SK5562001A3

SK5562001A3 - Aromatic derivatives and iron complexes thereof for the use as normalising agents of the iron level

Info

Publication number: SK5562001A3
Application number: SK556-2001A
Authority: SK
Inventors: Napoli Guido Di
Original assignee: Medidom Lab
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2001-09-11
Also published as: PL198826B1; CZ20011461A3; PL347940A1; AU756726B2; WO2000026205A1; EP1124814B1; CA2348380C; US6455578B1; IL142813A; DE69904635D1; JP2002528539A; SK286308B6; CZ299542B6; IT1303688B1; DE69904635T2; EP1124814A1; AR021037A1; ATE229947T1; AU1157300A; ITMI982350A1

Description

1

Ty 5$

Aromatické deriváty a ich komplexy so železom ako činidla na normalizáciu hladiny železa

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka aromatických derivátov vzorca I opisovaných v ďalšom a ich komplexov so železom na prípravu farmaceutických kompozícií použiteľných ako činidlá na normalizáciu hladiny železa.

Doterajší stav techniky

Preťaženie organizmu železom v dôsledku väčších porúch v metabolizme železa, ako je genetická hemochromatóza a talasémia, alebo v dôsledku menej významných príčin, ako napríklad transfúzie pri hemolytickej anémii, môže viesť k nadmernej fyziologickej obrannej reakcii a v dôsledku toho mať toxický účinok.

Taký výsledok je spôsobený zväčšením „zásoby voľného železa“ vyvolávajúceho vznik aktívnej formy kyslíka zodpovednej za inaktiváciu bunkových enzýmov, za modifikácie membránových lipidov, za zmeny DNA apod. (E. Cade-nas, Ann. Rev. Biochem., 1989, zv. 58, str. 79-110).

Preto môžu následky zväčšenia „zásoby voľného železa“ siahať od geno-toxicity tohto kovu vedúcej k vývoju nádorov až k rôznym chorobným stavom orgánov, ako je cirhóza, diabetes, kardiopatia, hypogonadizmus a artropatia.

Ku zväčšeniu „zásoby voľného železa“ môže dôjsť aj keď hodnota všetkého železa v organizme nevzrastie, a to v súvislosti s mnohými patologickými stavmi, ako sú napríklad neurodegeneratívne poruchy (M.Gassen a ďalší, Phar-macol. Toxicol., 1997, zv. 80 (4), str. 159-166), ateroskleróza (A.J.Matthews a ďalší, J.Surg.Res., 1997, zv. 73 (1), str. 35-40), ischemická kardiopatia (T.P.Tuomainon a ďalší, Circulation, 1998, zv. 97 (15), str. 1461-1466, chro- 2 nické črevné choroby (R.A.Floyd a ďalší, Dig. Dis. Sci., X. 1996, zv. 41 (10), str. 2078-2086) a môže zaviniť vývoj patobiologického prípadu.

Najnovšie boli zistené priame väzby medzi zmenami metabolizmu železa a infekciami HIV (J.R.Boelaert a ďalší, Infect. Agents Dis. I. 1996, zv. 5 (1), str. 36-46) rovnako ako spojenie medzi kardiotoxicitou vyvolanou železom a metabolizmom antineoplastických činidiel u osôb, ktoré sa podrobili protinádorovej liečbe (G. Minotti a ďalší, J.Clin.Invest., IV. 1995, zv. 95 (4), str. 1595-1605).

Navyše sa dokázalo, že prítomnosť "voľného železa" má rozhodujúcu úlohu v reakciách vedúcich k tvorbe voľných radikálov a k šíreniu škodlivých účinkov pôsobenia voľných radikálov, s ktorými sa spájajú napríklad za ochorenia a-ko je artritída a pyelonefritída (R.Gupta a ďalší, Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1997, zv. 20 (4), str. 299-307) a senescencia (M.C.Corti a ďalší, Am.J.Cardiol., 1997, zv. 79 (2), str. 120-127).

Dnes je známe použitie činidiel tvoriacich cheláty so železom pri liečbe systémového preťaženia železom spojeného s chorobnými stavmi ako je talasé-mia alebo hemochromatóza.

Zlúčeniny používané pri týchto liečbach vykazujú niekoľko závažných nedostatkov. Napríklad desferrioxamín, jedna zo zlúčenín častejšie používaných pri tomto type liečby, viaže okrem železa mnoho iných dôležitých kovov, ako je hliník; je to veľmi drahý výrobok, ktorý nie je možné podávať orálne a má tak krátky polčas, že pri subdermálnej infúzii je nutné nepretržité podávanie (R.J.Rothman a ďalší, Mol.Pharmacol., 1992, zv. 42, str. 703-710). Sú známe ďalšie lieky obsahujúce komplexotvorné činidlá pre železo ako napríklad deferiprón a jeho deriváty, ktoré sa vyznačujú veľkou biologickou do-sažiteľnosťou, ale tiež veľkou toxicitou spôsobenou práve ich biologickou dosa-žiteľnosťou, ktorá vedie k vypuknutiu chorôb, ako je napríklad agranulocytémia, epatická fibróza apod. (N.F.Olivieri a ďalší, N.Engl.J.Med., 1998, zv. 339 (7), str. 417-423). 3

Okrem toho dosiaľ používané lieky majú dramatický účinok na bunkový metabolizmus železa, ktorý uvádzajú do hlbokej nerovnováhy; sťahujú totiž značné množstvá kovu z miest, v ktorých sú v organizme deponované, a preto ich nie je možné podávať ani v prekox fázach ani v rámci profyláxie pri hemo-chromatóze alebo talasémii, ani v podmienkach, v ktorých by sa malo čeliť zväčšenie hotovosti voľného železa, aby sa zabránilo kolísaniu množstvá funkčného železa alebo železa uloženého v depozitoch.

Preto sa hlboko pociťuje potreba nových zlúčenín vhodných na prípravu farmaceutických kompozícii schopných pôsobiť ako chelatotvorné činidlá pre všetko železo rovnako ako pre hotovosť voľného železa, odstraňovať ich z buniek a eliminovať výsledný komplex v moči.

Podobne so pociťuje potreba nových farmaceutických kompozícii pre liečbu chorôb, spojených s nedostatkom železa v organizmu.

Podstata vynálezu

Prihlasovateľ s prekvapením zistil, že aromatické deriváty vzorca I:

kde

R3 O 1 11

Ri je — CH — C — CH2— R4, pričom význam R3 a R4 je zvolený z H a OH, za predpokladu, že R3 a R4 nie sú súčasne H, a R2 je H, alebo 4 OH Rs

I I

Ri a R2 tvorí dohromady — C = C —, pričom význam Rs je zvolený z CH3 a (CH2)sOH, sú schopné stabilne viazať železo, zvlášť Fe(III).

Uvedené zlúčeniny vzorca I sú vhodné na prípravu farmaceutických kompozícii na perorálnu aplikáciu a vykazujú vysokú absorpciu a vysokú schopnosť prenikať biologickými membránami vo forme voľných ligandov aj ako komplexy so železom.

Uvedené farmaceutické kompozície sú preto použiteľné pri liečbe všetkých patologických stavov vzniknutých preťažením železom, pri náraste celkového železa rovnako ako v prípade relatívneho vzrastu koncentrácie železa v dôsledku vzrastu hotovosti voľného železa.

Komplexy zlúčenín vzorca I so železom sa tiež môžu použiť pri príprave farmaceutických kompozícii použiteľných pri liečbe chorôb spojených s deficitom železa, a to v akútnej fázy rovnako ako pri chronickom ochorení.

Preto sú jedným z cieľov tohto vynálezu zlúčeniny vzorca I na prípravu farmaceutických kompozícii na použitie zvlášť ako cheiatotvorné činidla pre železo a ich komplexy použiteľné ako činidlá na uvoľňovanie železa pri hypoferé-mii. Ďalším cieľom tohto vynálezu sú zlúčeniny vzorca I kde

R3 O

I II

Ri je — CH — C — CH2 — R4, pričom R3 je OH a R4 je H, OH a R2 je H; OH Rs

I I alebo Ri a R2 tvoria dohromady — C = C — , pričom Rs je (CH2)sOH. 5

Znaky a prednosti zlúčenín podľa vzorca I ako chelatotvorných činidiel pre železo a komplexov železa podľa tohto vynálezu so podrobne opíšu v nasledujúcom opise.

Tento vynález sa týka zlúčenín s vzorcom I uvedeným vyššie na prípravu farmaceutických zlúčenín, zvlášť farmaceutických zlúčenín použiteľných ako chelatotvorné činidlá železa. Komplexy zlúčenín podľa tohto vzorca I majú tiež terapeutické použitie ako činidlá na uvoľňovanie železa.

Zlúčeniny podľa vzorca I, ktoré je možné ľahko pripraviť spôsobmi známymi v odbore, vykazujú vysokú afinitu k železu, zvlášť pre Fe(III), a vytvárajú stabilné komplexy s týmto kovom pri rôznych pomeroch kov/ligand.

Pokiaľ de o prípravu uvedených komplexov, typicky sa pripravujú reakciou zlúčeniny vzorca I s (FelII) iónmi zo železitých solí zvolených zo skupiny pozostávajúcej z anorganických solí Fe(III), najmä chloristanu, chloridu a síranu, ale zvlášť chloristanu. Táto reakcia sa uskutočňuje v rozpúšťadle vybranom zo skupiny, ktorú tvorí acetón, chloroform, dichlórmetán a vodné roztoky obsahujúce 5 až 10 % dimetylsulfoxidu, výhodne v acetóne.

So zlúčeninami vzorca I, kde OH Rs

I I

Ri a R2 tvoria dohromady — C = C — , pričom Rj je zvolené z CH3 a (ΟΗ2)ΟΗ, boli vykonávané experimenty s chelatáciou železa a zistilo sa, že vytvárajú komplex s Fe(IlI) pri molárnom pomere ligand/kov 2 : 1.

Príprava tohto komplexu sa výhodne vykonáva pri teplote miestnosti reakciou zlúčeniny vzorca I s chloristanom železitým v acetóne.

Konštanta stability komplexu trojmocného železa so zlúčeninou vzorca I, kde 6 OH Rs

I I

Ri a R2 tvoria dohromady — C = C — , kde Rj je CH3, sa merala voltametricky s Pt elektródou ako indikačnou elektródou a s kalomelovou elektródou ako referenčnou elektródou a získala sa hodnota konštanty stability 3,0 x 1010.

Podobné skúšky s chelatáciou a s meraním konštánt stability týchto komplexov sa vykonávali s inými zlúčeninami vzorca I a získali sa podobné výsledky.

Schopnosť zlúčenín podľa vzorca I a ich komplexov so železom prenikať biologickými membránami sa zisťovala testmi medzifázového rozdelenia medzi n-oktanolom a vodným roztokom uvedených zlúčenín, ktoré preukázali ich väčšiu afinitu k organickým rozpúšťadlám.

Testy medzifázového rozdelenia sa najmä vykonávali medzi n-oktanolom a vodným roztokom 20 mM tris(hydroxymetyl)aminometánhydrochloridu, upraveným na pH 7,4 prídavkom fosforečnanu sodného, a získali sa hodnoty rozdeľo-vacieho koeficientu vyjadrené ako pomer medzi koncentráciou zlúčeniny v organickej fázy a koncentráciou vo vodnej fázy, ktorý mal pre tieto zlúčeniny podľa vzorca I rovnako ako pre ich komplexy s Fe (III) typicky hodnotu vyššiu než 20.

Zlúčeniny podľa vzorca I a ich komplexy so železom podľa tohto vynálezu sa môžu formulovať s farmaceutický prijateľnými excipientami a/alebo riedidlami s cieľom pripraviť farmaceutické kompozície na liečbu chorôb charakterizovaných preťažením železom alebo naopak deficitom železa v ľudskom organizme.

Ako riedidlo sa napríklad môže použiť dimetylsulfoxid a príklady možných prísad sú metylcelulóza, β-cyklodextríny a polyetylénglykol.

Koncentrácia zlúčeniny podľa tohto vzorca I alebo zodpovedajúcich komplexov so železom vo farmaceutických kompozíciách je v rozmedzí 0,4 až 0,8 % hmotnostných z celkovej hmotnosti kompozície

Uvedené kompozície obsahujúce zlúčeniny podľa vzorca I sú účinné ako chelatotvorné činidla pre železo pri liečbe systémového preťaženia železom, ako 7 je tomu v prípade taiasémie a hemochromatózy, rovnako ako pri liečbe rastu zásoby voľného železa.

Farmaceutické kompozície obsahujúce zlúčeniny podľa vzorca I podľa tohto vynálezu sú preto použiteľné pri liečbe niektorých chorôb ktoré súvisia s preťažením organizmu železom ako je hemochromatóza, talasémia, anémia spojená s preťažením železom a stavy spojené so sekundárnou siderózou, neurode-generatívne ochorenie ako je Parkinsonova alebo Alzheimerova choroba, ischemická kardiopatia, chronické zápalové ochorenia ako je artritída, pyelonefritída a chronické zápalové črevné choroby, zmeny metabolizmu železa spojené s infekciami HIV, kardiotoxicita spôsobená doxorubicínom a antracyklínmi, ateros-kleróza a stárnutie.

Farmaceutické kompozície obsahujúce komplexy zlúčenín podľa vzorca I so železom sú použiteľné pri liečbe chorôb, spojených s deficitom železa v organizme vrátane sideropenickej anémie v akútnej fázy aj v chronickej forme.

Nasledujúce príklady sú nelimitujúcimi ilustráciami tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu PRÍKLAD 1

Príprava 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu (Zlúčenina vzorca I v ktorej Ri a R2 tvoria OH Rs

I I dohromady — C = C — , pričom R5 je CH3.) 2-hydroxyacetofenón (20 g) sa rozpustí v etylacetáte (200 ml). V priebehu 15 až 20 minút sa postupne pridáva práškový sodík (16 g) rýchlosťou umožňujúcou primeraný reflux. Zmes sa zahrieva pod spätným chladičom 1 hodinu, potom sa ochladí. Potom sa pridá drtený ľad (200 g) do vyzrážania sodnej soli acetyla-cetofenónu, ktorá sa potom oddelí vákuovou filtráciou. Pevný produkt sa potom δ kryštalizuje z 40% kyseliny octovej (200 ml), čím sa získa acetylacetofenón (19,6 g) ako práškové kryštály (teplota topenia 95 °C, výťažok 75 %). K takto získanému acetylacetofenónu (15 g) sa pridá koncentrovaná kyselina sírová (30 g). Po ochladení na teplotu miestnosti sa pridáva voda do vyzrážania bieleho prášku, ktorý sa izoluje vákuovou filtráciou a premyje studenou vodou. Získa sa 2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (10 g) s teplotou topenia 71 °C pri výťažku 74 %. V benzéne (15 ml) so vo vhodnej hydrogenačnej banke suspenduje Pd na CaC03 (1,6 g). K aktivácii katalyzátoru dochádza absorpciou H2 pri izbovej teplote, potom sa pridá 2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (1,6 g) rozpustený v benzénu (15 ml). Katalyzátor sa ponechá, aby absorboval asi 200 ml H2 pri tlaku a teplote miestnosti. Po filtrácii a odparení benzénu sa získa bledožltá olejovitá kvapalina, ku ktorej sa pridá malý objem zmesi petroléter/etyléter v pomere 1:1. Získaný roztok sa prečistí chromatograficky v kolóne naplnenej silikagélom (600 až 200 mesh) s vyššie uvedenou zmesou ako eluentom. Získa sa 0,9 g prečisteného a vysušeného produktu (výťažok 60 %); uvedený produkt je bezfarebný o-lej zlúčeniny 2,3-dihydro-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón. 2,3-dihydro-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (1,62 g) sa rozpustí v 95% etanole (50 ml) a roztok sa za miešania refluxuje. V priebehu 10 až 15 minút sa po kvapkách pridá izoamylnit-rit (8 ml) a koncentrovaná HC1 (40 ml). Zahrievanie a miešanie sa zastaví a výsledná zmes sa nechá 2 hodiny stáť. Potom sa pridáva voda (200 ml) do vyzrážania bielej pevnej látky. Rozpúšťadlo sa odparí a získa sa pevný produkt, ktorý sa rozpustí v malom objeme chloroformu a prečistí na silikagély v rovnováhe s tým istým rozpúšťadlom. Prečistený produkt obsahuje nízke percento žltých nečistôt, ktoré sa úplne odstránia rekryštalizáciou z acetónu. Potom sa oddelia zvyšky rozpúšťadla a získa sa 0,97 g 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu ako bezfarebné kryštály s teplotou topenia 179-180 °C; IR: 1632, 1666 e 3301 cm'1; výťažok = 51 %.) 9 PRÍKLAD 2

Príprava 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu (Zlúčenina vzorca I, OH Rs

I I v ktorej Ri a R2 tvoria dohromady — C = C — , pričom R5 je (CH2)sOH)

Do reaktoru sa uvedie 2-hydroxyacetofenón (13,6 g) a toluén (200 ml). Postupne sa za miešania pridáva hrubo zrnný sodík (4,4 g) tak aby sa udržal mierny reflux. Po ukončení reakcie so pridá etyl-6-hydroxykapronát (28 g) a zmes sa nechá za miešania reagovať pri miernom refluxe 2 hodiny; vznik produktu sa kontroluje chromatografiou TLC so zmesou dietyléter/petroléter 9:1. Po ochladení sa vykoná vákuová filtrácia a pevný produkt sa premyje dietyléte-rom.

Potom sa pevný produkt opäť rozpustí v 40% kyseline octovej (100 ml) a k takto získanému roztoku sa postupne pridáva NaHCOs do neutrálnej reakcie. Potom sa roztok vleje do separačnej nálevky a vykonajú sa tri extrakcie dietylé-terom (každá s 100 ml rozpúšťadla). Fáza obsiahnutá v étery zo všetkých extrakcií sa spojí a vysuší prídavkom bezvodého Na2S04; po pridaní vysúšadla sa suspenzia S minút mieša a potom sa filtruje. Rozpúšťadlo sa odparí a získa sa olej, ktorý sa chromatograficky prečistí na silikagély s elučným činidlom dietyléter/petroléter v pomere 9:1. Získa sa l-(2-hydroxyfenyl)-l,3-[3-(5-hydroxypentyl)]butandión (8 g). K získanému produktu (8 g) sa pridá 96% H2S04 (16 g) a zmes sa nechá niekoľko minút za miešania reagovať Po ochladení na izbovú teplotu sa pridá voda, potom sa postupne pridáva NaHCOs za účelom neutralizácie kyseliny sírovej. Nasledujú tri extrakcie dietyléterom (150 ml). Výsledné tri fázy obsiahnuté v étery sa spoja a vysušia pridaním Na2S04. Po filtrácii a odparení rozpúšťadla sa získa olej, ktorý je v ďalšom chromatograficky prečistený v kolóne obsahujúcej silikagél so zmesou etyléter/acetón v pomere 80 : 20 ako eluentom. Získa sa 0,74 g 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu. 10

Vo vhodnej hydrogenačnej banke sa suspenduje Pd na CaC03 v benzéne; katalyzátor sa ponechá, aby absorboval H2 pri izbovej teplote a tlaku. Keď katalyzátor prestane absorbovať H2, pridá sa 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón (0,74 g) rozpustený v benzéne a vykoná sa hydrogenácia; pri teplote a tlaku miestnosti sa absorbuje asi 100 ml H2. Po asi 24 hodinách sa vykoná filtrácia a odparí sa benzén, čím sa získa olej, ku ktorému sa pridá malé množstvo dietyléteru. Prečistenie tohto produktu sa vykoná chromatograficky na silikagély s dietyléterom ako elučným činidlom. Získa sa 0,23 g 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu. 0,23 g 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu sa rozpustí v 95% etanole (5 ml) a roztok sa zahrieva pod spätným chladičom za miešania. Potom sa po kvapkách pridajú HC1 (6,2 ml) a izoamylnitrid (1,2 ml). Potom sa miešanie a zahrievanie zastaví a reakčná zmes sa nechá stáť asi 1 hodinu. Rozpúšťadlo sa odparí, pridá sa voda a produkt sa extrahuje dietyléterom. Frakcia obsiahnutá v étery sa suší prídavkom bezvodého Na2S04. Po filtrácii a odparení rozpúšťadla sa získa olej, ktorý sa chromatograficky prečistí na silikagély so zmesou dietyléter/metanol v pomere 98:2 ako eluentom. Získa sa 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón (99,2 mg). Produkt v kryštalickej forme sa získa kryštalizáciou v cyklohexáne alebo dietylétery (teplota topenia 111-112 °C). PRÍKLAD 3

Príprava 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyI)-4H-l-benzopyran-4-ónu (Zlúčenina vzorca I, v ktorej Rt a R2 tvoria dohromady OH Rs

I I — C = C — , pričom R5 je (CH2)sOH)

Etyl-6-hydroxykapronát (100 mmol) sa za miešania rozpustí v 3,4-dihydropyráne (120 mmol); potom sa pridá p-toluénsulfónová kyselina (15 mg) a zmes sa pri teplote miestnosti nechá reagovať asi 1 hodinu. Koniec reakcie sa o- 11 verí chromatografiou TLC na silikagély so zmesou petroléter/diethyléter v pomere 1:1 ako eluentom s použitím jódových pár na detekciu. Po ukončení reakcie sa pridá zásaditý vodný roztok uhličitanu sodného a opatrne mieša. Produkt získaný v kvantitatívnom výťažku sa extrahuje dietyléterom.

Toluén (15 ml) vydestilovaný na sodíku sa naleje na granulovaný sodík (300 mmol) a zahrieva sa do refluxu. Po dosiahnutí refluxu sa ukončí zahrievanie a pridá sa po kvapkách v priebehu 90 až 120 minút etyl-6-hydroxykapronát (200 mmol), s hydroxylovou skupinou stále chránenou, získaný ako vyššie opísané, spoločne s 2-hydroxyacetofenónom (100 mmol) v toluéne (15 ml). Zmes sa nechá reagovať 4 až 5 hodín a koniec reakcie sa kontroluje chromatografiou TLC na silikagély so zmesou petroléter/dietyléter v pomere 1:1 ako eluentom.

Po ukončení reakcie sa pridá etanol na odstránenie nadbytku sodíka, potom sa pridá 100 ml 7,5% octovej kyseliny tak aby pH malo hodnotu asi 10.

Kondenzačný produkt s dosiaľ chránenou hydroxylovou skupinou sa trikrát extrahuje dietyléterom a dvakrát etylacetátom, čím sa získa produkt v 60% výťažku.

Takto získaný produkt rozpustený v octovej kyseline (2 ml) sa umiestni v reaktore ponorenom v olejovom kúpeli, načo sa jeho teplota asi 1 hodinu udržuje na 130 °C. Najskôr prebieha destilácia azeotropnej zmesi voda/octová kyselina, načo sa nasadí vákuové čerpadlo na intenzívnejšie oddestilovanie zvyšujúcej kyseliny octovej.

Cyklizácia sa overuje chromatografiou TLC na silikagély s dietyléterom a-ko eluentom. Na konci cyklizácie sa pridá zmes kyselina octová/voda v pomere 4:1 (50 ml) a teplota sa zvýši na 50 °C. Reakčná zmes sa udržuje na teplote 50 °C za miešania až do úplného odstránenia chrániacej skupiny a získa sa 2-(5-hydroxypentyl)-benzopyran-4-ón Vznik tohto produktu sa overí chromatografiou TLC na silikagély s dietyléterom obsahujúcim 2 % metanolu ako elučným činidlom. 12 Získaný produkt sa extrahuje dietyléterom po pridaní vody, potom sa odparí rozpúšťadlo a produkt sa prečistí stĺpcovou chromatografíou s dietyléterom obsahujúcim 2 % metanolu ako eluentom, čím sa získa čistý 2-(5- hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón v 50% výťažku. 5% Pd na uhličitane vápenatom (1 g) sa vloží do 20 ml etanolu a hydroge-nuje. Akonáhle katalyzátor prestane absorbovať H2, pridá sa roztok pripravený rozpustením 2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzpyran-4-ónu (4 g), získaného vyššie uvedeným spôsobom, v etanole (40 ml) a vykoná sa hydrogenácia. Zmes sa nechá reagovať 4 až 5 hodín, potom sa vykoná filtrácia; reakčný produkt sa vysuší a znovu rozpustí v minimálnom množstve dietyléteru za účelom chromatografické-ho prečistenia na silikagély s dietyléterom ako eluentom. Takto sa získa 2,3-dihydro-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón v 50% výťažku.

Takto získaný produkt (1 mmol) sa rozpustí v 95% etanole (5 ml) a roztok sa refluxuje za miešania. K tomuto roztoku sa po kvapkách pridajú HC1 (6,5 ml) a izoamylnitrit (1,2 ml). Potom sa zastaví zahrievanie a miešanie a reakčná zmes sa nechá 1 hodinu stáť. Rozpúšťadlo sa odparí, pridá sa voda a vykoná sa extrakcia dietyléterom; fáza obsiahnutá v étery sa vysuší pridaním bezvodého Na2S04. Filtráciou a odparením rozpúšťadla sa získa 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón vo výťažku 25 %. Tento produkt sa potom chromatograficky prečistí v kolóne so silikagélom so zmesou dietyléter/metanol v pomere 98:2 ako eluentom a tým sa získa čistý 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón (fluoreskujúci na svetle s λ = 360 nm; *H-NMR (CDCI3, 200 MHz) δ od 1,5 do 1,88 ppm (multiplet), 2,5 ppm (triplet), 3,6 ppm (triplet), od 7,35 do 8,25 ppm (aromatický H); MS m/e 248 M*). PRÍKLAD 4

Príprava komplexu 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu s Fe(III) 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (7 mg; 0,04 mmol), pripravený ako je opísané v príklade 1, sa rozpustí v acetóne (5 ml); k tomuto roztoku sa 13 pri teplote miestnosti pridá chloristan železitý (7 mg, 0,02 mmol) a tým dôjde ku kvantitatívnej tvorbe komplexu chelatotvorné činidlo : Fe(III) v pomere 2:1. Odparením acetónu sa komplex izoluje ako tmavo červený práškovitý zvyšok, ktorý sa určí hmotnostnou spektroskopiou.

Kinetika tvorby komplexu sa ďalej študovala cyklickou voltametriou s Pd elektródou ako indikačnou elektródou a kalomelovou elektródou ako referenčnou elektródou v nasledujúcich podmienkach : chloristan železitý (7 mg) sa rozpustí v 20 ml 150 mM roztoku NaCl obsahujúceho 5 % DMSO a tento roztok sa vloží do voltametrickej komory s grafickým záznamom; zo získaného diagramu sa odvodí polvlnový potenciál železitej soli: (Ei/2)s Fe3+/Fe2+ = 0,420 V. 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón (10,5 mg) sa rozpustí v DMSO (3 ml) a takto získaný roztok sa štyrikrát pridá do voltametrickej komory a po každom prídavku sa zaznamená graf cyklickej voltametrie. Po prvom pridaní dávky 0,5 ml sa zaznamená diagram, z ktorého sa získa polvlnový potenciál komplexu: ((Ei/2)s Fe3+/Fe2+ = 0,120 V. Potom sa postupne pridá 0,5 ml (druhý prídavok), 1 ml (tretí prídavok) a 1 ml (štvrtý prídavok) roztoku chelatotvorné-ho činidla v DMSO. Po treťom prídavku zmizne oxidačná vlna Fe3+/Fe2+, čím sa dokazuje, že po dosiahnutí molárneho pomeru chelatotvorné činidlo/kov 2:1 už v roztoku nie je žiadne voľné železo.

Konštanta stability komplexu sa vypočíta podľa nasledujúceho vzorca: 0,059 0,059 (E 1/2)s - (Ei/2)c--log β +-p log c n n kde (E!/2)s a (Ei/2)c sú polvlnový potenciál soli respektíve vyššie spomínaného komplexu, n je počet elektrónov, β je konštanta stability komplexu, c je jeho koncentrácia a p je počet molekúl chelatotvorného činidla v komplexe. Takto vypočítaná konštanta stability je 3,0 x 1010. 14 PRÍKLAD 5

Príprava komplexu 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu s Fe(III)

Komplex 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu s Fe(III), získaný ako v príklade 3, sa pripravuje obdobným spôsobom ako je opísaný v príklade 4 (MS m/e 549 M*. Svedčí to o tvorbe neutrálneho komplexu s pomerom chelatotvorné činídlo/Fe(III) 2:1, v ktorom sú tri zo štyroch oxyhyd-rylových skupín chelatačného činidla v komplexe depretonované. PRÍKLAD 6

Test medzifázového rozdelenia 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu so železom

Pre 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón a jeho komplex s Fe(III) sa stanovil spektrofotometricky a pri teplote miestnosti rozdeľovači koeficient medzi n-oktanolom a vodným roztokom 20 mM tris(hydroxymetyl)aminometánu s pH upraveným na 7,4 fosforečnanom sodným. 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón získaný ako je uvedené v príklade 1 vo vodnom roztoku sa rozpustil v množstve potrebnom na dosiahnutie koncentrácie 10'4M. 5 ml uvedeného roztoku sa odstreďovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniknuté dve fázy sa oddelili na spektrofotometrické stanovenie koncentrácie v každej z nich. Výsledný rozdeľovači koeficient, vyjadrený ako pomer medzi koncentráciou zlúčeniny v n-oktanole a jej koncentráciou vo vodnom roztoku, bol 24. Vo vyššie uvedenom vodnom roztoku (v množstve potrebnom na dosiahnutie koncentrácie 2x1 O*4 M) sa rozpustil komplex s Fe(III) získaný v príklade 4. 5 ml u-vedeného roztoku sa odstreďovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniknuté dve fázy sa oddelili na spektrofotometrické stanovenie koncentrácie v každej z nich. Rozdeľovači koeficient bol 25. 15 PRÍKLAD 7

Rozdeľovacie charakteristiky 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu so železom

Spôsobom opísaným v príklade 6 sa stanovili spektrofotometricky a pri teplote miestnosti rozdeľovacie údaje pre 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón pripravený ako v príklade 3 a pre jeho komplex s Fe(III) pripravený ako v príklade 5 medzi n-oktanolom a vodným roztokom 20 mM tris(hydroxymetyl)aminometánhydrochloridu s pH upraveným na 7,4 fosforečnanom sodným.

Vo vodnom roztoku sa rozpustil 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyI)-4H-l-benzopyran-4-ón pripravený ako v príklade 3 tak, aby výsledná koncentrácia bola 100 mM. 5 ml uvedeného roztoku sa odstreďovalo s 5 ml n-oktanolu a vzniknuté dve fázy, vodná a organická, sa oddelili na spektrofotometrické stanovenie koncentrácie v každej z nich.

Ten istý pokus sa opakoval rozpustením vo vyššie opísanom vodnom roztoku komplexu pripraveného v príklade 5 s Fe(III). V obidvoch prípadoch zlúčenina kvantitatívne prechádza do alkoholovej fázy. PRÍKLAD 8

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu s Fe(III) do erytrocytov in vitro

Roztoky 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu pripravené ako uvedené v príklade 1 a jeho komplex s Fe(III) získaný v acetóne ako v príklade 4 sa použili na odoberanie vhodných vzoriek do inkubačnej banky. V prípade komplexu sa odparil acetón a ku zvyšku sa potom pridali biologické vzorky. Celá krv krysy zbavená leukocytov alebo alternatívne erytrocytov, premytá a resuspendo-vaná v 127 mM 50% pufru fosforečnanu sodného (pH = 7,4) a obsahujúca 23 16 mM NaCl, sa pridala do inkubačných baniek a pri 37 °C sa inkubovala 15 respektíve 30 minút.

Potom sa erytrocyty oddelili odstredením a oddelene extrahovali spoločne so supernatantnou frakciou 2 objemami etylacetátu. Príslušné množstvá skúšaných látok sa merali spektrofotometricky v etylacetáte a porovnali s vhodnými štandardami. Po 30 minútach inkubácie sa 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón a jeho komplex s Fe(III) našiel v erytrocytoch v množstve 51 % a vo vodnom prostredí v množstve 49 %. Po 30 minútach inkubácie sa 50 % usadených e-rytrocytov resuspendovalo v ich čerstvej plazme a zvyšných 50 % v čerstvom pufry.

Po ďalších 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón a jeho komplex zhodne distribuovali v erytrocytoch vopred preťažených železom a vo vodnom médiu v ktorom boli resuspendované, čím sa dokázalo, že tieto zlúčeniny sú distribuované prakticky zhodne v intracelulárnom ako v extracelulárnom prostredí, a že pokiaľ ide o erytrocyty, rovnováha sa docieľuje približne za 30 minút. PRÍKLAD 9

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu s Fe(III) do erytrocytov in vitro

Erytrocyty krýs sa oddelili od ich plazmy zbavenej leukocytov. Časť erytrocytov sa resuspendovala v 50% pufry fosforečnanu sodného (pH=7,4) a druhá časť erytrocytov sa spojila s časťou ich plazmy tak, aby sa získal 50% hematok-rit. K obidvom suspenziám sa alternatívne pridalo 100 mg/1 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu pripraveného ako v príklade 3 a 50 mg/1 jeho komplexu pripraveného ako v príklade 5, načo nasledovala inkubácia pri 37 °C. Po 30 minútach sa erytrocyty oddelili odstredením a oddelene extrahovali spoločne so supernatantnou frakciou etylacetátom. Množstvo skúšanej látky sa meralo spektrofotometriou v etylacetáte a porovnávalo s vhodnými štandardami. 17

Po 30 minútach inkubácie sa 40 % 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu rovnako ako jeho komplexu s železitým iónom našlo v erytrocytoch a zvyšných 60 % v médiu predstavovanom plazmou. Keď bol médiom fosfátový pufer, bolo nájdené v erytrocytoch 60 % skúšaných zlúčenín a zvyšných 40 % v médiu.

Po sedimentácii sa 50 % erytrocytov obsahujúcich skúšané zlúčeniny re-suspendovalo v ich plazme a zvyšujúcich 50 % v čerstvom pufry. Po ďalších 30 minútach inkubácie pri 37 °C sa 60 % 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu a jeho komplexu našlo v plazme a zvyšných 40 % vo vodnom médiu obsahujúcom fosfátový pufer. Z toho plynie, že chelatotvorné činidlo rovnako ako príslušný komplex s trojmocným železom prenikajú bunkovými membránami obidvoma smermi a sú rovnomerne distribuované v intracelulárnom aj extracelulárnom prostredí. PRÍKLAD 10

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu do erytrocytov krýs in vivo

Skúšky sa vykonávali s krysími samcami Sprague-Dawley hmotnosti 250 až 300 g.

Chelatotvorné činidlo 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón pripravené ako uvedené v príklade 1 s 4 dielmi β-cyklodextrínu vo funkcii vehikula na jeden diel chelatotvorného činidla sa podáva krysám v jedinej orálnej dávke obsahujúcej 20 mg chelatotvorného činidla na kg telesnej hmotnosti. Prítomnosť chelatotvorného činidla v krysách sa spektrofotometricky a fluórimetricky vyhodnocuje v pravidelných časových odstupoch po 1/2 hodine, 1 hodine, 4 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách od okamihu podania: 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ón sa v erytrocytoch v mozgu a v pečeni nachádza už za hodinu a maximum vykazuje za Štyri hodiny a v moči začiatkom dvadsiatou štvrtou hodinou. 18 PRÍKLAD 11

Skúšky prenikania 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-I-benzopyran-4-ónu do erytrocytov krýs in vivo

Chelatotvorné činidlo 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ón pripravené ako uvedené v príklade 3 sa podáva krysám v jedinej orálnej dávke obsahujúcej 2 % metylcelulózy a 20 mg chelatotvorného činidla na kg telesnej hmotnosti. Prítomnosť 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu sa zisťovala v moči po 12 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách po podaní. Keď sa 20 mg 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu na kilogram telesnej hmotnosti podávalo v DMSO intraperitoneálne, bola jeho prítomnosť v plazme a erytrocytoch pozorovaná po 15, 30 a 60 minútach po liečbe. V tabuľkách 1 a 2 sú uvedené výsledky kvalitatívnej detekcie 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu, resp. 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu v krysom tkanive a jeho vylučovanie.

Tabuľka 1. Kvalitatívna detekcia 3-hydroxy-2-metyl-4H-l-benzopyran-4-ónu v krysom tkanive a jeho vylučovanie doba po podaní plazma erytrocyty pečeň mozog moč stolica " h _^(+) P(+) n n n n 1 h p(++) p(++) p(+) n n 4 h P(++) p(+++) P(+++l p(++) _ P(+) n 24 h n n j(++> D(++) p(++) n 48 h n n n n p(+++) n

Tabuľka 2. Kvalitatívna detekcia 3-hydroxy-2-(5-hydroxypentyl)-4H-l-benzopyran-4-ónu v krysom tkanive a jeho vylučovanie ·· ·· ·· MM · ···· · · I · • · » * · · ·Μ · • ······ · ··· • · t t · · · M ·· ·· ··· · 19 doba po podaní plazma erytrocyty pečeň mozog moč stolica Ľ h P(+) P(+) n n n n " h P(++) P(++) n n n n 1 h P(++) p(+++) P(+) n n n 4 h p(+++) p(+++) p(++) n n n 12 h n n P(++) p(+) p(+) n 24 h n n p(+++) p(+) p(+++) n 48 h n n n n p(+++) n p prítomný n neprítomný + semikvantitatívna hodnota

Claims

20 ·· ·· • · · · • · · t • · ··· · • · · ·· ·· t ·· ·· ···· • · • ··· • · ♦ • · ···

PATENTOVÉ NÁROKY Ty ssb-ieoj 1. Farmaceutické kompozície, vyznačujúce sa tým, že zahrnujú ako účinnú zložku aspoň jednu zlúčeninu vzorca I O

v ktorom: R3 O I II Ri je — CH — C — CH2 — R4, pričom R3 a R4 je vybrané z H a OH, za predpokladu, že R3 a R4 nie sú súčasne H, a R2 je H, alebo OH Rs I I Ri a R2 tvoria dohromady — C = C —, pričom Rs je zvolené z CH3 a (CH2)5OH, alebo jej komplex so železom.
2. Farmaceutické kompozície, vyznačujúce sa tým, že zahrnujú ako účinnú zložku komplex železa a zlúčeniny vzorca I, kde Rs je CH3.
3. Farmaceutické kompozície podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že ďalej zahrnujú farmaceutický prijateľné excipienty a/alebo riedidla. 21 ·· ·· ·· ···· ·· • • ♦ · · • • • · ·· • • 1 t t • 1·· • · • • ··· · · • • • · · ·· ·· ·· ··· ·· ··
4. Použitie zlúčenín vzorca I

v ktorom: R3 O I II Ri je — CH — C — CH2 — R4, pričom R3 a R4 je zvolené z H a OH, za predpokladu, že R3 a R4 nie sú súčasne H, a R2 je H, alebo OH Rs I I Ri a R2 tvoria dohromady — C = C — , pričom R3 je zvolené z CH3 a (CH2)5OH, na prípravu farmaceutických kompozícii vhodných na liečbu stavov, s ktorými je spojené preťaženie železom.
5. Použitie podľa nároku 4, kde stavy, s ktorými je spojené preťaženie železom, zahrnujú hemochromatózu, talasémiu, anémiu spojenú s preťažením železom a stavy spojené so sekundárnou siderózou, neurodegeneratívne o-chorenia, zahrnujúce Parkinsonovu a Alzheimerovu chorobu, ischemickú kardiopatiu, zápalové ochorenie zahrnujúce artritídu, pyelonefritídu a chronické zápalové črevné choroby, zmeny metabolizmu železa spojené s infekciami HIV, kardiotoxicitu spôsobenú doxorubicínom a antracyklínmi, aterosklerózu a stárnutie.
6. Komplexy zlúčenín vzorca I podľa nároku 4 so železom. 22 ·· • · · · • · f · 9 9 999 9 9 9 9 99 99 ·· Mll • · · • · ··· • · · • · · ·· ··· 9 9 9 9 9 9 9
7. Komplexy so železom podľa nároku 6, kde molárny pomer zlúčeniny vzorca I a železa je 2:1.
8. Komplexy so železom podľa nárokov 6 a 7, kde železo je Fe(III).
9. Použitie komplexov so železom podľa nárokov 6 až 8 na prípravu farmaceutických kompozícii, vhodných na liečbu stavov, s ktorými je spojený nedostatok železa.
10. Použitie podľa nároku 9, kde stavy, s ktorými je spojený nedostatok železa, zahrnujú sideropenickú anémiu v akútnej fázy a chronickú siderope-nickú anémiu.
11. Zlúčeniny vzorca I O

R3 O I II Ri je — CH — C — CH2 — R4, pričom R3 je OH a R4 je H, OH; a R2 je H, alebo 23 ·· ·· ·· ···· ·· • • • · • • • • • ·· • • t t • • ··· • • • • ··· · • • • • · • ·· ·· ·· ··· ·· ·· OH Rs I I Ri a R2 tvoria dohromady — C = C — , pričom R5 je (C^jsOH). * f