KR20090098677A

KR20090098677A - 폐암특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 검출방법

Info

Publication number: KR20090098677A
Application number: KR1020090013674A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 문영호; 오태정
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2009-09-17
Anticipated expiration: 2029-02-19
Also published as: EP2253714B1; WO2009113771A1; CN101970692B; EP2253714A4; JP5394409B2; US20110027796A1; EP2253714A1; CN104232763B; CN101970692A; CN104232763A; JP2011515081A; US9850540B2; KR101106727B1

Abstract

본 발명은 폐암 특이적인 바이오마커를 이용한 폐암의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 폐암 형질전환 세포에서 5'UTR 또는 엑손 1 부위가 특이적으로 메틸화되는 PCDHGA12 유전자의 메틸화를 확인할 수 폐암 진단용 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 폐암 및 그 진행단계의 검출방법에 관한 것이다.

폐암, 바이오마커, PCDHGA12, 메틸화

Description

폐암특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 검출방법{Method for Detecting Lung Cancer Using Lung Cancer Specific Methylated Marker Gene}

과거에는 폐암은 매우 드문 종양이었으나, 20세기에 들어서 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여, 서양에서는 남녀 모두에서 가장 많이 발생하고 있다. 우리나라에서는 남자에서 많이 발생하는 악성 종양으로, 여자에서도 놀랄 만큼 그 빈도가 증가하고 있는 추세이다. 이러한 폐암의 발생 빈도의 증가는 흡연, 대기 오염 및 산업 공해 증가 등에 기인한다.

의학이 발달한 오늘날에도 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 5년 생존율은 50% 미만이고, 전체 암환자의 약 3분 의 2는 진행 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료 효과는 치료법의 문제만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확하게 진단하고, 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

최근, 암의 진단에 유전자 검사가 적극적으로 시도되고 있는바, 대표적인 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR(Abelson Murine Leukemia Viral Oncogene Homolog: Breakpoint cluster region) 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블랏팅으로 파악함으로써, 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법이 시도되고 있다. 그러나, 상기 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 위양성률(false positive rate)이 높고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어려우며, 그 유용성에도 한계가 있었다 (Kopreski, M.S. et al., Clin. Cancer Res., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al., Clin. Chem., 47:505, 2001). 또한, 최근 혈청(serum)이나 혈장(plasma) 내 DNA를 사용하는 유전자 검사가 활발히 시도되고 있다. 상기 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양 억제 유전자의 돌연변이, 소실, 기능 상실 등 암 특이적인 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다.　

한편, 폐암 환자에서 객담이나 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자 검사나 항체 검사로 찾는 방법이 시도되고 있다 (Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999). 그러나, 다수 유전자의 이상을 동반하고, 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동 분석할 수 있는 방법이 요구되나, 이러한 방법은 아직 정립되어 있지 않다.

이에, 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있는데, DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 사이토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사 인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것으로서, 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것이 암 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR, 이하, "MSP"라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 발암에 2차적인 변화를 일으키는지에 대한 논란이 있으나, 여러 암에서 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), DNA 수선 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등이 과메틸화(hyper-methylation)되어 있어 이들 유전자의 발현이 차단되어 있다는 것이 확인되었으며, 특히 암 발생의 초기 단계에서 특정 유전자의 프로모터 부위에 과메틸화가 일어난다는 것이 알려져 있다.

따라서, 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 이는 암의 진단 및 조기 진단, 발암 위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적 조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용할 수 있다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000).

현재, 폐암의 진단은 여러 가지 검사를 통해서만 가능하며, 폐암으로 의심되는 증상이 있을 경우, 흉부 촬영 검사, 현미경적 검사, 비디오경 검사, 생검, 전이여부 확인 검사 등을 통해 폐암인지 여부를 가려내어 그 진행 정도 등을 판단한다. 그러나, 상기 검출방법은 고가의 장비, 고비용, 검체 채취에 어려움이 있을 뿐 아니라, 폐암의 초기 진단에 부적합하다. 따라서, 폐암의 경우 종양의 크기가 3㎝ 이하인 제1병기의 5년 생존 가능성은 약 70%에 달한다는 것을 볼 때, 환자의 생존기간을 늘이려면 병변 범위가 작을 때 조기 진단하는 것이 가장 좋은 방법이다. 이에, 기존의 각종 폐암 검출방법보다 효율적인 검출방법, 즉, 조기에 진단이 가능하고, 대용량으로 검체를 처리할 수 있으며, 민감도 및 특이도가 높은 새로운 진단에 사용할 폐암 특이적 바이오 마커의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명자들은 대장암 특이적 발현 감소 유전자 LAMA2(laminin merosin alpha 2), FABP4(fatty acid binding protein 4), GSTA2(glutathione S-transferase A2), STMN2(stathmin-like 2), NR4A2(nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), DSCR1L1(down syndrome critical region gene 1-like 1), A2M(alpha-2-macroglobulin) 및 SEPP1(selenoprotein P, plasma, 1)의 메틸화된 프 로모터를 이용한 암 진단용 마이크로어레이 및 암 진단 키트에 대하여 출원하여 등록받은바 있다 (대한민국 등록특허 제10-0617649호).

이에, 본 발명자들은 폐암을 효과적으로 진단할 수 있는 진단용 키트를 개발하고자 예의 노력한 결과, 폐암 세포에서 특이적으로 메틸화되는 PCDHAG12(GenBank NM_032094) 유전자의 메틸화된 5'UTR 또는 메틸화된 엑손 1 부위를 폐암 특이적 바이오마커로 이용하여 메틸화 정도를 측정함으로써, 폐암 및 그 진행단계를 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 폐암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 부위를 함유하는 폐암 진단용 바이오마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐암 진단용 바이오마커를 이용한 폐암 및 그 진행단계의 검출방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12)의 메틸화된 5'UTR 또는 메틸화된 엑손 1 부위를 포함하는 폐암 진단용 바이오마커를 제공한다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 메틸화된 CpG섬을 함유하고, 서열번호 2~4 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 폐암 진단용 바이오마커를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 DNA에서 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유전자의 5'UTR 또는 엑손 1 부위의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 폐암 특이적 마커 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위의 CpG의 메틸화를 진단할 수 있는 폐암 진단용 키트를 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 진단용 키트를 이용하면, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 폐암의 조기 진단이 가능하며, 폐암의 예후예측 및 모니터링에 응용할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, 폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12)의 메틸화된 5'UTR 또는 메틸화된 엑손 1 부위를 포함하는 폐암 진단용 바이오마커에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화된 5'UTR(untranslated region) 또는 메틸화된 엑손 1 부위는 적어도 하나의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 5'UTR 및 엑손 1 부위는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법은, 일 양태로 (1) 형질전환된 세포주 및 비형질전환된 세포주를 대상으로 형질전환된 세포주에서만 DNA 과메틸화가 된 유전자를 선택하는 단계; (2) 형질전환된 폐암 조직세포 및 연접부위의 비형질전환 조직 세포의 유전자 발현목록을 비교하여, 비형질전환 조직 세포에 더 많이 발현하는 유전자의 목록을 분류하는 단계; (3) 형질전환된 폐암 세포주를 메틸화 저해제로 처리하고, 처리하지 않은 형질전환된 폐암세포주와 비교하 여, 메틸화 저해제를 처리한 형질전환된 폐암 세포주에서 더 많이 발현하는 유전자의 목록을 분류하는 단계; 및 (4) (1), (2) 및 (3) 단계에서 얻은 유전자 목록을 비교하여, 세 목록에 모두 존재하는 유전자를 비형질전환 상태에서 형질전환된 폐암세포 형태로 전환 중인 세포의 게놈에서 메틸화에 의해 조절되는 마커 유전자로 간주하는 단계로 구성되는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서, 폐암세포주의 지노믹 DNA로부터 상기 스크리닝 방법으로 스크리닝된 폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12 유전자는 5'UTR 및 엑손 1 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있었다.

다른 관점에서, 본 발명은 하나 이상의 메틸화된 CpG섬을 함유하고, 서열번호 2~3 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 폐암 진단용 바이오마커에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 단편은 폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위는 폐암세포주에서 구체적으로 R1(서열번호 2), R2(서열번호 3) 및 R3(서열번호 4) 부위가 메틸화되어 있었다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 폐암환자의 폐암조직의 R1, R2 및 R3 부위에서 매우 높은 정도의 메틸화 수준을 나타내었으며, 서로 쌍인 폐암 조직과 연접부위의 정상조직에서의 메틸화 정도는 R1의 경우 40개의 임상검체 중 34개에서 높게 나타나 85%를 차지하였으며, R3의 경우는 36개로서 90%로 나타났다. PCDHGA12 유전자의 R1, R2 및 R3 부위의 과메틸화를 측정함으로써 폐암을 효율적으로 진단할 수 있다는 것을 보여준다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 DNA에서 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유전자의 5'UTR 또는 엑손 1 부위의 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 메틸화의 검출은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가지는 DNA 부위에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메틸화 측정방법은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩 기반 검출방법, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 세포, 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 사용된, 틸화 바이오 마커 유전자의 선별방법으로 폐암뿐만 아니라, 폐암으로 진행 중인 여러 이형증 단계에서 다양하게 메틸화되는 유전자를 찾아낼 수 있으며, 선별된 유전자는 폐암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

폐암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 폐암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이타는 다른 비-메틸화 연관 바이오 마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 폐암 진단 시스템을 확립할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오 마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 폐암 진행을 진단할 수 있다. 폐암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 폐 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 폐암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 과메틸화일 수 있다.

본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.

다른 예로, 본 발명에서는 PCDHGA12(NM_032094, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유전자 5'UTR 및 엑손 1 부위의 메틸화 상태를 키트를 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 폐 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트를 이용하면 검체의 폐 조직의 세포 성장성 이상 성 향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 폐 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 폐암을 형성할 가능성이 있는 세포의 조기 진단이 가능하다. 암세포에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 세포에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 세포는 암화가 진행되고 있는 것이다. 따라서 정상으로 보이는 세포에서의 폐암 특이적 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위가 메틸화되는 것을 확인함으로써 폐암을 조기 진단할 수 있다.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 폐 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 폐 조직의 세포 성장성 이상(이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 상기 키트를 이용하여 마커 유전자 5'UTR 및 엑손 1 부위의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 폐암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 세포, 소변, 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 임상샘플로부터 샘플 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 DNA를 bisulfite를 처리하는 단계; (c) PCDHGA12 유전자 5'UTR 및 엑손 1 부위의 CpG를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하여 메틸화 여부를 결정하는 단계.

본 발명의 일 양태에서, 상기 검출방법은 키트의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 검출방법에 사용되는 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 프라이머는 서열번호 5~21 기재된 서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함한다. 기능적 조합 또는 단편은 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하는 프라이머로 사용된다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성 요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 예를 들면, 메틸화 민감성 제한 효소를 함유하는 용기를 하나의 용기로 구성할 수 있다. 하나 이상의 용기는 중요 핵산 로커스와 상동성을 가지는 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 용기는 메틸화 민감성 제한효소의 이소키소머를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 상기 키트를 이용하여, 폐암을 검출하는 방법은 (1) 임상샘플에서 지노믹 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 지노믹 DNA를 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; (3) 상기 메틸화 민감성 제한효소로 처리된 지노믹 DNA를 본 발명의 폐암 진단용 바이오마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계; 및 (4) 상기 증폭된 산물에서 폐암 진단용 바이오마커의 존재유무를 판별하는 단계를 거칠 수 있으며, 바이오마커 단편이 존재하는 시료를 폐암 또는 폐암진행단계의 시료로 진단할 수 있으며, 상기 키트는 포함된 프라이머를 이용한 PCR 증폭 산물의 유무를 확인하기 위하여 폐암 진단용 바이오마커와 엄격한 조건에서 하이브리다이제이션할 수 있는 단편을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 상기 폐암 진단용 바이오마커의 존재유무를 판별하는 방법으로는 bisulfate sequencing, pyrosequencing, methylation-specific PCR, MethyLight, methylated DNA binding 단백질을 이용한 PCR 및 DNA chip 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 "세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다.

본 발명에서 암의 "조기 확인"은 전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 "조기 확인"은 세포가 형질전환되는 형 태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 말한다.

본 발명에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 의미한다. 본 발명에서, "샘플" 또는 "검체 샘플" “임상검체” “임상샘플” 은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직 배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 샘플을 포함하는 폭넓은 범위의 샘플을 의미한다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 폐의 생검(biopsy)이다.

메틸화 바이오 마커의 스크리닝

본 발명에서는 세포 또는 조직이 형질전환되거나 세포의 형태가 다른 형태로 변화될 때에 메틸화되는 바이오 마커 유전자를 스크리닝하였다. 여기서, "형질전환" 세포는 정상 형태가 비정상 형태로, 비-종양성이 종양성으로, 미분화 형태가 분화 형태로 바뀌는 등의 세포 또는 조직의 형태가 다른 형태로 변화되는 것을 의미한다.

그러므로, 본 발명에서는 폐암세포로의 형질전환에서 메틸화 조절 마커 유전자를 체계적인 방법으로 확인하였다. 상기 방법의 일 양태로, (1) 형질전환된 세포주 및 비형질전환된 세포주를 대상으로 메틸화 특이적 결합단백질인 MBD2bt를 이용하여 메틸화된 DNA만을 선택분리 하는 단계; (2) 이들 DNA 각각을 증폭하고 형광염료로 표지하는 단계; (3) 형광염료로 표지된 DNA를 메틸화를 측정할 수 있는 마이크로어레이에 하이브리다이제이션 시키는 단계; (4) 하이브리다이제이션 결과로부터 형질전환세포에서 과메틸화된 유전자를 선별하는 단계; (5) 형질전환된 폐암 조 직세포 및 연접부위의 비형질전환 조직 세포의 유전자 발현목록을 비교하여, 비형질전환 조직 세포에 더 많이 발현하는 유전자의 목록을 분류하는 단계; (6) 형질전환된 폐암 세포주를 메틸화 저해제로 처리하고, 처리하지 않은 형질전환된 폐암세포주와 비교하여, 메틸화 저해제를 처리한 형질전환된 폐암 세포주에서 더 많이 발현하는 유전자의 목록을 분류하는 단계; 및 (7) (5) 단계 및 (6) 단계에서 얻은 유전자 목록을 비교하여, 세 목록에 공통적으로 존재하는 유전자를 비형질전환 상태에서 형질전환된 폐암세포 형태로 전환 중인 세포의 게놈에서 메틸화에 의해 조절되는 마커 유전자로 간주하는 단계로 구성되는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA (peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이 든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다.

메틸화(methylation)

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟 부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하고 있거나, 함유할 것으로 추정되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG 밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한, 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5' 부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론를 포함하는 여러 부위에서 발견된다.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의　분획일 수 있고, 처음부터 특이서열이 전체 핵산 서열을 구성하는 분리된 분자 형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산 서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러 가지 방법으로 추출될 수 있다.

핵산은 정보를 코딩하거나 핵산의 전사를 조절하는 DNA 부위인 조절 부위를 포함할 수 있다. 조절 부위는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. "프로모터"는 전사를 지시하는데 필요한 최소한의 서열이고, 프로모터-의존성 유전자에서 세포 타입 특이적, 조직 특이적 또는 외부 시그널이나 제제에 의한 유도성을 조절할 수 있다. 프로모터는 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치한다. 프로모터 부위의 전체 또는 부분의 핵산 수는 CpG 섬 부위의 메틸화를 측정하는데 적용될 수 있다. 타겟 유전자 프로모터의 메틸화는 외곽에서부터 내부로 진행한다. 그러므로, 세포 전환의 초기 단계는 프로모터 부위의 외곽에서의 메틸화를 분석함으로써 검출할 수 있다.

검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 폐암이나 폐암의 진행 단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 폐 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해 분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명에서, "과메틸화" 또는 "하이퍼메틸화"란 종양세포의 특정 CpG 위치 또는 CpG로 구성된 특정 염기서열의 부위에서의 메틸화 정도가 정상세포에 비해 높은 상태를 나타낸다.

샘플(sample)

본 발명은 폐암의 조기 확인에 대하여 기술하고 있으며, 폐암 특이적 유전자 메틸화를 이용하고 있다. 폐암 특이적 유전자의 메틸화는 종양 부위의 부근의 조직에서도 일어났다. 그러므로, 폐암의 조기 확인 방법은 액체 또는 고체 조직을 포함하는 모든 샘플로 폐암-특이적 유전자 프로모터의 메틸화 유무를 확인할 수 있다. 상기 샘플은 객담, 혈청 또는 혈장을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

메틸화 검출 방법

차별적 메틸화의 검출-메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR)

지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리하면 5'-CpG'-3 부위의 시토신이 메틸화된 경우에는 그대로 시토신으로 남아 있고, 비메틸화된 경우에는 우라실로 변하게 된다. 따라서, 바이설파이트 처리 후 변환된 염기서열을 대상으로 5'-CpG-3' 염기서열이 존재하는 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이때, 메틸화된 경우에 해당되는 PCR 프라이머와 비메틸화된 경우에 해당하는 두 종류의 프라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 변환시킨 다음, 상기 두 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 하면 메틸화된 경우에는 메틸화된 염기서열에 해당되는 프라이 머를 사용한 것에서 PCR 산물이 만들어지게 되고, 반대로 비메틸화인 경우에는 비메틸화에 해당되는 프라이머를 이용한 것에서 PCR 산물이 만들어진다. 메틸화 여부는 아가로오스겔 전기영동방법으로 정성적으로 확인할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출-실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR)

실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화 특이 PCR 방법을 실시간 측정방법으로 전환한 것으로, 지노믹 DNA에 바이설파이트를 처리한 후, 메틸화된 경우에 해당하는 PCR 프라이머를 디자인하고, 이들 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 것이다. 이때, 증폭된 염기서열과 상보적인 TanMan 프로브를 이용하여 검출하는 방법과 Sybergreen을 이용하여 검출하는 두 가지 방법이 있다. 따라서 실시간 메틸화 특이 PCR은 메틸화된 DNA만을 선택적으로 정량 분석할 수 있다. 이때, in vitro 메틸화된 DNA 샘플을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 표준화를 위하여 염기서열 내에 5'-CpG-3' 서열이 없는 유전자를 음성 대조군으로 함께 증폭하여 메틸화 정도를 정량 분석하였다.

차별적 메틸화의 검출-파이로시퀀싱

파이로시퀀싱 방법은 바이설파이트 시퀀싱 방법을 정량적인 실시간 시퀀싱으로 변환한 방법이다. 바이설파이트 시퀀싱과 마찬가지로, 지노믹 DNA를 바이설파이트를 처리하여 전환시킨 다음, 5'-CpG-3' 염기서열이 없는 부위에 해당하는 PCR 프 라이머를 제작하였다. 지노믹 DNA를 바이설파이트로 처리한 후, 상기 PCR 프라이머로 증폭한 다음, 시퀀싱 프라이머를 이용하여 실시간 염기서열 분석을 수행하였다. 5'-CpG-3' 부위에서 시토신과 티민의 양을 정량적으로 분석하여 메틸화 정도를 메틸화 지수로 나타내었다.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 정량 PCR 및 DNA 칩

메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR 또는 DNA 칩 방법은 메틸화 DNA에만 특이적으로 결합하는 단백질을 DNA와 섞어주게 되면, 메틸화 DNA에만 특이적으로 단백질이 결합하기 때문에 메틸화 DNA만을 선택적으로 분리할 수 있다. 지노믹 DNA를 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질과 섞어준 후, 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리하였다. 이들 분리된 DNA를 프로모터 부위에 해당하는 PCR 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 아가로즈 전기영동으로 메틸화 여부를 측정하였다.

또한, 정량 PCR 방법으로도 메틸화 여부를 측정할 수 있으며, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질로 분리한 메틸화 DNA는 형광 염료로 표지하여 상보적인 프로브가 집적된 DNA칩에 하이브리디제이션시킴으로써 메틸화 여부를 측정할 수 있다. 여기서, 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질은 McrBt에 제한되지 않는다.

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한효소

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민 감성 제한제한효소와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한효소의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.

특이적 프라이머를 핵산 샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 효소를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 효소의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 효소를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 효소의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산 부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

여기서, "메틸화 민감성 제한 효소"는 인식 부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 효소의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한효소는 예를 들어, SacII 및 EagI를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

메틸화 민감성 제한 효소의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 효소와 동 일한 인식 부위를 갖는 제한 효소이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭 과정은 예를 들면, PCR과 같은 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링되면, DNA 폴리머라아제 I (Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형 증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출-바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

기질 　

타겟 핵산 부위가 증폭되면 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭 산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성·분해·에칭되고, 리소그라프되며, 프린트·마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드 보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해 분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로는 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREENTM, ZETAPROBETM(Biorad) 및 NYTRANTM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC/AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려 조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2X SSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2X SSC/0.1% SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서의 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건).

세척 과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

표지(Label)

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

키트(Kit)

본 발명에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 프라이머는 서열번호 5~21 기재된 서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함한다. 기능적 조합 또는 단편은 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하는 프라이머로 사용된다.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성 요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 예를 들면, 메틸화 민감성 제한 효소를 함유하는 용기를 하나의 용기로 구성할 수 있다. 하나 이상의 용기는 중요 핵산 로커스와 상동성을 가지는 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 용기는 메틸화 민감성 제한효소의 이소키소머를 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 폐암 세포주에서 과메틸화되어 있는 유전자의 선별

폐암에서 과메틸화된 유전자를 선별하기 위하여 폐암 세포주 A549(한국세포주은행(KCLB 10185)와 정상 폐세포주 NHBE(Cambrex cc-2541)를 이용하여 과메틸화된 유전자를 하기의 방법으로 선별하였다.

우선 각 세포주의 gDNA 500μg을　sonication 방법 (Vibra Cell, SONICS)으로 300-400bp 크기의 절편으로 만들고, Methylcapture^TM (Genomictree, 대한민국)를 이용하여 프로토콜에 준하여 각 세포주에서 메틸화 DNA를 선택적으로 분리하였다. 분리한 메틸화 DNA를 GenomePlex Complete Whole Genome Amplification Kit (Sigma)를 사용하여 증폭한 후, A549 및 NHBE 유래 증폭된 메틸화 DNA를 각각 Cy5-dUTP와 Cy3-dUTP로 표지하여 혼합한 후,　인간 유전체에 존재하는 27,800 여개의 CpG 섬에 존재하는 CpG에 대한 프로브가 집적되어 있는 CpG 마이크로어레이(Agilent, 제조국)에 Agilent 프로토콜에 따라 혼성화 반응 및 스캐닝을 수행하고, 통계적 기법을 통하여 A549에서 과메틸화된 후보 유전자를 50개 선별하였다 (도 1 및 표 1).

A549 폐암 세포주에서 과메틸화되어 있는 유전자 리스트

Gene symbol	Genbank Acc. No.
ADAMTS20	NM_175851
BARHL2	NM_020063
C14orf39	NM_174978
CCDC8	NM_032040
CFL1-MUS81	NM_005507
CLDN11	NM_005602
CNIH3	NM_152495
CORO6	NM_032854
CPT1C	NM_152359
DBX1	NM_001029865
DNMT3A	NM_153759
DPP6	NM_001936
EN1	NM_001426
EPSTI1	NM_033255
GLUL	NM_001033056
GNAL	NM_002071
GRHL2	NM_024915
HKR1	NM_181786
HLX1	NM_021958
HOXA11	NM_005523
HOXA5	NM_019102
HOXA6	NM_024014
HOXA7	NM_006896
HOXA9	NM_152739
HOXB5	NM_002147
HOXC11	NM_014212
HOXD12	NM_021193
HOXD8	NM_019558
IRX5	NM_005853
LHX1	NM_005568
LMX1A	NM_177398
MEGF10	NM_032446
MOS	NM_005372
PCDHGA12	NM_003735
PCDHGA5	NM_032054
PCDHGC3	NM_032402
PLCXD3	NM_001005473
POU4F3	NM_002700
PRAC	NM_032391
PTGER4	NM_000958
RGMA	NM_020211
RTKN	NM_033046
TAC1	NM_003182
TBX5	NM_080718
TGIF2	NM_021809
TLX3	NM_021025
WNK3	NM_020922
WNT3	NM_030753
ZNF560	NM_152476
ZNF577	NM_032679

실시예 2: 폐암 조직에서 메틸화에 의해 발현이 억제되는 유전자 선별

폐암 조직에서 메틸화에 의해 발현이 억제되는 유전자를 선별하기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하였다. 마이크로어레이 하이브리다이제이션은 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다 (Schena et al., Science, 270:467, 1995).

폐암 환자로부터 쌍을 이루도록 종양 부근 조직 및 종양 조직을 분리하고, 이로부터 전체 RNA를 분리하였다. 상기 짝지워진 종양 부근 조직 및 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적 차이를 간접적으로 비교하기 위하여, 표준비교 RNA(간접 비교)를 제작하였다. 표준비교 RNA를 제작하기 위하여, 폐암세포주 A549(한국세포주은행(KCLB 10185), 위암세포주 AGS(KCLB 21739), 신장암 세포주 Caki-2(KCLB 30047), 결장암 세포주 HCT116(KCLB 10247), 자궁경부암 세포주 Hela(KCLB 10002), 혈액암 세포주 HK-60(KCLB 10240) 및 HT1080(KCLB 10121), 유방암 세포주 MDA-MB231(KCLB 30026), 간암 세포주 SK-hep1(KCLB 30052), T세포 유래 세포주 Molt-4(KCLB 21582) 및 뇌암 세포주 U-87MG(KCLB 30014) 등 11개 인간 암세포주로부터 전체 RNA를 분리하였다. 세포주 및 폐 조직의 전체 RNA는 Tri Reagent(Sigma, USA)를 사용하여 분리하였다.

표준비교 RNA를 제작하기 위하여, 상기 11개 세포주로부터 분리한 전체 RNA를 동량으로 혼합하여 내부 대조군으로 사용하였다.

상기 짝을 이룬 종양 부근 조직 및 종양 조직의 상대적 유전자 발현 정도를 비교하기 위하여, 비종양 및 종양 조직으로부터 분리한 RNA와 표준비교 RNA를 간접적으로 비교하였다. 전체 RNA 100㎍을 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP로 표지하였다. 상기 표준비교 RNA를 Cy3로 표지하였고, 폐 조직으로부터 분리한 RNA를 Cy5로 표지하였다. 상기 Cy3- 및 Cy5-로 표지된 cDNA를 PCR 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 정제한 후, 상기 정제된 cDNA를 혼합하고, Microcon YM-30(Millipore Corp., USA)을 이용하여 최종 부피가 27㎕가 되도록 농축하였다.

하이브리다이제이션 반응액 80㎕(상기 표지된 cDNA 타겟 27㎕, 20X SSC 20㎕, 1% SDS 8%, 포름아마이드(Sigma, USA) 24㎕ 및 인간 Cot1 DNA(Invitrogen Corp., USA) 20㎍)를 100℃에서 2분간 가열하고, 즉시 인간 22K 올리고뉴클레오티드(GenomicTree, Inc., 한국) 마이크로어레이에 하이브리다이즈시켰다. 상기 하이브리다이제이션은 습도 조절된 HybChamber X(GenomicTree, Inc., 한국)에서 42℃에서 12~16시간 동안 수행하였다. 상기 하이브리다이제이션이 끝난 후, 마이크로어레이 슬라이드를 Axon 4000B(Axon Instrument Inc., USA)를 이용하여 판독하였다. 시그날 및 배경 형광 강도는 GenePix Pro 4.0 소프트웨어(Axon Instrument Inc., USA)를 사용하여 타겟 부위 내부의 모든 픽셀의 강도를 평균하여 각 프로브에 대해 측정하였다. 명백하게 비정상성을 보이는 스팟은 분석에서 제외하였다. 모든 데이타는 GeneSpring 7.2(Agilent, USA)를 이용하여 정규화, 통계학적 분석 및 클러스트 분석을 수행하였다.

또한, 비종양 및 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적인 차이를 결정하기 위하여, 간접 비교를 위한 통계학적 분석(ANOVA, p<0.01)을 수행하였다. 상기 통계학적 분석 결과로부터 짝 지워진 종양 부근 조직과 비교하여 종양 조직에서 252개의 유전자가 하향조절(down regulated)되었다.

실시예 3: 탈메틸화에 의해 재활성화되는 유전자 선별

실시예 1에서 확인된 유전자의 발현이 유전자의 프로모터 메틸화에 의하여 조절되는지 확인하기 위하여, 폐암 세포주 A549(KCLB(한국세포주은행) 10185) 및 NCI-H358(KCLB 90358)에 디메틸화제인 5-아자-2-데옥시사이티딘(DAC, Sigma, USA)을 200nM 농도로 3일간 처리하였다. 처리하지 않은 세포주와 처리한 세포주를 Tri reagent로 처리하여 전체 RNA를 분리하였다.

DAC 처리에 의한 유전자 발현 변화를 측정하기 위하여, 비처리 세포주 및 처리 세포주간의 전사 수준을 직접적으로 비교하였다. 그 결과, DAC를 처리하지 않은 대조군에 비하여, DAC를 처리하였을 경우 367개의 유전자가 발현이 상승하는 것을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 획득한 252개의 종양 억제 유전자 목록과 367개의 디메틸화에 의하여 2배 이상 재발현된 유전자를 비교한 결과, 18개의 공통된 유전자를 확인하였다 (도 1).

실시예 4: 폐암에서 과메틸화된 유전자 PCDHGA12 선별

상기 18개 유전자의 프로모터 부위에서 CpG 섬의 존재를 확인하기 위하여,　MethPrimer(http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html)을 이용하였다. 상기 18개 유전자 중 13개의 유전자는 CpG 섬을 가지고 있지 않았기 때문에, 상기 13개의 유전자를 공통 유전자 목록에서 제외시켰다. 따라서 상기 5개 유전자 중 실시예 1의 CpG 마이크로어레이 분석에서 선별된 50개 유전자에 포함되어 있는 PCDHGA12 유전자를 최종 폐암 관련 메틸화 바이오마커로 선별하였다. 선택된 PCDHGA12 유전자는 폐암 세포주에서 과메틸화 되어 있으며, 폐암 조직에서 하향조절되고(down-regulated), 디메틸화 조건에서 재활성화 되며(up-regulated), 프로모터와 5'UTR 그리고 엑손 1에 CpG 섬을 함유하고 있는 여러 조건을 만족하는 것을 알 수 있었다 (표 2).

폐암 조직 및 폐암 세포주에서 PCDHGA12 유전자의 발현 수준

유전자	폐암 조직에서의 하향조절 정도		폐암 세포주에서의 재발현 수준
유전자	평균 fold change	p-value	A549	NCI-H358
PCDHGA12	0.26	<0.01	2.0	7.3

실시예 5: 폐암에서의 PCDHGA12 유전자의 과메틸화 부위 탐색

　　　　　(1) 바이설파이트(bisulfite) 클로날 시퀀싱을 이용한 탐색

A549 및 NHBE 세포주를 이용하여, 바이설파이트 클로날 시퀀싱 방법으로 PCDHGA12 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위에서의 메틸화 정도를 알아보았다 (도 2A). 바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 정상세포주 NHBE 및 폐암 세포주 A549(KCLB 10185)로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다.

상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시킨 후 게놈 DNA 20ng을 이용하여 표 3에 나타낸 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여, PCR　방법으로 도 2A에 나타낸 PCDHGA12 유전자의 R1, R2 및 R3 부위를 증폭하였다. PCR은 94℃에서 1분, 66℃에서 1분, 72℃에서 1분간 처리하는 것을 한 사이클로 하여 총 40회 수행하였고, 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다.

바이설파이트 클로날 시퀀싱 프라이머

증폭부위	서열번호	염기서열 (5‘ --> 3’)
R1	5	TTTTTTTTGAAGAATAGTAGGTGGAGTTAT
R1	6	CAACCCCAAATCCCTAAAAATATC
R2	7	GTTTGTTTTGTTGGGAATTTTTTTG
R2	8	AACCAAATAATAAACAACCTTTTCTTC
R3	9	GAAAAGGTTGTTTATTATTTGGTTTTTA
R3	10	AAAACCTATTCCCTATCCAAAACTATATCT

상기 PCR 반응을 통해 증폭된 DNA를 정제하고, 이를 T/A 클로닝 벡터 (Invitrogen, USA)에 클로닝 하였다. R1, R2 및 R3 증폭산물로부터 만들어진 클론들중 각각 10개씩을 선택하여 이에 대한 염기서열을 분석하여 메틸화 여부를 판별하였다. 그 결과, NHBE에 비하여 A549의 R1, R2 및 R3 부위가 상대적으로 높은 수준으로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다(도 2B). 특히 R3 부위의 메틸화 정도가 가장 현저한 차이를 보이는 것을 확인하였다.

(2) 파이로시퀀싱을 이용한 탐색

A549 및 NHBE 세포주를 이용하여, 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법으로 PCDHGA12 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위에서의 메틸화 정도를 알아보았다 도 3). 바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형하기 위하여, 정상세포주 NHBE 및 폐암 세포주 A549(KCLB 10185)로부터 전체 게놈 DNA를 분리하여, 그 중 게놈 DNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다.

상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱을 수행하였다. 바이설파이트가 처리된 게놈 DNA 20ng을 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR은 94℃에서 1분, 66℃에서 1분, 72℃에서 1분간 처리하는 것을 한 사이클로 하여 총 40회 수행하였고, 최종적으로 72℃에서 10분간 신장하였다. 이후, 상기 바이오틴으로 표지된 주형 DNA를 정제하고, PyroMark ID (Biotage, 스웨덴)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. PCDHGA12 유전자에 대한 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 각 부위에 대한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)을 이용하여 설계하였다. PCDHGA12 유전자 프로모터의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 표 4와 같다.　

파이로시퀀싱을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머

증폭부위	서열번호	염기서열 (5‘ --> 3’)
R1	11	Biotin-GGGAGAGAAAAGTGGAGATTT
	12	CTCCCAAAAATAATTCATTCCTAA
	13	AACTATCTACTTTATACTTCAA
R2	14	GGATAAAGTGAAAATATATGGAGTAG
	15	Biotin-CCAAATAATAAACAACCTTTTCT
	16	GTGAAAATGTAGTTATTGAG
R3	17	AGAAAAGGTTGTTTATTATTTG
	18	Biotin-TACCCAAAACCAAATTCTC
	19	TGTTTATTATTTGGTTTTTA

PCDHGA12 유전자의 3개 부위에 대한 폐암세포주에서의 과메틸화 정도를 알아보기 위하여 정상세포주 NHBE (Cambrex CC-2541), 폐암 세포주 A549(KCLB 10185)외에 NCI-H146(KCLB 30173), NCI-H358(KCLB 90358) 및 HCC1195(KCLB 71195) 등의 폐암 세포주를 대상으로 실시예 5와 같이 파이로시퀀싱을 수행하였다. 그 결과, 모든 암 세포주에서 PCDHGA12 유전자의 R1, R2, R3 부위에서 높은 빈도로 과메틸화되어 있었으며, 특히 R3 부위에서의 과메틸화는 모든 폐암 세포주에서 높게 일어났음을 알 수 있었다 (도 3).

실시예 6: 폐암 조직에서의 PCDHGA12 유전자의 과메틸화 측정

상기 실시예들에서 확인된 바와 같이, 폐암 세포주에서 과메틸화 되어 있으며, 폐암 조직에서 발현이 하향조절되고, 디메틸화 조건에서 재활성화 되며, 5'UTR 및 엑손 1에 CpG 섬을 함유하고 있으며, 각종 폐암세포주에서 R1, R2, R3 부위에 과메틸화 되어 있는 PCDHGA12 유전자를 이용하여 폐암 진단용 바이오 마커로 사용할 수 있는지 검증하기 위하여, 건강한 사람 5명의 폐조직과 폐암환자 40명의 폐암 조직 및 그의 인접부위의 정상 조직 임상 검체를 이용하여 PCDHGA12 유전자의 R1과 R3 부위에 대하여 메틸화 어세이를 수행하였다. 메틸화 어세이는 파이로시퀀싱 방법을 사용하여 실시예 5에 기재된 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, PCDHGA12 유전자의 R1과 R3 부위 모두에서 폐암 조직 연접 부위의 정상 조직에서의 메틸화 정도는 환자가 아닌 정상조직에서의 메틸화 정도와 유사한 반면, 폐암 조직에서는 매우 높은 정도의 메틸화 수준(p 값=0.0001)을 나타내었다. 또한 서로 쌍인 폐암 조직과 연접부위의 정상조직에서의 메틸화 정도는 R1의 경우 40개의 임상검체 중 34개에서 높게 나타나 85%를 차지하였으며, R3의 경우는 36개로서 90%로 나타났다. 따라서 PCDHGA12 유전자의 과메틸화는 폐암에서 매우 높은 빈도로 일어남을 알 수 있었으며, 이러한 결과는 PCDHGA12 유전자의 과메틸화를 측정함으로써 폐암을 효율적으로 진단할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 7: 비침습적 임상검체인 객담에서의 PCDHGA12 유전자의 과메틸화 측정

폐암환자의 객담에서도 다양한 유전자의 DNA 과메틸화가 검출될 수 있다는 여러 보고가 있으며, 폐암의 조기 및 재발 여부를 객담을　이용할 경우, 환자 편의적 진단이 가능하기 때문에, 객담샘플에 함유된 세포에서의 PCDHGA12 유전자의 과메틸화 정도를 확인하였다.

51명의 정상인 객담과 81명의 폐암 환자 객담을 대상으로 PCDHGA12 유전자의 R1, R2 및 R3 부위에 대한 파이로시퀀싱을 실시예 5에 기재된 방법으로 수행하였다. 그 결과, 정상인의 객담에 비해 폐암환자의 객담에서 PCDHGA12 유전자의 R1, R2 및 R3 부위의 과메틸화 정도가 높게 측정되는 석을 확인하였다(도 5).

또한, ROC(receiver operating calculation) 커브 분석을 수행한 결과, R1, R2 및 R3 부위의 메틸화 지수를 각각　13.49, 15.62, 25.77을 메틸화 지수 기준(cut-off)으로 설정하였을 때, 객담을 대상으로 한 폐암 진단에 대한 민감도(sensitivity)는 각각 74.1%, 70.4%, 86.4%였으며, 이에 대한 특이도(specificity)는 각각 66.7%, 78.4%, 82.4%로 매우 우수한 것으로 나타났다 (표 5). 따라서 비침습적 임상검체인 객담을 이용하여 PCDHGA12 유전자의 DNA 과메틸화를 측정함으로써 폐암의 조기진단, 재발여부, 약물처리 후의 모니터링 및 수술 후의 재발 여부의 모니터링 등 폐암의 다양한 진단에 적용할 수 있을 것으로 판단된다.

객담시료를 대상으로 PCDHGA12 유전자의 각 부위별에 대한 민감도 및 특이도

Region	No. of　 methylation positive sample	No. of methylation negative samples	Cut-off (%)^a	AUC^b	Sensitivity^c	Specificity^c
Region	Cancer	Normal	Cut-off (%)^a	AUC^b	Sensitivity^c	Specificity^c
PCDHGA12 R1	60/81	17/51	13.49	0.725	74.1	66.7
PCDHGA12 R2	57/81	11/51	15.62	0.762	70.4	78.4
PCDHGA12 R3	70/81	9/51	25.77	0.874	86.4	82.4

^aCut-off of mean MtIs for each assay for discriminating cancer from normal were determined by Receiver Operating Characteristic (ROC) curve analysis

^bArea under the ROC curve was determined by ROC curve analysis

^cThe sensitivity and specificity for detecting cancer from normal were determined by ROC curve analysis

†Dichotomous value of methylation status. When mean MtI was greater than a given cut-off for discriminating cancer from normal, it considered methylation positive, 1, while not in considered methylation negative, 0.

실시예 8: 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCDHGA12 유전자의 과메틸화 검출

폐암 진단의 민감도와 특이도가 가장 우수한 PCDHGA12 R3 부위를 대상으로 MethylCapture^TM methylated DNA isolation Kit(Genomictree, 대한민국)를 이용하여 과메틸화 검출을 수행하였다. MethylCapture^TM methylated DNA isolation Kit는 메틸화된 DNA에 특이적으로 결합하는 MBD2bt 단백질을 이용하여 메틸화된 DNA만을 선택적으로 분리한 후 PCR 방법으로 메틸화를 측정할 수 있는 키트이다. 세포주 및 객담 시료로부터 지노믹 DNA를 추출하고, 추출된 지노믹 DNA를 MseI-digestion 방법이나 sonication을 이용하여 200~600bp 크기로 절편화하였다. 이를 2X Binding Buffer, 경쟁자 DNA 및 His-MBD2bt 단백질과 섞어 4℃ 조건으로 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 요액에 마그네틱 비드를 첨가하여 4℃에서 45분간 반응시키고, 세척액으로 5회 세척과정을 수행하여 비특이적으로 결합을 하고 있는 DNA 절편들을 제거하였다. 최종적으로 Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 메틸화된 DNA만을 순수분리 하였다. 정제된 DNA의 1/5 부피를 취하여 유전자 특이적 프라이머로 PCR 증폭을 수행하고, 전기영동 하여 메틸화 여부를 판별하였다. PCDHGA12 R3를 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

서열번호 20: 5‘-gaagaaaaggctgctcacca-3’

서열번호 21: 5‘-tcgcatccagaaccatcac-3’

그 결과, 정상세포주인 NHBE에서는 증폭산물이 전혀 관찰되지 않았으며, 폐암세포주인 A549에서만 PCDHGA12 R3에 대한 증폭산물이 관찰됨으로써 폐암 특이적인 메틸화를 확인할 수 있었다 (도 6A). 또한, 객담세포 지노믹 DNA를 이용하여 정상 및 폐암환자에서 메틸화를 측정한 결과, 3명의 정상 객담시료에서는 전혀 증폭산물이 관찰되지 않았으나, 3의 폐암 환자시료에서는 전부 메틸화가 검출되었다 (도 6B). 따라서 메틸화 특이적 결합단백질을 이용하여 PCDHGA12 R3의 메틸화를 측정할 수 있다는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 폐암 진단용 메틸화 바이오 마커 PCDHGA12를 발굴하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 정상세포 및 폐암 세포주에서 PCDHGA12의 메틸화정도를 확인한 유전자 부위 (A)와 UTR 및 엑손 부위의 메틸화 정도 (B)를 바이설파이트 시퀀싱 방법으로 측정한 것이다.

도 3은 정상세포 및 4종의 폐암 세포에서 PCDHGA12 유전자의 메틸화 정도를 파이로 시퀀싱 방법으로 측정한 것이다.

도 4는 5개의 정상조직, 4개의 쌍을 이루는 폐암 수술조직에서의 PCDHGA12의 메틸화 정도를 파이로 시퀀싱 방법으로 측정한 것이다.

도 5는 정상인 (51명)과 폐암 환자 (81명)의 객담 세포 지노믹 DNA를 이용하여 메틸화를 측정한 것이다.

도 6는 정상 및 폐암세포주와 정상인과 폐암 환자의 객담 DNA를 이용하여 PCDHGA12 유전자 프로모터의 메틸화 정도를 측정한 것이다.

<110> GenomicTree <120> Method for Detecting Lung Cancer Using Lung Cancer Specific Methylated Marker Gene <130> P09-B025 <150> KR10-2008-0023685 <151> 2008-03-14 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1620 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctattaaagc gaatacggta gatttccatc cccttttgaa gaacagtagg tggagctatt 60 taagatataa aaacgaaata tcctttctgg gagttcaaga ttgtgcagta attggttagg 120 actctgagcg ccgctgttca ccaatcgggg agagaaaagc ggagatcctg ctcgccttgc 180 acgcgcctga agcacaaagc agatagctag gaatgaacca tccctgggag tatgtggaaa 240 caacggagga gctctgactt cccaactgtc ccattctatg ggcgaaggaa ctgctcctga 300 cttcagtggt taagggcaga attgaaaata attctggagg aagataagaa tgattcctgc 360 gcgactgcac cgggactaca aagggcttgt cctgctggga atcctcctgg ggactctgtg 420 ggagaccgga tgcacccaga tacgctattc agttccggaa gagctggaga aaggctctag 480 ggtgggcgac atctccaggg acctggggct ggagccccgg gagctcgcgg agcgcggagt 540 ccgcatcatc cccagaggta ggacgcagct tttcgccctg aatccgcgca gcggcagctt 600 ggtcacggcg ggcaggatag accgggagga gctctgtatg ggggccatca agtgtcaatt 660 aaatctagac attctgatgg aggataaagt gaaaatatat ggagtagaag tagaagtaag 720 ggacattaac gacaatgcgc cttactttcg tgaaagtgaa ttagaaataa aaattagtga 780 aaatgcagcc actgagatgc ggttccctct accccacgcc tgggatccgg atatcgggaa 840 gaactctctg cagagctacg agctcagccc gaacactcac ttctccctca tcgtgcaaaa 900 tggagccgac ggtagtaagt accccgaatt ggtgctgaaa cgcgccctgg accgcgaaga 960 aaaggctgct caccacctgg tccttacggc ctccgacggg ggcgacccgg tgcgcacagg 1020 caccgcgcgc atccgcgtga tggttctgga tgcgaacgac aacgcaccag cgtttgctca 1080 gcccgagtac cgcgcgagcg ttccggagaa tctggccttg ggcacgcagc tgcttgtagt 1140 caacgctacc gaccctgacg aaggagtcaa tgcggaagtg aggtattcct tccggtatgt 1200 ggacgacaag gcggcccaag ttttcaaact agattgtaat tcagggacaa tatcaacaat 1260 aggggagttg gaccacgagg agtcaggatt ctaccagatg gaagtgcaag caatggataa 1320 tgcaggatat tctgcgcgag ccaaagtcct gatcactgtt ctggacgtga acgacaatgc 1380 cccagaagtg gtcctcacct ctctcgccag ctcggttccc gaaaactctc ccagagggac 1440 attaattgcc cttttaaatg taaatgacca agattctgag gaaaacggac 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tcgcggagcg cggagtccgc atcatcccca gaggtaggac 180 gcagcttttc gccctgaatc cgcgcagcgg cagcttggtc acggcgggca ggatagaccg 240 ggaggagctc tgtatggggg ccatcaagtg tcaattaaat ctagacattc tgatggagga 300 taaagtgaaa atatatggag tagaagtaga agtaagggac attaacgaca atgcgcctta 360 ctttcgtgaa agtgaattag aaataaaaat tagtgaaaat gcagccactg agatgcggtt 420 ccctctaccc cacgcctggg atccggatat cgggaagaac tctctgcaga gctacgagct 480 cagcccgaac actcacttct ccctcatcgt gcaaaatgga gccgacggta gtaagtaccc 540 cgaattggtg ctgaaacgcg ccctggaccg cgaagaaaag gctgctcacc acctggtc 598 <210> 4 <211> 638 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaaaaggctg ctcaccacct ggtccttacg gcctccgacg ggggcgaccc ggtgcgcaca 60 ggcaccgcgc gcatccgcgt gatggttctg gatgcgaacg acaacgcacc agcgtttgct 120 cagcccgagt accgcgcgag cgttccggag aatctggcct tgggcacgca gctgcttgta 180 gtcaacgcta ccgaccctga cgaaggagtc aatgcggaag tgaggtattc cttccggtat 240 gtggacgaca aggcggccca agttttcaaa ctagattgta attcagggac aatatcaaca 300 ataggggagt tggaccacga ggagtcagga ttctaccaga tggaagtgca 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Claims

폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12)의 메틸화된 5'UTR 또는 메틸화된 엑손 1 부위를 포함하는 폐암 진단용 바이오마커.
제1항에 있어서, 상기 단편은 적어도 하나의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 바이오마커.
하나 이상의 메틸화된 CpG섬을 함유하고, 서열번호 2로 표시되는 폐암 진단용 바이오마커.
하나 이상의 메틸화된 CpG섬을 함유하고, 서열번호 3으로 표시되는 폐암 진단용 바이오마커.
하나 이상의 메틸화된 CpG섬을 함유하는 서열번호 4로 표시되는 폐암 진단용 바이오마커.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폐암 특이적 발현 감소 유전자인 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12)유래인 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 바이오마커.
다음 단계를 포함하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법:

(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리된 DNA에서 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위의 메틸화를 검출하는 단계.
제7항에 있어서, PCDHAG12 유전자의 5'UTR 및 엑손 1 부위의 메틸화 검출은 서열번호 1의 염기서열을 가지는 DNA 부위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법.
다음 단계를 포함하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법:

(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리된 DNA에서 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유전자의 5'UTR 부위의 메틸화를 검출하는 단계.
제9항에 있어서, PCDHAG12 유전자의 5'UTR의 메틸화 검출은 서열번호 2의 염기서열을 가지는 DNA 부위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법.
다음 단계를 포함하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법:

(a) 임상샘플에서 DNA를 분리하는 단계; 및

(b) 상기 분리된 DNA에서 PCDHAG12(GenBank NM_032094, 프로토캐드헤린 감마 서브패밀리 A12, protocadherin gamma subfamily A, 12) 유전자의 엑손 1 부위의 메틸화를 검출하는 단계.
제11항에 있어서, PCDHAG12 유전자의 엑손 1 부위의 메틸화 검출은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 DNA 부위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 폐암 또는 그 진행단계의 검출방법.
제7항, 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메틸화 검출은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 폐암 또는 폐암진행단계의 검출방법.
제7항, 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임상 샘플은 암 의심 환자 또는 진단 대상 유래의 조직, 객담, 세포, 혈액 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 폐암 또는 폐암진행단계의 검출방법.