸节酿、 丁知、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉軒油、乙酸乙酿、甘 Ϊ二—％、異丙醇、甲醇、二氣甲烧、甲基異丁基酮、 礦物油、花生、、击、取 油、注射用水、二’醇、碳酸丙二醋、丙二醇、芝麻 …、囷注射用水、無菌沖洗水、純水、液體 125704.doc -34- 200835699 甘油三酯、液體壤、高級醇。 -吸附劑，如粉末狀纖維夸 二氧 十六 八烷 * I、厌、純化之矽藻土 化碳吸附劑、氫氧化鋇、石灰、鹼石灰 、 -硬化劑’如氫化繁麻油、十六醇二八醇混合物 烷醇、十六基酯蠟、硬脂、石蠟、聚乙烯賦形劑' 醇、乳化堪、白壤、黃纖。 -栓劑基質，如可可脂、硬脂、聚乙二醇； 單硬

-懸洋及/或增黏劑，如阿拉伯膠、瓊脂、褐藻酸 脂酸鋁、膨潤土、純化膨潤土、岩漿膨 上干更 / 、卡波姆 (Carb〇mer)934P、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、 曱基纖維素鈉12、角又菜膠 '微晶及羧曱基纖維素鈉纖維 素、糊精、明膠、瓜爾膠、羥乙基纖維素、 ^ 尹二内基纖維 素、羥丙基甲基纖維素、矽酸鎂鋁、甲基纖維素、果膠'、 聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、_ 一 U 海藻酸 酯、二氧化矽、膠狀二氧化矽、海藻酸鈉、黃蓍膠、一 膠； 、 >、二仙 右旋糖、職 、糖精納、 、糖果店之 -甜味劑，如阿斯巴甜糠、葡萄糠結合劑、 形劑右旋糖、果糖、甘露糖醇、糖精、糖精舞 山梨糖醇、溶液山梨糖醇、蔗糖、可壓縮糖 糖、糖漿； -錠劑黏合劑，如阿拉伯膠、褐藻酸、羧 心T暴纖維素 鈉、微晶纖維素、糊精、乙基纖維素、明膠、液體葡+ 糖、瓜爾膠、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚氧化 烯、聚乙烯吡咯8同、預膠凝化澱粉、糖漿。 125704.doc -35- 200835699 -錠:劑及/或膠囊稀釋劑，如碳酸妈、碟酸氫二約、構酸 三鈣、硫酸鈣、微晶纖維素、粉末狀纖維素、葡萄糖結合 劑、糊精、右旋糖賦形劑、果糖、高嶺土、乳糖、甘露糖 醇、山梨糖醇、澱粉、預膠凝化澱粉、蔗糖、可壓縮糖、 糖果店之糖； -錠劑崩解劑，如褐藻酸、微晶纖維素、交聯羧甲基纖 維素鈉、交聯聚乙烯吡咯酮、陽離子交換樹脂、羥乙酸殿 粉鈉、澱粉、預膠凝化澱粉。

-紅劑及/或膠囊潤滑劑，如硬脂酸妈、蘿酸甘油醋、硬 脂酸鎂、輕質礦物油、聚乙二醇、硬脂醯反丁烯二酸鈉、 硬脂酸、純化硬脂酸、滑石、氫化植物油、硬脂酸辞； _張力劑，如右旋糖、甘油、甘露糖醇、氯化鉀、氯化 鈉-媒劑：調味及/或增甜芳香酏劑、混合苯甲醛酏劑、異 酒精性酏劑、薄荷水、山梨糖醇溶液、糖漿、冑魯香脂糖 漿。 -媒劑，如油性杏仁油、玉米油、棉軒油、油酸乙醋、 十四院酸異丙s旨、椋櫚酸異丙_、礦物油、輕質礦物油、 十四院醇、辛基月桂醇、撖欖油、花生油、杏仁油、芝麻 油、大豆油、角董烷；固體載劑糖球體；㈣抑菌注射用 水、抑菌氣化鈉注射液、液體甘油三醋、液體蠟、高級 醇。 -防水劑’如環甲聚石夕氧燒、二甲聚石夕氧烧、聚 氧烷； -濕潤及/或增溶劑，如氯节烧銨、f索氯銨、氯化十六 125704.doc -36 - 200835699 ，基比錠、多庫Sl納、壬苯醇_、壬苯醇®UG、辛苯昔 :7姆、聚烴氧35蓖麻油、聚烴氧40、氫化蓖麻 L、聚烴氧50硬脂酸_、聚烴氧1()油基_、聚烴氧2〇、十 2基鱗、聚經氧40硬脂酸酉旨、聚山梨醇酉旨20、聚山 ^醇、曰0聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、月桂基硫酸 脫欠山4糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖 ^山㈣料棕_旨、脫水山梨_單硬脂酸醋、泰 /口 泊（tyl〇Xap〇1); 體jr ’、聚合型載劑組合以提供穩定性及/或持續釋 二該等聚合物包括生物相容性及可生物降解之聚合物。 人 、 頡生或其可由聚合物類型之混 '組成。上文已描述聚合型载劑之非限制性實例。 較佳成份或賦形劑之實例包括： -诸如甘胺酸、精胺酿、々 ;&L、麩胺酸、離胺酸、天 冬酿胺酸、麩醯胺酸、 „ 妝夂料酉夂、組胺酸之胺基酸的鹽； 播早聽’諸如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯 糖、木糖、核糖； -二酶，諸如乳糖、海藻糖、麥芽糖、薦糖； -多醣’諸如麥芽糖糊精、葡聚糖、澱粉、糖原. -輯1如甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇； -葡糖醛酸、半乳糖醛酸； 環糊精，諸如甲基環糊精、經丙基-(3-環糊精)； •無機鹽，諸如氣化納、氯化鉀、氯化鎮、鈉及鉀之磷酸 鹽、蝴酸破酸錢及碟酸銨； I25704.doc • 37 - 200835699 -有機鹽，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、乳酸 鹽； -乳化或增溶劑，如阿拉伯膠、二乙醇胺、單硬脂酸甘油 酉曰、印麟脂、單乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨 醇酯、月桂基硫酸鈉、硬脂酸、脫水山梨糖醇單月桂酸 酉曰、脫水山詩醇單硬脂酸_ &其他脫水山梨糖醇衍生 物、聚烴氧衍生物、蠟、聚氧化乙烯衍生物、脫水山梨糖 醇衍生物；及 -增黏試劑，如4脂、褐藻酸及其鹽、瓜爾膠、果膠、聚 乙稀醇、聚氧化乙稀、纖維素及其衍生物、碳酸丙二醋、 聚乙二醇、己二醇及泰洛沙泊。 本文中所描述之調配物亦包含有效量之結晶抗體。尤 其，本發明之調配物可包括”治療有效量，，或，，預防有效量，， 之本發明之抗體晶體。，，治療有效量，，係指在必要劑量下及 歷時必要時間實現所需治療結果有效的量。抗體晶體之 療有效里可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及 體重之因素及抗體在個體中引發所需反應之能力而不同。 /口療有效里亦為治療有利效應優於抗體之任何毒性或不利 效應的量。"預防有效量”係指在必要劑量下及歷時必要時 間只現所而預防結果有效的量。通常，因為預防劑量在疾 病之則或疾病早期用於個體，因此預防有效量將低於治療 有效量。 使用標準方法可易於確定適當劑量。抗體可一次或經一 系歹】/σ療適虽地投予患者。視上述因素而定，約1 至 125704.doc -38- 200835699 約5Wkg，例如(U_20mg/kg之抗體為用 初始備選劑量，盔铪an、％^ ^ 』心有之 例如）猎由一或多次獨立投藥或 連續輸液。視病狀而定，典 9 /、主㈡d里或週劑量可在 ㈣kg至約20 ,心或更多之範圍内，重複治療直至出現疾 病病症之所需抑制。然而，其他給藥方案可為適用的 一些情況下，當再溶解時調配物包含至少約1 g/L或更大之 抗體濃度。在其他實施例中合 一 1 J甲田再/合解時，抗體濃度為至 少約1 g/L至約1〇〇 g/L。 抗體之晶體或包含該等晶體之調配物可單獨投予 醫藥製劑之一部分投予。其可藉由非經腸、經口或局部途 徑投予。例如其可藉由經口、肺部、經鼻、經耳、肛門、 皮膚、眼部、靜脈内、肌肉内、動脈内、腹膜内、黏臈、 舌下、皮下、經皮、局部或顱内途徑投予或投予至頰腔 中。投藥技術之特定實例包含肺部吸人、病灶内應用、= 注射、乾粉劑吸人、皮膚電穿孔、氣溶膠傳遞及無針注射 技術，包括無針皮下投藥。 現將藉助於以下非限制性、說明性實例更詳述地說明本 發明。熟習之閱讀者在說明書之概括部分指導下且基於其 苇識將此夠提供本發明之其他實施例而無需不當實驗。 實驗部分 A·材料 a)蛋白質 冷柬單株抗體（mAb)D2E7係獲自Abbott實驗室。自原始 mAb農度為5〇 mg/mL之藥品批量執行所有實驗。 125704.doc -39· 200835699 b)精製化學品 乙酸納係獲自Grossing GmbH，Filsum。不同聚合度之聚 乙二醇係獲自Clariant GmbH，Sulzbach。此外，商業結晶 篩及試劑（Hampton Research，Nextal Biotechnologies)係用 於某些微量實驗。所有其他化學品係來自Sigma-Aldrich， Steinheim或 Merck，Darmstadt 〇 B.通用方法 a) 將D2E7藥物解凍 在25°C下於攪動水浴中將D2E7解凍。

b) 緩衝液交換-方法A 將D2E7溶液之等分試樣吸入30 KDa MWCO Vivaspin 20 濃縮器（Vivascience)中。以新緩衝液以1 ·· 10之比率稀釋蛋 白質樣品且藉由在5,000xg在4°C下離心（Sigma 4 K 15實驗 室離心機），使樣品體積返回至原始樣品體積。重複稀釋/ 離心步驟一次，使得原始樣品緩衝液之稀釋度為1:100。 調節蛋白質濃度後，將溶液經〇·2 μπι注射器驅動之過濾單 元無菌過濾。 b) 缓衝液交換-方法Β 將D2E7溶液之等分試樣置於SLIDE-A-LYZER透析卡匣 (Pierce Biotechnology Inc.)中。將透析卡匣置於含有所選 緩衝液之燒杯中，且在4°C在攪拌下隔夜進行緩衝液交 換。調節蛋白質濃度後，經0.2 μπι注射器驅動之過濾單元 將該溶液無菌過濾。 c) OD280-蛋白質濃度量測 125704.doc -40- 200835699 使用ThermoSpectronics UV1裝置，在280 nm之波長下， 應用1.39 cm2 mg·1之消光係數評估蛋白質濃度。出於此目 的，在14,000 rpm下離心結晶漿料之等分試樣且測定上清 液中之殘餘蛋白質濃度。 d)pH值量測 藉由使用Mettler Toledo MP220 pH計進行pH值量測。使 用Iniab 4 13電極及Inlab 423微電極。 結晶方法 el)微量結晶-使用Hydra II結晶機器人及Greiner 96孔板 (三個滴孔，Hampton Research)進行沉滴汽相擴散Hydra II 初始結晶篩選。設置板後，以Clearseal薄膜（Hampton Research)密封各孔。 e2)微量結晶-懸滴汽相擴散 分別使用VDX板（具有密封劑，Hampton Research)及 OptiClear塑料蓋玻片（方形，Hampton Research)或石夕化玻 璃蓋玻片（圓形，Hampton Research)進行懸滴汽相擴散實 驗。製備儲液器溶液後，在蓋玻片上將一滴儲液器溶液與 一滴蛋白質溶液混合，且以翻轉蓋玻片以使得液滴懸在儲 液器上之方式將孔密封。 e3)批次結晶-方法A(24孔板） 藉由於孔中混合蛋白質溶液與等量之結晶緩衝液（500 μΐ)進行批次結晶。隨後以膠帶密封孔以防止水蒸發。 e4)批次結晶-方法B(Eppendorff反應管） 藉由於1.5 mL或2 mL Eppendorff反應管中混合蛋白質溶 125704.doc 41 · 200835699 液與等量之結晶緩衝液進行批次結晶。 e5)批次結晶-方法C(Falcon管，授動） 藉由於50 mL Falcon管中混合蛋白質溶液與等量之結晶 緩衝液進行批次結晶。恰在封閉後，將管置於實驗室震盈 器（GFL 3013或GFL 3015)上或者藉由翻轉攪動。藉由應用 該等方法，避免將攪拌器引入樣品中。 e6)批次結晶-方法D(1公升聚丙烯容器） 藉由於殺菌之1公升聚丙烯瓶中混合蛋白質溶液與等量 之結晶緩衝液進行批次結晶。恰在封閉後，在無攪動情況 下，將容器儲存在環境溫度下。藉由應用該等方法，避免 將攪拌器引入樣品中。

f) SDS-PAGE 藉由將蛋白質濃度調節至8 pg/20 pL製備樣品。以含有 溴酚藍之SDS/Tris/甘油緩衝液稀釋樣品。 使用 Invitrogen NuPage 10% Bis-Tris凝膠、NuPage MES SDS電泳缓衝液及Mark 12寬範圍蛋白質標準進行定性SDS PAGE分析。將20 pL樣品吸入凝膠凹槽中。使凝膠電泳且 以乙酸/曱醇試劑固定後，使用Novex膠狀藍染色套組進行 染色。使用Invitogen凝膠-乾燥乾燥溶液乾燥凝膠。 g) 光學顯微術 使用 Zeiss Axiovert 25 或 Nikon Labophot顯微鏡觀測晶 體。後者裝備有偏振光濾器組及JVC TK C 1380彩色攝像 機。

h) SE-HPLC 125704.doc -42- 200835699 藉由SE-HPLC評估D2E7樣品之聚集程度。使用Dionex P680泵、ASI-100自動進樣器及UVD170U偵測器裝置。藉 由 Amersham Bioscience Superose 6 10/300 GL凝膠過滤管 柱，應用生效之Abbott標準方案（CL16-PS-02，阿達木單抗 純度）將聚集之物質與單體分離。 C.汽相擴散結晶實驗 以下實例中所給出之濃度值為關於抗體溶液及儲液器溶 液之兩種溶液混合前的初始值。 若未另外描述，則所有pH值係指乙酸鹽緩衝儲備液在其 與如結晶劑之其他物質組合前之pH值。 若未另外描述，則所有緩衝液莫耳濃度係指在通常使用 冰乙酸進行之pH值調節前的儲備溶液中之乙酸納濃度。 實例1-以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 4,000/乙酸鈉柵格 篩選 將D2E7緩衝入含有約0·1 Μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及 Milli Q水（充分脫鹽且視情況預先蒸餾）製備500 特定儲 液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保 持於約0·1 Μ，且PEG 4,000以2%梯級自約6% w/v變化至約 28% w/v。pH值始終為約5,2。以雙重複評估各條件。將約 1 pL蛋白質溶液與約1 pL特定儲液器溶液在方形OptiClear 塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸 125704.doc -43 - 200835699 滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之三十天内多 次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無 規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之 混合物之液滴。 結果··自所評估之24個孔未觀測到晶體。 實例2-以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之Peg 4,000/乙酸鈉柵格篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·ι M乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處 理條件與實例1相同。 結果：自所評估之24個孔未觀測到晶體。 實例3·以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 400/乙酸鈉柵格 篩選 將D2E7緩衝入含有約ο.〗μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 / 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 400溶液及 Milli Q水製備500 特定儲液器溶液。在該實例中，將乙 酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約（Μ Μ，且PEG 4〇〇以 2%梯級自約3〇% w/v變化至約40% w/v。pH值始終為約 5.2。以雙重複評估各條件。將約1 ^^蛋白質溶液與約1 _ 特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以 翻轉之盘玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境 溫度下。在接下來之三十天内多次進行液滴之顯微鏡觀 125704.doc -44- 200835699 察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶 體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 、结果：自所評估之12個孔未觀測到晶體。 實例以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之PEG 400/乙酸鈉栅格篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·ι μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處 理條件與實例3相同。 結果：自所評估之12個孔未觀測到晶體。 實例5_以懸滴汽相擴散模式進行之Peg 1 〇,〇〇〇/乙酸鈉栅格 篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·；[ μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽缓衝液、50% w/v PEG 400溶液及 Milli Q水製備500叫特定儲液器溶液。在該實例中，將乙 酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約〇·1 M，且PEG ΐο^οο 以2%梯級自約4% w/v變化至約14% w/v。pH值始終為約 5.2。以雙重複評估各條件。將約1 蛋白質溶液與約丨此 特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以 翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境 溫度下。在接下來之三十天内多次進行液滴之顯微鏡觀 察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉殿之液滴、含有曰 體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 125704.doc -45- 200835699 結果：自所評估之12個孔未觀測到晶體。 實例6-以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之Peg 10,000/乙酸鈉柵格篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·ι μ乙酸鈉pH值為約5·2之缓衝液 中。將蛋白質濃度調節至45至55 mg/mL，較佳為50 mg/mL。除蛋白質濃度外，處理條件與實例5相同。 結果：自所評估之12個孔未觀測到晶體。 實例7-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之peg 400/乙 酸鈉柵格篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·；[ μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗月曰之VDX板及方形OptiC lear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、5〇% w/v PEG 1 0,〇〇〇溶液及 Milli Q水製備500叫特定儲液器溶液。在該實例中，將乙 酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約〇1 Μ，且peg 400為約 32% w/v及約 34% w/v。pH值為約 4·2、4.7、5.2、5.7、6.2 或6.7。以雙重複評估各條件。將約1叫蛋白質溶液與約1 μΕ特疋儲液器溶液在方形〇ptiCiear塑料蓋玻片上混合，且 以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環 境温度下。在接下來之三十天内多次進行液滴之顯微鏡觀 察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶 體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果··自所評估之24個孔未觀測到晶體。 實例8-以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度及設置進行 125704.doc -46- 200835699 之PEG 4〇0/乙酸鈉柵格筛選 將D2E7緩衝入含有約0·1 Μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至5〇 mg/mL。除蛋白質濃度外，處 理條件與實例7相同。 結果：自所評估之24個孔未觀測到晶體。 實例以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 400/乙 酸鈉柵格篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·1 Μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質農度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形〇ptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、5〇% w/v PEG 400溶液及 Milli Q水製備500 _特定儲液器溶液。在該實例中，所用 乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為約〇 〇25 μ、0.05 Μ、0.075 Μ、 〇·15 Μ、0·2 Μ或 0.25 Μ。PEG 400 自約 32% w/v變化至約 34% w/v。pH值為約5·7或4.2。以雙重複評估各條件。將 約1 KL蛋白質溶液與約！卟特定儲液器溶液在方形 OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密 封’產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之 二十天内多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液 滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物 質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之48個孔未觀測到晶體。 實例10-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之pEG 4〇0/ 乙酸鈉柵格篩選 125704.doc -47- 200835699 將D2E7緩衝入含有約〇·1 Μ乙酸鈉pH值為約5_2之缓衝液 中。將安白質濃度調節至10 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 400溶液及 Milli Q水製備500叫特定儲液器溶液。在該實例中，所用 乙酸鹽缓衝液莫耳濃度為約0·025 Μ、〇·〇5 Μ或0·1 Μ。 PEG 40〇為約 w/v或約 30°/() w/v。ΡΗ值為約 5·2、5·7、 6.2或6·7。以雙重複評估各條件。將約1 pL蛋白質溶液與 約1 pL特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混 合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板儲 存在環境溫度下。在接下來之三十天内多次進行液滴之顯 微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、 含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之48個孔未觀測到晶體。 實例11-以懸滴汽相擴散模式進行之PEG 400組合PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選 將D2E7緩衝入含有約〇·1 Μ乙酸鈉pH值為約5.2之缓衝液 中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及 Milli Q水製備500 kL特定儲液器溶液。在該實例中’將匕 酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約Ο·1 M，且PEG 4,000以 2%梯級自約4% w/v變化至約8% w/v。同時’將濃度為約 24% w/v、26% w/v、28% w/v或 3 0% w/v之 PEG 4〇〇添加至 125704.doc •48- 200835699 PEG 4,000/乙酸鹽溶液中。pH值始終為約5·2。以雙重複評 估各條件。將約1 μί蛋白質溶液與約1 μί特定儲液器溶液 在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將 孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下 來之三十天内多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄 清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉 澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之24個孔未觀測到晶體。 實例12-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 400組 合PEG 4,000/乙酸鈉柵格篩選 將D2E7緩衝入含有約0.1 Μ乙酸鈉pH值為約5.2之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽缓衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及 Milli Q水製備500 pL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙 酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約〇_1 M，且PEG 4,0〇〇以 2%梯級自約4% w/v變化至約8% w/v。同時，將濃度為約 3 0% w/v、32% w/v、34% w/v或 36% w/v之 PEG 4〇〇添加至 PEG 4,000/乙酸鹽溶液中。PH值始終為約4·2。以雙重複評 估各條件。將約1叫蛋白質溶液與約1叫特定儲液器溶液 在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將 孔密封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接^ 來之三十天内多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄 清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有》冗 125704.doc •49· 200835699 澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之24個孔未觀測到晶體。 實例13-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之Peg 4,000/ 乙酸鈉柵格筛選 將D2E7緩衝入含有約〇1 μ乙酸鈉pH值為約6.5、6.0、 5·5、5.0、4.5或4·0之緩衝液中。將蛋白質濃度調節至1〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形〇pticlear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、5〇0/〇 w/v PEG 4,000溶液及 Milli Q水製備5〇〇叫特定儲液器溶液。在該實例中，將乙 酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約〇·1 M，且pEG 4,〇〇〇以 2/〇梯級自約4〇/〇 w/v變化至約26% w/v。所用乙酸鹽緩衝液 之pH值與相應蛋白質緩衝液相同。以雙重複評估各條件。 將約1 μ!^蛋白質溶液與約1叫特定儲液器溶液在方形 OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密 封，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之 二十天内多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液 滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物 質與晶體之混合物之液滴。 、、’。果·自所評估之144個孔未觀測到晶體。 實例14_以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG4,000/ 乙酸鈉柵格篩選 ☆除匣疋保持於約〇·2 M(沉澱緩衝液之莫耳濃度）之乙酸鹽 緩衝液莫耳濃度外，實驗條件與實例13相同。 125704.doc -50- 200835699 結果：自所評估之14 4個孔未觀測到晶體。 實例15-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之pEG 4,000/ 乙酸鈉柵格篩選 除恆定保持於0·1 Μ(沉澱緩衝液之莫耳濃度）之乙酸鹽緩 衝液莫耳濃度外，實驗條件與實例13相同。 結果：自所評估之144個孔未觀測到晶體。 實例16-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之j>eg 4,000/ 乙酸鈉柵格篩選 除恆定保持於約0 · 4 Μ(沉殿缓衝液之莫耳濃度）之乙酸鹽 緩衝液莫耳濃度外，實驗條件與實例13相同。 結果：自所評估之144個孔未觀測到晶體。 實例17-PEG 4,000/乙酸鈉大量實驗 將D2E7緩衝入含有約ο! M乙酸.pH值為約55之缓衝液 中。將蛋白質濃度調節至i 〇 mg/mL。 將各500 μ[之4份等分試樣吸入斗個邱口⑶如咐反應管 中將於Ο·1 Μ乙酸鈉緩衝液（pH 5.5)中之24% PEG 4,000 /合液滴疋至蛋白質溶液中直至溶液變得稍微不透明。隨 後將水吸至溶液巾，直至溶液恰好再次變得澄清。該方 法稱為大4結晶。在環境溫度下對兩個樣品進行滴定且在 4 C下對兩個其他樣品進行滴定。隨後，將各對樣品中之 a者刀別儲存在裱境溫度或4。。下。在接下來之一週内多 次進行樣品之1叫等分試樣之顯微鏡觀察。 結果·该4個樣品未出現晶體。 以懸滴八相擴散模式、不同溫度進行之ρΕβ 4,〇❹❹/ 125704.doc -51- 200835699 乙酸鈉柵格篩選 實驗條件與實例13相同。然而，管設置且儲存在4亡 下。 結果··自所評估之144個孔未觀測到晶體。 實例19-以懸滴汽相擴散模式、不同蛋白質濃度進行之 PEG 4,〇〇〇/乙酸納柵格篩選 除蛋白質濃度經調節至5 mg/mL外，實驗條件與實例i 3 相同。 結果：自所評估之144個孔未觀測到晶體。 實例20·以懸滴汽相擴散模式進行之硫酸銨/乙酸鈉柵格 篩選 將D2E7緩衝入含有約〇1 M乙酸鈉pH值為約55之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形Opticlear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、硫酸銨貯備液及MilH Q水製 備500 pL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液 莫耳》辰度怪定保持於約〇·1 Μ，且硫酸銨濃度以0.25 μ為 梯級自0.5 Μ變化至2.5 Μ。乙酸鹽緩衝液之？11值始終為約 5.5。以雙重複評估各條件。將約j吣蛋白質溶液與約夏吣 特疋错液器溶液在方形OptiClear塑料蓋玻片上混合，且以 翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且健存 在環境溫度下。在接下來之兩週内多次進行液滴之顯微鏡 觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有 晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 125704.doc -52- 200835699 結果：自所評估之18個孔未觀測到晶體。 實例21-以懸滴汽相擴散模式進行之氣化鈉/乙酸鈉柵格 篩選 將D2E7緩衝入含有約^ M乙酸鈉pH值為約5 5之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形〇ptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、氯化鈉貯備液及MilH q水製 備500 pL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液 莫耳濃度恒定保持於約〇 · 1 Μ，且氣化鈉濃度以〇 · 5 μ為梯 級變化，自1.5 Μ變化至2.5 Μ。乙酸鹽緩衝液之ρΗ值始終 為約5.5。以雙重複評估各條件。將約1 |^]^蛋白質溶液與約 1 μί特定儲液器溶液在方形〇pticiear塑料蓋玻片上混合， 且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且 儲存在環境溫度下。在接下來之兩週内多次進行液滴之顯 微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、 含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之6個孔未觀測到晶體。 實例22-以懸滴汽相擴散模式進行之pEG 4,000/乙酸鈉柵格 篩選，清潔劑之影蜜 將D2E7緩衝入含有約〇·ι μ乙酸鈉pH值為約5·5之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。藉由 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及 Milli Q水製備500 pL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙 125704.doc -53- 200835699 酉文鹽緩衝液莫耳派度恆定保持於約〇1 Μ，且pEG 以 2%為梯級自約1G% w/v變化至約謂。w/v。乙酸鹽缓衝液 之PH值始終為約5·5。此外，將聚山梨醇醋2〇、聚山梨醇 酉曰80及泊洛尼克（piuronic)F 68分別以濃度〇 及 ‘ 〇·1〇/〇添加至如上所述之任何所得緩衝液中。將約1 pL蛋白 貝/谷液與約1 pL特定儲液器溶液在方形◦"⑴卜犯塑料蓋玻 片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。 • 將板設置且儲存在環境溫度下。在接下來之兩週内多次進 灯液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉 澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱㈣與晶體混合物 之液滴。 結果：自所評估之84個孔未觀測到晶體。可觀測到所評 估之清潔劑對結晶系統之行為無影響。 實例23-以懸滴汽相擴散模式進行之乙酸辞/乙酸鈉柵格 篩選 Φ 將D2E7緩衝入含有約〇·1 Μ乙酸鈉pH值為約5.5之緩衝液 中。將蛋白質濃度調節至1 〇 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形OptiClear塑料蓋玻片。夢由 - 於各孔中混合乙酸鹽緩衝液、乙酸鋅儲備液及Milli Q水製 -備500 μί特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝液 莫耳濃度恆定保持於約〇·1 Μ，且乙酸鋅濃度以約〇 2馗為 梯級自0·1 Μ變化至〇·9 Μ。乙酸鹽緩衝液之ρΗ值始終為約 5 · 5。以雙重複砰估各條件。將約丄叫蛋白質溶液與約1队 特定儲液器溶液在方形0ptiClear塑料蓋玻片上混合， 125704.doc • 54· 200835699 翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實驗。將板設置且儲存 在環境溫度下。在接下來之兩週内多次進行液滴之顯微鏡 觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有 晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之12個孔未觀測到晶體。 實例2 4 -以汽相擴散模式廣泛篩選條件 將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL、10 mg/mL或20 mg/mL ° 使用Hydra II結晶機器人，使用數種市售結晶篩，將96 孔Greiner板設置在環境溫度下。以約1:1、較佳1:1之比率 混合蛋白質溶液與結晶劑。 使用以下篩：

Hampton 晶體篩 1及 2(Hampton Research);

Hampton Index篩（Hampton Research);

Hampton SaltRX篩（Hampton Research);

Nextal The Classics、The Classics Lite、The PEGs、The Anions、The pH clear 及 The Ammonium Sulfate(均來自 Nextal Biotechnologies) o 向結晶劑中添加蛋白質（每個條件三滴，含有如上所述 之三種不同蛋白質濃度）後，以Clearseal薄膜將板密封。以 四重複設置各板且隨後分別儲存在環境溫度、4°C、27°C 及37°C下。分別在5天及12天後進行液滴之顯微鏡觀察。 條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之 125704.doc -55- 200835699 液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果··自所評估之864個商業條件，在至少兩週後，2個 在如下所定義之蛋白質濃度及溫度下產生晶體。 -0·1 Μ無水乙酸鈉pH 4.6、0.9 Μ磷酸二氫鈉、0.9 Μ磷酸 二氫舒（=Nextal The Anions，E3)、10 或 20 mg/mL 及 27 °C，或 20 mg/mL及 37°C。 -0.1 M Bis-Tris 丙烧 pH 7.0、1.5 M 硫酸銨（=Hampton SaltRX，F2)、5、10或 20 mg/mL及 27〇C。

晶體展示針狀叢集狀形態學。 市售篩之以下條件並未產生晶體。對於詳細溶液組成請 參閱 www.hamptonresearch.com及 www.nextalbiotech.com : Hampton晶體篩1-所有條件（48)

Hampton晶體篩2-所有條件（48)

Hampton Index 篩所有條件（96)

Hampton SaltRX篩-除”F2n外之所有條件（95)

Nextal-The Classics-所有條件（96)

Nextal-The Classics Lite-所有條件（96)

Nextal-The PEGs-所有條件（96)

Nextal-The Anions-除 ΠΕ3Π 外之所有條件（95)

Nextal-The pH Clear·所有條件（96)

Nextal-The Ammonium Sulfate-所有條件（96) 實例25-以懸滴汽相擴散模式、不同設置進行之PEG 4,000/ 乙酸鈉栅格篩選

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氣化鈉缓衝液（pH 125704.doc -56- 200835699 7.4) 中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL、10 mg/mL或20 mg/mL 〇 使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。藉由於各孔中 混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水 製備500 gL特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝 液莫耳濃度恆定保持於約0.1 Μ，且PEG 4,000濃度以2%為 梯級自4%變化至26%。pH值始終為約5.5。以如上所述之 三種蛋白質濃度設置各條件。在圓形矽化蓋玻片上混合約 1 μί蛋白質溶液與約1 pL特定儲液器溶液，且以翻轉蓋玻 片密封孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。6天 後進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無 規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之 混合物之液滴。 結果：自所評估之72個孔未觀測到晶體。 實例26-應用Hampton清潔劑篩之懸滴汽相擴散實驗

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7.4) 中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。藉由於各孔中 混合乙酸鹽緩衝液、50% w/v PEG 4,000溶液及Milli Q水 製備500 μί特定儲液器溶液。在該實例中，將乙酸鹽緩衝 液莫耳濃度恆定保持於約0.1 Μ，且PEG 4,000濃度為約 12% w/v或14% w/v。pH值始終為約5.5。在圓形矽化蓋玻 片上混合約4 pL蛋白質溶液與Hampton篩之約1 pL特定清 潔劑溶液。隨後將液滴與5 pL特定儲液器溶液混合，且以 125704.doc -57- 200835699 翻轉蓋玻片密封孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度 下。6天後進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液 滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物 質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所評估之144個孔未觀測到晶體。 實例27-使用Hampton PEG/Ion篩之懸滴汽相擴散 將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7·4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL或10 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。將500 pL 48 種緩衝液調配物中之每一者吸入孔中且分別與250 pL Milli Q水混合。將約1 μΐ^蛋白質樣品吸於蓋玻片上且隨後 與約1 pL特定孔之儲液器溶液混合。以翻轉蓋玻片密封 孔，產生懸滴實驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之 7天内多次進行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液 滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物 質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所測試之96種條件未觀測到晶體。 實例28-使用Hampton PEG/Ion篩、不同設置之懸滴汽相 擴散 將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL。 實驗條件與實例27相同，其例外情況為將500 pL 48種緩 衝液調配物中之每一者吸入孔中且分別與500 pL Milli Q 水混合。 125704.doc -58 - 200835699 結果：自所測試之4 8種條件未觀測到晶體。 實例29-使用Hampton低離子強度篩之懸滴汽相擴散 將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7·4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。將1 mL 24%

w/v PEG 3,350脫水劑溶液分別吸入1〇8個孔中。將約2 pL 蛋白質樣品吸於蓋玻片上且隨後與約1 pL 1 8種特定緩衝試 片1J中之一者混合。此後’將約2 · 5 μΙ>六種不同濃度之一之 PEG 3，3 50沉殿劑添加至液滴中。以翻轉蓋玻片密封孔， 產生108種不同懸滴實驗。 將板儲存在環境溫度下。在接下來之7天内多次進行液 滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之 液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之 液滴。 結果：自所測試之108種條件未產生晶體。 實例30-以懸滴汽相擴散模式進行之硫酸銨/Bis-Tris丙烷柵 格篩選

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氣化鈉緩衝液（pH 7.4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL、1() mg/mL或2〇 mg/mL 〇 使用經塗脂之VDX板及圓形矽化蓋玻片。藉由在各孔中 混合硫酸銨儲備溶液、Bis-Tris丙烷儲備溶液及Milli Q水 製備500 pL特定餘液器溶液。在該實例中，硫酸銨莫耳濃 度為約0·5 Μ、1 Μ、1.5 Μ或2 Μ。Bis-Tris丙烷莫耳濃度 125704.doc -59- 200835699 、、s為0· 1 Nl且Bis-Tris丙燒緩衝液pH值為約5·5、6 〇、 7·0 7·5或8_〇。以如上所述之三種蛋白質濃度且分別 以在環境溫度下儲存或在約27ac下儲存評估所得Μ種條 件。在圓形矽化蓋玻片上將約i卟蛋白質溶液與約i ^特 疋儲液器溶液混合且以翻轉蓋玻片密封孔，產生懸滴實 驗。將板儲存在環境溫度下。三天後進行液滴之顯微鏡觀 察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉澱之液滴、含有晶 體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合物之液滴。 結果：自所測試之144種條件三天後未產生晶體。 實例31-以懸滴汽相擴散模式進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉 拇格筛選

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氣化鈉緩衝液（pH 7·4)中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL、10 mg/mL或20 mg/mL。 使用經塗脂之VDX板及方形〇pticiear塑料蓋玻片。藉由 在各孔中混合乙酸鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸 二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製備5〇〇叫特定儲液器溶液。 在該實例中，將乙酸鹽緩衝液莫耳濃度恆定保持於約〇. i Μ且乙酸鹽缓衝液pH值為約4.1、4.6、5.1或5.6。 應用磷酸二氫鈉與磷酸二氫釺之以下組合·· -約0·3 Μ填酸二氫鈉與約〇·3 Μ構酸二氫釺； -約0·6 Μ填酸二氫鈉與約〇·6 Μ填酸二氫斜； -約0.9 Μ填酸二氫鈉與約〇·9 Μ鱗酸二氫鉀； -約1·8 Μ鱗酸二氫鈉， 125704.doc -60- 200835699 -約2·1 Μ磷酸二氫鈉， -約2 · 4 Μ磷酸二氫納。 以如上所述之三種蛋白質濃度設置各條件。將約1 pL蛋 白質溶液與約1 μί特定儲液器溶液在方形OptiClear塑料蓋 玻片上混合，且以翻轉之蓋玻片將孔密封，產生懸滴實 驗。將板儲存在環境溫度下。在接下來之一個月内多次進 行液滴之顯微鏡觀察。條件歸類為澄清液滴、含有無規沉

沒又之液滴、含有晶體之液滴及含有沉澱物質與晶體之混合 物之液滴。 結果·自所評估之72個孔，以下結晶緩衝液產生呈針叢 集形狀之晶體： -約0·9 Μ磷酸二氫鈉與約〇 9 M磷酸二氫鉀，pH值為約 4.1 ； 4 1 ·8 ΜΘ g夂—氫納’無钟鹽，pH值為約4.6。 在所有三種蛋白質濃度下以該等條件均得到晶體。 實例32-以懸滴汽相擴散模式、在不同溫度下進行之磷酸 二氫鈉鉀/乙酸鈉柵格篩選 除儲存溫度增至3CTC外，實驗條件與實例31相同。 結果.自所評估之72個孔，以下結晶緩衝液產生呈針叢 集形狀之晶體： 蛋白質濃度為約5 mg/mL : 約〇·9 Μ碌酸二氫鈉與約〇·9 Μ磷酸二氫鉀，PH值為約 4.1 ； 約1,8 M鱗酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4.1。 1257〇4.d〇c -61 - 200835699 約1,8 M磷酸二氫鈉，無鉀鹽，pH值為約4·6。 -約1.8 Μ磷酸二氫鈉，無鉀鹽，ρΗ值為約'I。 蛋白質濃度為約10 mg/mL· : -約0.9 Μ碟酸-_如# 41; 風納與約〇.9關酸二氫却，PH值為約 -約1·8 Μ磷酸二氫鈉，無鉀鹽，阳值為約“。 -約1 · 8 Μ碌酸二氫鈉，盖 無鉀鹽，pH值為約5 .ι。 蛋白質濃度為約20 mg/mL : pH值為約 -約〇.9關酸二氫鈉與約0.9 _酸二氫卸 4·1 ;及 •約1·8 Μ構酸二氫鋼，|知 無鉀鹽，pH值為約4 1。 汽相擴散結晶實驗結果之討論： 最初使用充分描述之/N招# + 1 述之小規杈方法進行結晶實驗。由 PEG 4,0 0 07乙酸鋼緩播：、、右片丄 、 、 條件經研究不同抗原特異性 源的不同抗體之其他發明| # 月考描述為具有前景之結晶條 因此決定以該等試劑起妒 良 -1¾始。廣泛實驗後發現至少在 之影響結晶之因素（蛋白曾遭择 、贫曰貝辰度、沉澱劑濃度、緩衝液離 子強度及pH值、溫度）的έ )的組合下，於乙酸鹽緩衝液中之 PEG 4,000並不提供晶I# 因此決定繼續廣泛結晶篩 選，由此將多種化學品引入餘 師選過程。隶後，意外地發現 乙酸鹽緩衝液中之磷酸-*知μ 牛^ 一 11鈉對於D2E7為強有力之結晶 劑’其並不引入任何自Μ驢％ _ | 目醫樂觀點來看不可接受之毒性試 劑。 D·批次結晶實驗 125704.doc -62 - 200835699 以下實例中所給出之濃度值為關於抗體溶液及結晶溶液 之兩種溶液混合前的初始值。 若未另外描述，則所有pH值係指乙酸鹽缓衝儲備液在其 與如結晶劑之其他物質組合前之pH值。 若未另外描述，則所有緩衝液莫耳濃度係指通常使用冰 乙酸進行之pH值調節前儲備溶液中之乙酸鈉濃度。 實例33-在800 pL批次體積下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉 批次結晶

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7.4) 中。將蛋白質濃度調節至5 mg/mL、1 0 mg/mL或20 mg/mL 〇 藉由在1.5 mL Eppendorff反應管中混合約400 μΐ^之各蛋 白質溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由混合乙酸 鹽緩衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及 Milli Q水製備400 μΐ^特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽 緩衝液莫耳濃度為0.1 Μ且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1。使 用磷酸二氫鈉與磷酸二氫鉀之以下組合：約0.9 Μ磷酸二 氫鈉與約0.9 Μ磷酸二氫鉀。將反應管儲存在環境溫度 下。11天後進行1 μί等分試樣之顯微鏡觀察。 結果：11天後未觀測到晶體。 實例34-在600 pL批次體積下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批 次結晶

將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7.4) 中。將蛋白質濃度調整至10 mg/mL。 125704.doc -63- 200835699 藉由在1.5 mL Eppendorff反應管中混合約300 pL蛋白質 溶液與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由混合乙酸鹽緩 衝液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備300叫特定結 晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為%且 乙酸鹽緩衝液pH值為約4· 1。構酸二氫鈉莫耳濃度分別為 約1.5 Μ、1·8 Μ、2.1 Μ及2.4 Μ。將反應管儲存在環境溫 度下。11天後進行1 μΐ^等分試樣之顯微鏡觀察。 結果：11天後未觀測到晶體。 馨 實例35-在1 mL批次體積下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉柵 格篩選批次結晶 在不交換緩衝液情況下使用D2E7。因此，初始組合物 為D2E7 50/mL、甘露糖醇12 mg/mL、聚山梨醇酯⑽i mg/mL、檸檬酸單水合物ι·3〇5 mg/mL、捧樣酸鈉〇·3〇5 mg/mL、構g曼氫二鈉二水合物1 ·53 mg/mL、脫水鱗酸二氣 納 0.86 mg/mL及氯化納 6.16 mg/mL，pH 5.2。 _ 藉由以Μί1Η Q水稀釋使D2E7之濃度達到約10 mg/mL。 藉由在24孔板之孔中混合約500 μΕ蛋白質溶液與等量之 結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、 - 磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及MiUi Q水製 ' 備500吣特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳 濃度為0.1 Μ且乙酸鹽緩衝液ρΗ值為約4.1、4 6、s，上 • ) · 1 或 5 _6。使用碟酸二氫納與填酸二氫钟之以下組合·· -約0.7 Μ磷酸二氫鈉與約〇·7 μ磷酸二氫鉀； -約0.9Μ磷酸二氫鈉與約〇·9Μ磷酸二氫鉀； 125704.doc •64· 200835699 -約1.8 Μ磷酸二氫鈉，無鉀鹽， -約2.1 Μ磷酸二氫鈉，無鉀鹽， -約2·4 Μ磷酸二氫鈉，無鉀鹽。 製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。4天後 進行板之顯微鏡觀察。 結果· 4天後未觀測到晶體。 實例36·在1 mL批次體積下進行之磷酸二氫鈉鉀/乙酸鈉柵 格篩選批次結晶 將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氯化鈉緩衝液（pH 7·4)中。將蛋白質濃度調節至lOmg/mL。. 藉由在24孔板之孔中混合約500 pL蛋白質溶液與等量之 結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、 磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Milli Q水製 備500 μι特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳 濃度為0·1 Μ且乙酸鹽緩衝液ρΗ值為約4.1或4.6。分別應用 以下填酸二氫納與鱗酸二氫鉀之組合： -約1 · 8 Μ填酸二氫納與約〇 · § μ麟酸二氫鉀； -約2·2 Μ構酸二氫鈉與約〇,6 μ鱗酸二氫卸； -以0.2 Μ為梯級自約2.6 Μ磷酸二氫鈉至約4.4 Μ磷酸二 氫納，無卸鹽。 製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。在接下 來之一週内多次進行板之顯微鏡觀察。此外，藉由〇D28〇 測定二個批次之晶體產量。在14,〇〇〇 rpm下離心懸浮液之 等分試樣且評估上清液中之蛋白質濃度。 125704.doc -65- 200835699 結果：於以下8個批次中發現針叢集狀晶體·· -乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約3·6 Μ至約4.4之填酸二氫鈉莫 耳濃度（0·2 Μ梯級）； -乙酸鹽緩衝液pH 4.6及約4.0 Μ至約4.4之磷酸二氫鈉莫 耳》辰度（0 · 2 Μ梯級）。 評估乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約4.0 Μ至約4.4 Μ之磷酸二 氫鈉莫耳濃度的批次之晶體產量。5天後如藉由OD280自 上清液中剩餘蛋白濃度測定之晶體產量超過95%。 組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質明顯存在 於該等批次中（乳狀懸浮液，典型光學顯微照片）。由於5天 後未觀測到沉澱物質，推斷先前沉澱物質重新排列成結晶 物質。蛋白質在結晶混合物中高度過飽和且蛋白質立即沉 殿。一些蛋白質仍可溶解，現僅稍微過飽和或許甚至低於 飽和。晶體形成，由此進一步降低溶解蛋白質之濃度。此 外’沉澱物質明顯隨時間再溶解且併入生長之晶體中。 實例37_在1 mL批次體積、不同蛋白濃度下進行之磷酸二 氫鈉/乙酸鈉栅格篩選批次結晶 在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。 藉由以Milli Q水稀釋液體使D2E7之濃度達到約ι〇 mg/mL。 藉由在24孔板之孔中混合約5〇〇叫蛋白質溶液與等量之 結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、 磷酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及MiUi q水製 備500 pL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳 I25704.doc -66 - 200835699 濃度為0_1 Μ且乙酸鹽緩衝液pH值為約4.1或4·6。磷酸二氫 納莫耳濃度以〇 · 2 Μ之梯級自約2 · 6 Μ鱗酸二氮納變化至約 4·4 Μ磷酸二氫鈉。製備結晶混合物後，隨後密封孔以防 止水蒸發。在接下來之一週内多次進行板之顯微鏡觀察。 此外，藉由OD280測定一個特定批次之晶體產量。在 14,000 rpm下離心懸浮液之等分試樣且評估上清液中之蛋 白質濃度。 結果：於以下6個批次中發現針叢集狀晶體： -乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約3·4 Μ至約4.4之磷酸二氫鈉莫 耳濃度（0·2 Μ梯級）。 評估乙酸鹽緩衝液pH 4.1及約4.2 Μ之磷酸二氫鈉莫耳濃 度的批次之晶體產量。8天後如藉由OD280自上清液中剩 餘蛋白濃度測定之晶體產量超過95%。 組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質明顯存在 於該等批次中（乳狀懸浮液，典型光學顯微照片）。由於6天 後未觀測到沉澱物質，推斷相變出現，其中先前沉澱物質 重新排列成結晶物質。 實例38_在2 mL批次體積下進行之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次 結晶 將D2E7緩衝入20 mM HEPES/150 mM氣化鈉緩衝液（pH 7·4)中。將蛋白質濃度調節至10 mg/mL。 藉由在2 mL Eppendorff反應管中混合約1 mL蛋白質溶液 與等量之結晶溶液進行批次結晶。藉由混合乙酸鹽緩衝 液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備1 mL特定結晶溶 125704.doc • 67- 200835699 液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為〇 ι m且乙酸 鹽緩衝液pH值為約4_1。磷酸二氫鈉莫耳濃度為約4 〇 μ、 4·2 Μ或4·4 Μ。將反應管儲存在環境溫度下。在接下來之 1週内多次進行1叫等分試樣之顯微鏡觀察。 結果：6天後在所有批次中發現針叢集狀晶體。 組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質明顯存在 於該等批次中（乳狀懸浮液，典型光學顯微照片）。如實例 36中所述，先前沉澱物質重新排列成結晶物質。 實例39-在1 mL批次體積、不同蛋白質濃度下進行之磷酸 二氫鈉/乙酸鈉柵格篩選批次結晶 在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。 藉由在24孔板之孔中混合約5〇〇 pL蛋白質溶液與等量之 結晶溶液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、 石粦酸二氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及Miin q水製 備5 0 0 pL特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳 濃度為0·1 Μ且乙酸鹽缓衝液pH值為約4.1。構酸二氫納莫 耳濃度以0 · 2 Μ之梯級自約0.2 Μ變化至約4 · 4 Μ。製備纟士曰 、u曰白 混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。在接下來之一週内 多次進行板之顯微鏡觀察。此外，藉由OD280測定批次之 晶體產量。在14,000 rpm下離心懸浮液之等分試樣且評话 上清液中之蛋白質濃度。 結果··於以下2個批次中發現針叢集狀晶體·· •約3.4 Μ及約3·6 Μ之磷酸二氫鈉莫耳濃度。 沉澱物質及油性沉澱相亦存在於含有該等晶體之抵-欠 125704.doc -68 - 200835699 中。 實例40-在20 mL批次體積、攪動下進行之磷酸二氫鈉/乙 酸鈉批次結晶 在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。 藉由以Milli Q水稀釋使d2E7之濃度達到約1〇 mg/mL。 藉由在50 mL Falcon管中混合約10 mL蛋白質溶液與等 置之結晶溶液進行批次結晶。藉由在管中混合乙酸鹽緩衝 液、碟酸二氫鈉儲備溶液及MUH Q水製備1〇 mL結晶溶 液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為〇·1 Μ且乙酸 鹽緩衝液pH值為約4·〗。磷酸二氫鈉莫耳濃度為4·2 Μ。將 管儲存在環境溫度下，於實驗室震盪器上攪動該批次。在 接下來之一個月内多次進行1 μί溶液之等分試樣的顯微鏡 觀察。 結果：該批次中觀測到沉澱物質。 實例41a-在1〇〇 1111批次體積、無攪動下進行之磷酸二氫 鈉/乙酸鈉批次結晶 在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。 藉由以Milli Q水稀釋使D2E7之濃度達到約丨〇 。 藉由在乾淨1 L聚丙浠觀中混合約5 〇 mL蛋白質溶液與等 里之尨日日/合液進行批次結晶。藉由在管中混合乙酸鹽緩衝 液、磷酸二氫鈉儲備溶液及Milli Q水製備50 mL結晶溶 液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳濃度為G.l Μ且乙酸 鹽編ΡΗ值為約u。磷酸二氫納莫耳濃度為4·2 Μ。將 奋為儲存在環境溫度下。在接下來之—個月内多次進行溶 125704.doc •69- 200835699 液之1 pL等分試樣的顯微鏡觀察。 結果：7天後觀測到針叢集狀晶體。7天後如藉由QD280 自上清液中剩餘蛋白濃度測定之晶體產量超過95%。 組合蛋白質溶液與結晶溶液後即刻，沉澱物質存在於該 等批次中（乳狀懸浮液，典型光學顯微照片）。由於7天後未 觀測到沉澱物質’推斷相變出現，其中先前沉澱物質重新 排列成結晶物質。 實例411)_在1 mL、5〇 mL及10 L批次體積、無攪動下進行 之磷酸二氫鈉/乙酸鈉批次結晶 亦藉由在10 L聚丙浠容器（Nalgene®)中組合1 L於阿達木 單抗商業緩衝液調配物pH 5.2(參見實例35)中之50 mg/mL D2E7與4 [注射用水（WFI)進行D2E7之大規模結晶。藉由 輕輕震盪使溶液均質化。接著將該5 l D2E7溶液（1〇 mg/niL)與5 L沉澱劑溶液（5 Μ磷酸二氫鈉，4,400 mL ; 1 Μ 乙酸納緩衝液 pH 4.1，500 mL ; WFI(Ampuwa)100 mL)混 合。以500 mlL份添加沉殿劑溶液。添加各部分後，藉由輕 輕旋轉/翻轉瓶使溶液均質化。添加約2,5〇〇至3,〇〇〇 mL沉 殿劑溶液後，白色沉澱出現。立即全部添加剩餘沉澱劑。 接著再次將晶體製劑均質化（輕輕旋轉/翻轉）。 批次製造後（亦即混合5 L D2E7溶液與5 L沉澱劑後）立即 分為1 mL(填充入低容量Eppendorf樣品小瓶中）及5〇机等 分試樣（填充入50 mL Falcon試樣管中）且鄰近於1〇 [容器 儲存以便控制且評估批量大小對D2E7結晶之影響。如圖2 至4所概述，批次體積（亦即分別1、50 mL及1〇 l)對 125704.doc -70- 200835699 D2E7晶體針/針叢集尺寸無影響。 論述批次結晶實驗之結果： 由於所應用小規模技術（參見上文D部分）對於大規模生 產蛋白質晶體不可行，因此將由該等小規模方法發現之結 晶條件轉移至可縮放批次模式中。 D2E7以最終高產率（>95%)及再現性在100 mL批次體積 下成功結晶，表明該結晶系統適用於工業處理。藉由SDS-PAGE分析，證明晶體之蛋白質特徵。對再溶解晶體之SE-HPLC分析僅展示聚集物質稍微增加。藉由使用含有磷酸 二氫鈉之乙酸鹽緩衝液（於約0.1 Μ乙酸鈉pH值為約4.1中 之約4.2 Μ磷酸二氫鈉）洗滌晶體為可能的。如藉由OD280 所分析，無可量測之D2E7晶體溶解性在該洗滌緩衝液中 出現，晶體之回收率大於90%。 以上批次實驗之實驗條件概括於下表1中： 125704.doc 71 - 200835699 表i-批次實驗

實例 批次體積 結晶溶液 緩衝液 交換 晶體 產量 緩衝液 pH值 最終pH 值 最終蛋白質濃 度 mg/mL 溫度 可見對照 之天數 33 800 μΐ 0.1 Μ NaAc、 NaH2P04 0·9Μ、 KH2P〇4 0.9 M 是 無 4.1 2.5-10 環境溫度 11天 34 600 μΐ 0.1 M NaAc、 NaH2P04 1.5-2.4 M 是 無 4.1 5 環境溫度 11天 35 1 ml 0.1 M NaAc、 NaH2P04 0.7 M、 KH2P04 0.7 M 無 4.1-5.6 5 環境溫度 4天 0.1 M NaAc、 NaH2P04 0.9 M、 KH2P〇4 0.9 M 4.1-5.6 0.1M NaAc、 NaH2P04 1.8 M 4.1-5.6 0.1 M NaAc、 NaH2P04 2.1 M 4.1-5.6 0.1 M NaAc、 NaH2P04 2.4 M 4.1-5.6 36 1 ml 0.1 M NaAc、 NaH2P04 3.6-4.4 M 是 >95% 4.1 3.9-3.7 5 環境溫度 5天 0.1 M NaAc、 NaH2P04 4.0-4.4 M 4.6 4.0-3.9 環境溫度 37 1 ml 0.1 M NaAc、 NaH2P04 3.4-4.4 M >95% 4.1 3.9-3.7 5 環境溫度 6天 38 2 ml 0.1 M NaAc、 NaH2P04 4.0-4.4 M 是 n.d. 4.1 3.9-3.7 5 環境温度 6天 125704.doc -72- 200835699 39 1 ml 0.1 Μ NaAc、 NaH2P04 3.4-3.6 M n.d+ 沉澱物 4.1 25 環境溫度 6天 40 20 ml 攪動 0.1 M NaAc、 NaH2P04 4.2M 沉澱物 4.1 3.8 5 環境溫度 4天 41a 100 ml 無擾動 0.1 M NaAc ' NaH2P04 4.2M >95% 4.1 3.8 5 環境溫度 7天 41b 1 ml、50 ml 或 101 0.1 M NaAc、 NaH2P04 4.4 M n.d. 4.1 n.d. 5 環境溫度 Ε·晶體處理及分析之方法 實例42-洗滌晶體 晶體形成後，不使晶體再溶解之洗滌步驟係有利的。因 此，結晶過程完成後，將結晶漿液轉移入離心管中且在 500至lOOOxg下離心二十分鐘。在4°C下進行離心但亦可在 其他可行溫度、例如室溫下進行。離心後，丟棄上清液且 將晶體顆粒再懸浮於在約〇· 1 Μ乙酸鈉pH值為約4.1中含有 約4.2 Μ磷酸二氫鈉之緩衝液中。如藉由OD280所分析， 無可量測之D2E7晶體溶解性在洗滌緩衝液中出現。隨後 將離心/再懸浮步驟重複1至3次，且在此洗滌程序後，將 顆粒再懸浮且儲存於在約〇· 1 Μ乙酸鈉pH值為約4.1中含有 約4·2 Μ磷酸二氫鈉之緩衝液中。 實例43-藉由SDS-PAGE分析晶體 為證實晶體之蛋白質特徵，以如實例42中所述之洗滌緩 衝液洗滌晶體。藉由OD280確保在離心後不再有溶解之蛋 白質存在於上清液中後，丟棄上清液且隨後將晶體溶解於 蒸餾水中。該溶液之OD280量測揭示晶體基本上由蛋白質 125704.doc •73- 200835699 =成此係由於現樣品之吸光率顯著高於殘餘洗務緩衝 ;文田與原始D2E7樣品相比較時，再溶解晶體之該溶液 之SDS-PAGE分析展示相同圖案。 F·其他實例 、下實例中所給出之濃度值為關於抗體溶液及結晶溶液 之兩種溶液混合前的初始值。 若未另外描述，則所有pH值係指乙酸鹽緩衝儲備液在其 與如結晶劑之其他物質組合前之pH值。 若未另外描述，則所有緩衝液莫耳濃度係指通常使用冰 乙酸進行之pH值調節前儲備溶液之乙酸鈉濃度。 實例44-固體結晶劑 在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。 藉由以Milli Q水稀釋液體使D2E7之濃度達到約ι〇 mg/mL 〇 藉由在24孔板之孔中混合約5〇〇 _蛋白質溶液與等量之 乙酸鹽緩衝液（0.1 Μ，pH值分別為々.丨或冬幻進行批次結 晶。隨後，以六種不同比率將固體磷酸二氫鈉二水合物添 加至各pH值環境中··約 0.23 g、0.27 g、0.30 g、0.33 g、 0.36 g及0·39 g。因此，在結晶劑之溶解完成後，濃度為約 1.5至2.5 Μ，以〇·2 Μ為梯級。隨後密封孔且在實驗室震 盪器上攪動板直至結晶劑完全溶解。此後，在無振盪下將 24孔板儲存於環境溫度下。5天後進行板之顯微鏡觀察。 結果··於以下7個批次中發現針叢集狀晶體·· -乙酸鹽缓衝液pH 4_1及分別為約2·1 Μ、2.3 Μ及2·5 Μ之 125704.doc -74 - 200835699 磷酸二氫鈉莫耳濃度。 -乙酸鹽緩衝液pH 4.6及分別為約丨.9 Μ、2·1 Μ、2·3 ]V[及 2·5 Μ之磷酸二氫鈉莫耳濃度。 實例45-不同緩衝液製備方案及晶體之製備 在該實例中，如以下所述製備乙酸鹽緩衝液：以約C mL純水稀釋3 g冰乙酸。以氫氧化鈉溶液調節ρΗ值且將體 積調節至50 mL。在此情況下，總乙酸鹽量固定在i Μ(尹 曰曰溶液中100 mM或結晶混合物中50 mM)且藉由pH值調節 而擴大。 在不交換緩衝液情況下使用D2E7(參見實例35)。 藉由以Milli Q水稀釋液體使D2E7之濃度達到約 mg/mL 〇 藉由在24孔板之孔中混合約500 μΐ蛋白質溶液與等量之 結晶 >谷液進行批次結晶。藉由在孔中混合乙酸鹽緩衝液、 磷酸一氫鈉儲備溶液、磷酸二氫鉀儲備溶液及MiUi q水製 備500 μί特定結晶溶液。在該實例中，乙酸鹽緩衝液莫耳 濃度為0·1 Μ且乙酸鹽缓衝液pH值分別為約4· 1及4.6。磷酸 一氫納莫耳濃度以0·2 Μ之梯級自約3·4 Μ變化至約4·4 Μ。 製備結晶混合物後，隨後密封孔以防止水蒸發。5天後進 行板之顯微鏡觀察。 結果·於以下9個批次中發現針叢集狀晶體： •乙酸鹽緩衝液pH 4.1及以G.2為梯級約36至4.4之磷酸二 氫鈉莫耳濃度。 -乙酸鹽緩衝液pH 4·6及以0·2為梯級約36至42之鱗酸二 125704.doc -75- 200835699 氫鈉莫耳濃度。 實例46-製備囊封晶體 如使用 MaWern Instruments Zetasizer nan〇經由 z電位量 測所測定，實例41中獲得之晶體帶正電荷。 里

洗務晶體且懸浮於保留結晶性且具有保持晶體帶電荷的 pH值之含有賦形劑之緩衝液中。隨後，將適當囊封劑添加 至晶體懸浮液中。在此情況下’適當囊封劑為具有低毒 性、生物可降解性及抗衡離子特徵之（聚合型）物質。歸I 於該抗衡離子特徵，該物f被吸引至晶體且允許塗佈。藉 由該技術’晶體在並不含有任何其他維持結晶性的賦形^ 之介質中之溶解較佳得以保持。 實例47_囊封/包埋晶體之製備 如實例41中所述獲得晶體。 洗蘇晶體且將其懸浮於含有保留結晶性之賦形劑的緩衝 液中。 晶體可隨後： -藉由乾燥晶體且藉由例如壓縮、㈣分散等組合該等乾 燥晶體與載劑來包埋。 -藉由組合晶體懸浮液與不可與水混溶之載劑溶液來囊 封/包埋。移除載劑之溶劑後載劑㈣。隨後，乾燥材 料。 -藉由組合晶體懸浮液與可與水混溶之載劑溶液來囊封/ *包埋。當混合物中载劑超過其溶解度極限時載劑沉澱。 -精由組合乾燥晶體或晶體懸浮液與可與水混溶之載劑溶 125704.doc -76- 200835699 液來包埋。 _藉由組合乾燥晶體與不可與水混溶之載劑溶液來包埋。 G·晶艘表徵 概述經執行以確定晶體物質在再溶解後結晶單株抗體 D2E7疋否保留從未結晶之D2E7的生物活性特徵之以下實 驗部分。 G1·利用鼠類L_929細胞之生物活性測試 a)—般方法 測定D2E7溶液對抗重組人類TNF(rHuTNF)之細胞毒性效 應的中和效應。此包括在37r下在96孔微量滴定盤中在各 種D2E7濃度存在下將作為指示劑之小鼠l_929細胞與確定 里之rHuTNF —起培育48小時。以結晶紫（cryStai vi〇iet)將 存活細胞染色。藉由分光光度測定法在微量滴定盤之個別 孔中里測顏色強度且對其加以評估。量測JC 5〇值，亦即使 rHuTNF對L-929細胞之細胞毒性效應降低以使得5〇%之細 胞存活的D2E7之濃度。 在獨立稀釋框中，對於樣品及參考標準由1 蛋白質/毫 升稀釋液起始，在稀釋管中分別製備9力價曲線量測點（曲 線稀釋）。 以培養基稀釋欲使用之L-929細胞懸浮液以提供每毫升 60,000個細胞之濃度。隨後，將每孔1〇〇 rL之各別細胞濃 度吸入測試板之第1 -11行。第丨2行之孔各自僅含有1 〇〇 μΕ 之培養基。在測試板中在37 °C及5%(v/v)C〇2下培育24小 時。 125704.doc -77- 200835699 培月24小日夺後，對於參考標準或樣品將5〇 9力價曲 線稀釋液之每-者自稀釋框轉移至測試板，亦即對於參考 払準，轉移至第1-9行第A_D列之孔且對於樣品轉移至第 9行第E-Η列之孔。 將50吣培養基吸入第1〇行；且將100 μί各自吸入第u 及12行。 將50 μί之TNF參考標準（12·5 ng蛋白質/毫升培養基）吸 入第1至10行第A至Η列之孔，由此第1〇行對應於1〇〇%溶胞 值（TNF對照）。 第11行為100%生長對照，且第12行不含有細胞物質且 因此充當空白。每孔最終體積為2〇〇 。 在37 °C下且以5% C〇2將測試板培育48小時。培育2天 後，藉由迅速翻轉且給予單次有力向下震盪拋棄測試板孔 中之液體。接著將50 pL結晶紫溶液（0.75%結晶紫、〇.35〇/〇 氯化鈉、32.4%乙醇及8_6%甲醛）吸入各孔。將溶液保持在 孔中15分鐘且隨後如上所述丟棄。接著洗滌板且在室溫下 乾燥約30分鐘。隨後’將1〇〇 μΕ試劑溶液（5〇%乙醇及〇.1〇//〇 乙酸）吸入各孔。攪動板（在約300 rpm下15 min)在各孔中 產生均勻有色溶液。 在板光度計中在620 nm下量測測試板孔中染料之吸光 率。在圖表上繪製個別值，以吸光率（y軸）對抗體之個別稀 釋度或濃度ng/mL(x軸）作圖。自4參數曲線圖，讀出半數 細胞存活且半數死亡之濃度（ICw值）。藉由曲線資料之4參 數函數之參數3計算此濃度。計算參考標準濃度之平均 125704.doc • 78 - 200835699 值。藉由將參考標準之平均IC5〇值除以樣品之個別ic5。值 且乘以100¼計算樣品之相對生物活性。接著將相對活性 平均化。 b)D2E7晶體之相對活性

進打該測試以比較樣品與參考標準之生物活性。相對 D2E7之濃度繪示且藉由4參數非線性回歸評估之吸收值揭 示藉由抗體抑制TNF作用之IC5〇值。由於兩種樣品均以四 重複在一個微板上進行，因此對於〇2£7參考標準及樣品 此舉分別得到4個ICw值。隨後，計算參考標準lCw值之平 均值且藉由將參考標準之平均比^值除以樣品之相關ic^ 值且乘以1 〇 〇 %评估樣品之各重複之相對活性。 樣品之測試（如實例36中所述製備之晶體懸浮液2.7 mg/mL)揭示111%之相對生物活性。 因此’可遇為樣品具有完全生物學活性。 G2·微觀表徵 在以下提供關於D2E7晶體之微觀表徵的資料。 a) mAb晶體批次樣品之光學分析 均化後，將1至10叫樣品體積之等分試樣吸於目標固持 板上且以蓋玻片覆蓋。分別使用裝備有Ε·ΡΙ 10倍目鏡及⑺ 倍、20倍及40倍物鏡之Zeiss Axi〇ven 25倒轉光學顯微鏡 評估晶體製劑。使用數位攝影機（s〇ny S75)拍攝照片。 b) 汽相擴散實驗之光學分析、近似晶體尺寸之評估及雙折 射之偵測 & 125704.doc •79- 200835699 對於此目的，分別使用裝備有CFW 10倍目鏡及4倍、 倍、20倍及40倍物鏡之NikonLabophot顯微鏡。 對於評估汽相擴散實驗，篩選24孔板中之^品液滴。 藉由藉助於JVCTKC测彩色攝像機將顯微照片轉移於 電腦屏幕上且藉由量測代表性針狀或針叢集狀晶體之長度 或直徑，應用 JVC Digital Screen Measurem_ c〇met軟體 版本^2a評估晶體尺寸。此外，顯微鏡裝備錢光器組 (偏光器及分析器）以評估樣品之雙折射行為。 若偏光器及分析器濾光器之偏振方向相對於彼此設置在 9〇角度（”正交偏光器”），則光不會穿過顯微鏡目鏡；影像 將呈現深色或黑色。若現在置於正交偏光器之間的光束中 之樣。口旎夠使光之偏振面旋轉，則相對於深色背景將觀察 到樣品之獨特微光。此行為稱為”雙折射”，使有序結晶型 (各向異性）物質與無序非晶形物質區分開。由於雙折射為 各向異性物質之特徵，因此此微光出現證明晶體物質之存 在。然而，雙折射之缺乏並不排除晶體物質之存在，此係 因為晶體亦可顯示立體對稱且因此如非晶形物質般為各向 同性的。 c)結果 在附圖1至4中提供D2E7晶體之代表性照片。 圖1展不藉由小規模批次結晶根據實例37在室溫下6天後 獲侍之D2E7晶體（5 mg/mL最終蛋白質濃度；結晶緩衝 液··於0.1 Μ乙酸鈉（pH 4J)中之4·2 M磷酸二氫鈉）。晶體 顯示雙折射。 125704.doc 200835699 圖2至4展示藉由大規模批次結晶根據實例41b獲得之 D2E7晶體。 可注射性：併入晶體中且於含有20%(m/v)PEG 4,000之 緩衝液中調配之D2E7晶體懸浮液200 mg/mL蛋白質可經由 27 1/2 G針注射。 G3.雙折射 為證明阿達木單抗結晶實際上提供結晶物質，分析其雙 折射。 蛋白質：以雙蒸餾水將於調配緩衝液中之70 mg/mL阿達 木單抗稀釋至10 mg/mL。 沉澱劑：4 M NaH2P04(於雙蒸餾水中之溶解粉末） 方法：於具有2 mL隔室孔之懸滴盤中微批次結晶，混合 5 00 μ[蛋白質溶液與500 蛋白質；溶液中無NaOAc。 溫度：24°C。 用於雙折射量測之技術設備··裝備有Nikon CoolPix CCD攝影機之Nikon SMZ1500立體解剖顯微鏡。在正交偏 光器下拍攝晶體雙折射。放大倍數為約200倍。 相應顯微圖展示於圖5 A中。觀測到阿達木單抗之針狀晶 體之叢集之顯著雙折射。當晶體針軸之方向相對於光偏振 方向旋轉時，晶體之彩色自藍色變化至紅色，接著回到藍 色。 另一組顯微圖描述於圖5B、C及D中。 以 Nikon Eclipse E600 POL 顯微鏡及 Nikon DXM 1200 數 位攝影機拍攝所有影像。放大倍數為約40倍。 125704.doc -81 - 200835699 以水平極拍攝到圖5B之影像（灰色）且其展示顆粒形態。 黑色背景上之白色晶體（圖5D)展示雙折射且係以交叉極獲 得。紫色背景上之藍色及橙色晶體（圖5C)展示雙折射且係 以交叉極及紅色補償器或四分之一波片獲得。 H. 晶體可注射性 在以下部分，進行實驗以測定單株抗體D2E7之結晶懸 浮液（於PEG中）（10-200 mg/mL)使用不同號針之可注射 性。 PEG緩衝液： 20% PEG 4,000 m/v 12 mg/mL甘露糖醇 0· 1 mg/mL聚山梨醇醋80 I. 3 05 mg/mL擰檬酸單水合物 0.305 mg/mL·檸檬酸鈉 1.53 mg/mL脫水填酸氫二鈉 0.86 mg/mL脫水填酸二氫鈉 pH值以氫氧化鈉調節至5.2 由於注射器在投藥過程中藉由患者手動，因此進行注射 器排空（1 mL填充體積）。評估20-27.5G針尺寸。 注射器： 20/23/26G :

Henke Sass Wolf GmbH 1 mL Norm-Ject注射器，其裝備 有： -Henke Sass Wolf GmbH Fine-Ject® 20G針 I25704.doc -82 - 200835699 -Terumo⑧ 23G針 -Neopoint® 26G針 27.5G ： BD HyPak SCF™ 1 mL長注射器，其裝備有27.5G RNS 針 38800 Le Pont du Claix 結果（圖6)表明較大號針在高濃度下提供晶體之較慢傳 遞。 I·穩定性資料（SE HPLC、FT-IR)

在以下部分，進行實驗以測定單株抗體D2E7之結晶懸 浮液（50及200 mg/mL)經在2-8°C下儲存12個月之穩定性。 晶體懸浮於如可注射性研究中所用之介質中： 20% PEG 4,000 m/v 12 mg/mL甘露糖醇 0· 1 mg/mL聚山梨醇醋80 1.3 05 mg/mL檸檬酸單水合物 0.305 mg/mL·擰檬酸鈉 1.53 mg/mL無水填酸氫二鈉 0.86 mg/mL無水碗酸二氫鈉 pH以氫氧化鈉調節至5.2

SE-HPLC 50 mg/mL阿達木單抗晶體懸浮液在2-8°C下隨時間之穩定性 時間點 聚集度(％) 單體(％) 片段(％) T0 1.3 98.5 0.2 1個月 1.4 98.3 0.3 3個月 2.2 97.5 0.3 I25704.doc -83- 200835699 6個月 3.2 96.3 —_0.5 9個月 4.0 95.5 0.5 12個月 4.2 95.1 ___0.7 200 mg/mL阿達木單抗 時間點 聚集度(％) 單體(％) 片段(％) T0 1.3 98.5 1個月 1.3 98.4 ~03~~' 3個月 1.9 97.8 ^03~~' 6個月 2.4 972 0.4 9個月 2.5 97.0 0.5 12個月 2.6 96.8 使用Dionex HPLC系統（P680泵、ASI 100自動進樣器、 UVD170U)以藉由SEC進行穩定性分析。應用0.5 mL/min之 流速，在GE Superose® 6柱上分離D2E7樣品。在214 nm之 波長下進行UV定量（偵測）。電泳緩衝液由於0·02 Μ鱗酸納 緩衝液（pH 7 ·5)中之0 · 15 Μ氣化納組成。以Confocheck夺 統在Bruker Optics Tensor 27上記錄IR光譜。使用

MicroBio-lytics AquaSpec單元分析液體樣品。在25。〇下進 行至少兩次120至500掃描之量測，評估各樣品。分別自蛋 白質光譜中減去空白緩衝液光譜。藉由傅裏葉變換 (Fourier transformation)產生蛋白質二階導數光譜且自 1580-1720 cm·1將載體正規化以用於相對比較。晶體之再 溶解係如下執行：以Humira®商業缓衝液將晶體懸浮液稀 釋至10 mg/mL蛋白質濃度。藉由降低PEG濃度使晶體再溶 解。 藍色-標準，冷束/解束後之Humira® 紅色-在25°C、50 mg/mL儲存6個月後之再溶解晶體 125704.doc -84- 200835699 綠色-在25°C、200 mg/mL儲存6個月後之再溶解晶體 結果：圖7說明在25°C下儲存6個月後不存在構形差異 J·形態學 在2-8°C儲存12個月後，藉由光學顯微術分析晶體未觀 測到顯著形態變化。

將1至10 gL樣品體積之等分試樣吸於目標固持板上，以 調配緩衝液（20% PEG)稀釋且用蓋玻片覆蓋。分別使用裝 備有E-PI 10倍目鏡及10倍、20倍及40倍物鏡之Zeiss Axiovert25倒轉光學顯微鏡評估製劑。 參考文獻：

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America 100(12): 6934-6939 ° 【圖式簡單說明】 囷1 6天後實例37之D2E7晶體。 125704.doc -87 - 200835699 圖2以1 mL批次體積在環境溫度下製備之D2E7晶體。 圖3以50 mL批次體積在環境溫度下製備之D2E7晶體。 圖4以10 L批次體積在環境溫度下製備之D2E7晶體。 圖5根據本發明製備之D2E7晶體及其雙折射。 圖6經由不同號針注射之不同濃度之D2E7晶體懸浮液。 圖7 D2E7晶體懸浮液之FT-IR分析。

125704.doc -88- 200835699 序列表 <11〇> 百慕達商亞培生物科技公司 <120>結晶型抗-hTNFa抗體 <130> 8216 <140〉 096140427 <141> 2007-10-26 <150> 60/855,104 <151> 2006-10-27 <160〉 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> 人工

<220> <223> D2E7輕鏈之可變區 <400> 1

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Arg Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 125704.doc 200835699 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> D2E7重鏈之可變區 <400> 2

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> D2E7輕鏈CDR3區 <220> <221> MISC 一 FEATURE <222> (9)..(9) -2- 125704.doc 200835699 <223> Xaa為Thr或Ala <400> 3

Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> D2E7重鏈CDR3區 <220> <221> MISC_ FEATURE <222> (12). ，.(12) <223> Xaa 為 Tyr 或 Asn <400> 4

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 214 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> D2E7輕鏈序列 <400> 5

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 125704.doc 200835699

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 6 <211> 451 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> D2E7重鏈序列 <220> -4- 125704.doc 200835699 <221> MISC一FEATURE <222> (451) . . (451) <223> Xaa缺失或為Lys <400> 6

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val Thr Val 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 125704.doc 200835699

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 325 330 335

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 125704.doc 200835699

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro Gly Xaa 450

125704.doc

Claims (1)

1. 200835699 十、申請專利範圍： L 一種用於使抗-hTNFa抗體結晶之批次結晶方法，其包含 以下步驟·· (a) 提供該抗體與作為結晶劑之無機磷酸鹽混合的水溶 液；且

   (b) 培育該水性結晶混合物直至形成該抗體之晶體。 如前述請求項中任一項之結晶方法，其中該水性結晶混 合物之pH值在約pH 3至5之範圍。 如前述請求項中任-項之結晶方法，其中該水性結晶混 合物含有緩衝劑。 如明求項3之結晶方法，其中該緩衝劑包含乙酸鹽缓衝 劑。

   如π求項4之結晶方法，其中該緩衝劑包含乙酸鈉。 如請求項3至5中任一項之結晶方法，其中該水性結晶混 合物中之該緩衝劑濃度為〇 Μ至0.5 Μ。 如别述請求項中任一項之結晶方法，其中該磷酸鹽為磷 酸氫鹽。 8·如凊求項7之結晶方法，其中該磷酸鹽為鹼金屬鹽或至 少兩種不同鹼金屬鹽之混合物。 9·如前述請求項中任一項之結晶方法，其中該結晶混合物 中之該磷酸鹽濃度在約1至6 Μ之範圍。 1〇·如請求項9之結晶方法，其中該結晶混合物中之該鹽濃 度在約1.0至3·0 Μ之範圍。 11 ·如别述4求項中任一項之結晶方法，其中以下之其他結 125704.doc 200835699 晶條件中之至少-者要符合： a) 執行培育_約1小時至約60天； b) 在約4C與約37χ：的溫度下執行培育； C)該抗體濃度在約〇·5至約1〇〇 mg/ml之範圍 其進一步包含乾燥 12·如前述請求項中任 該等晶體之步驟 13 ·如如述請求項中任一曰 項之…日日方法，其進一步包含以不 同緩衝液交換結晶母液之步驟。 14.如前述請求項中任一 曰 θ t、、、口日日方法，其中該批次體積在 約1 ml至20,〇00 R範圍。 、 其係精由如前述請求項中任 其限制條件為該抗體不為英 15· —種抗-hTNFa抗體之晶體 一項之結晶方法獲得。 16· —種抗-hTNFa抗體之晶體 利昔單抗（INFLIXIMAB)。 17. 如#求項15及16中任-項之晶體，其具有針狀形態，其 中最大長度1為約2-500 μηι且l/d比率為約3至3〇。 18. 如請求項15至17中任-項之晶體，其中該抗體為多株抗 體或單株抗體。 19. 如請求項18之晶體，其中該抗體係選自由嵌合抗體、人 類化抗體、非糖基化抗體、人類抗體及小鼠抗體組成之 群。 20·如請求項17或18中任一項之晶體，其中該抗體為1§(}抗 21·如請求項19之晶體’其中該抗體係選自由IgG1、IgG2、 125704.doc 200835699 IgG3及IgG4抗體組成之群。 22.如請求項21之晶體，其中該抗體為IgG1群之抗人類TNFa 抗體。 23 ·如請求項22之晶體，其係由經分離人類抗體製備，其以 均藉由表面電漿共振測定的lx 10·8 Μ或更低之Kd及 lxl〇-3 s·1或更低之心速率常數與hTNFa解離，且在標準 活體外L929檢定中以ixur7 M或更低之1(：5〇中和hTNFa細 胞毒性。 24_如請求項22之晶體，其係由具有下列特徵之經分離人類 抗體製備：a)藉由表面電漿共振測定以lxl〇-3 s·1或更低 之速率常數與人類TNFa解離；b)具有輕鏈CDR3域， 其包含SEQ ID NO·· 3或藉由在位置1、4、5、7或8經單個 丙胺酸取代或精由在位置1、3、4、6、7、8及/或9經1至 5個保守胺基酸取代修飾SEQ ID NO: 3之胺基酸序列；c) 具有重鏈CDR3域，其包含SEQ ID NO: 4或藉由在位置 2、3、4、5、0、8、9、10或11經單個丙胺酸取代或藉 由在位置2、3、4、5、6、8、9、10、11及/或12經1至5 個保守胺基酸取代修飾SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。 25·如請求項22之晶體，其係由經分離人類抗體製備，該經 分離人類抗體具有包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的輕 鏈可變區（LCVR)及包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的重 鏈可變區（HCVR)。 26·如請求項25之晶體，其係由D2E7抗體製備。 27· —種醫藥組合物，其包含：（a)如請求項15至26中任一項 125704.doc 200835699 之抗-hTNFa抗體之晶體，及（b)至少—種醫輯形劑；該 組合物係以固體、半固體或液體調配物形式提供，各調 配物含有呈結晶形式之該抗體。 28. —種醫藥組合物，其包含：（叻如請求項15至26中任一項 之抗-hTNFa抗體之晶體’及（b)至少—種包埋或囊封該抗 體之晶體之醫藥賦形劑。 29. 如請求項26之組合物，其中該組合物具有大於約i mg/ml 之抗體濃度。 30·如請求項27之組合物，其中該組合物具有大於約2〇〇 mg/ml之抗體濃度。 3 1.如請求項26至28中任一項之組合物，其中該賦形劑包含 至少一種聚合型視情況生物可降解之載劑或至少一種油 性或脂質載劑。 32.如請求項29之組合物，其中該聚合型載劑為選自由以下 各物組成之群中的一或多者之聚合物：聚（丙烯酸）、聚 (氰基丙烯酸酯）、聚（胺基酸）、聚（酐）、聚（縮肽）、聚 (酯）、聚（乳酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGA、聚（β-羥 基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二噁酮）、聚（乙二醇）、聚 (羥丙基）甲基丙烯醯胺、聚（有機）磷氮烯、聚（原酸酯）、 聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸酐烷基乙 稀基鍵共聚物、複合多元§1*、白蛋白、海藻酸酿、纖維 素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、玻 糖酸酸、募聽、甘胺基聚糖（glycaminoglycans)、硫酸化 多醣、其摻合物及共聚物。 125704.doc 200835699 3 3 · —種可注射液體組合物’其包含如請求項1 5至2 6中任一 項之抗-hTNFa抗體之晶體，且具有在約1〇至4〇〇 mg/ml 範圍之抗體濃度。 34· —種晶體漿液，其包含如請求項15至26中任一項之抗_ hTNFa抗體之晶體’其具有大於約iQ〇 mg/mi之抗體濃 度。 35. —種用於治療哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投 予有效量之如請求項15至26中任一項之抗-hTNFa抗體之 晶體的步驟。 36· —種用於治療哺乳動物之方法，其包含向該哺乳動物投 予有效畺之如凊求項27至32中任一項之組合物的步驟。 37·如請求項34及35中任一項之方法，其中該組合物係藉由 非經腸途徑、經口途徑或藉由注射投予。 38· —種治療個體中TNFa相關病症之方法，該方法包含投予 /口療有效ϊ之如請求項丨5至26中任一項之抗體之晶體。 39·如明求項37之方法，其中該TNF〇^g關病症係選自由以下 各病症組成之群： 、自體免疫疾病，尤其類風濕性關節炎、類風濕性脊椎 :月關節乂及痛風性關節炎、過敏症、多發性硬化 症:自體免疫糖尿病、自體免疫葡萄膜炎及腎病症候 T，感染性疾病、移植物排斥或移植物對抗宿主疾病、 惡性疾病、肺部病症、腸道病症、心臟病症、發炎性骨 :病】症月再吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴 孓1肝穴、凝血障礙、燒傷、再灌注損傷、瘢痕瘤形 125704.doc 200835699 成、瘢痕組織形成、發熱、牙周疾病、肥胖症及輻射毒 性，脊椎關節病、肺部病症、冠狀動脈病症、代謝障 礙、貧血、疼痛、肝病症、皮膚病症、指甲病症或脈管 炎、白塞氏病（Behcet’s disease)、強直性脊椎炎、哮 %、慢性阻塞性肺病（COPD)、特發性肺纖維化（IPF)、 再狹窄、糖尿病、貧血、疼痛、克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)相關病症、青年類風濕性關節炎（JRA)、c型肝 炎病毒感染、牛皮癣、牛皮癬性關節炎及慢性斑塊牛皮 癖、年齡相關惡病質、阿茲海默氏症（Alzheimer，s disease)、腦水腫、發炎性腦損傷、慢性疲勞症候群、皮 肌炎、藥物反應、脊髓中及/或其周圍水腫、家族性週期 性發熱、費爾提氏症候群（Felty，s syndrome)、纖維化、 絲球體腎炎（例如鏈球菌感染後絲球體腎炎或IgA腎病）、 假肢鬆動、顯微鏡下多血管炎、混合型結締組織病症、 多發性骨髓瘤、癌症及惡病質、多器官病症、骨髓發育 不良症候群、睪丸炎性（orchitism)、骨質溶解、包括急 性、忮性及胰膿腫之胰腺炎、牙周疾病、多發性肌炎、 進行性腎衰竭、假性痛風、壞疽性膿皮病、復發性多軟 骨炎、風濕性心臟病、類肉瘤病、硬化性膽管炎、中 風、胸腹主動脈瘤修復（TA A A)、TNF受體相關週期性症 候群（TRAPS)、與黃熱病疫苗接種有關之症狀、與耳相 關之發炎性疾病、慢性耳部炎症或小兒耳部炎症、葡萄 膜炎、坐骨神經痛、前列腺炎、子宮内膜異位、脈絡膜 新血管生成、狼瘡、修格蘭氏症候群（Sj〇g_，s 125704.doc 200835699 syndrome)及濕性黃斑退化。 40.如請求項15至26中任一項之抗-hTNFa抗體之晶體之用 途，其係用於製備用以治療如請求項38之TNFa相關疾病 之醫藥組合物。 41·如請求項15至26中任一項之抗-hTNFa抗體之晶體，其係 用作藥物。

   125704.doc 200835699 ‘ 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（5 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） . 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 125704.doc