KR102837245B1

KR102837245B1 - 표적 핵산의 검출용 대립 유전자 특이적 프라이머

Info

Publication number: KR102837245B1
Application number: KR1020240105974A
Authority: KR
Inventors: 원대연; 박상혁; 김은주; 김희윤; 배지혜; 김남중; 김경탁
Original assignee: 주식회사 에이치비헬스케어
Priority date: 2024-08-08
Filing date: 2024-08-08
Publication date: 2025-07-23
Anticipated expiration: 2044-08-08

Abstract

본 발명은 표적 핵산의 검출을 위한 변형 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 기존의 대립 유전자 특이적 프라이머에서 발생하는 위양성 신호를 문제를 해결하여, 표적 핵산을 특이적으로 증폭시키면서도, 미스매치가 존재하는 핵산을 증폭시키지 않아 보다 정확한 검출이 가능하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유사서열이 존재하는 경우에도 표적 핵산을 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있으며, 나아가 유전자 맵핑, 유전자 분석, 돌연변이 검출뿐만 아니라, 바이오마커를 활용한 진단/동반 진단 및 약물반응성 예측, 예후예측과 같은 의료분야에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표적 핵산의 검출용 대립 유전자 특이적 프라이머{Allele specific primer for detecting target nucleic acids}

본 발명은 표적 핵산의 검출을 위한 대립유전자 특이적 프라이머(Allele specific primer) 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 3' 말단 유전자 염기의 치환을 통해 유전자 변이체와 같은 표적 핵산을 특이적으로 증폭시키면서도 야생형 유전자에 의한 위양성 신호를 나타내지 않아 뛰어난 정확도 및 민감도를 갖는 신규한 대립유전자 특이적 프라이머에 관한 것이다.

대립 유전자 특이적 핵산 증폭(Allele specific PCR)은 표적 핵산의 서열이 변이(다형성)를 검출하기 위해 사용되는 일반적으로 사용되는 방법으로, 식물/동물의 유전형 분석, 유전자 맵핑, 돌연변이 검출, 진단 등 다양한 분야에서 사용되는 방법이다.

대표적으로, AS-PCR(allele-specific PCR, Ugozzoli and Wallace, 1991), PASA(PCR-amplification of specific alleles, Sommer et al., 1989), ASA(allele-specific amplification), ARMS(amplification refractory mutation system) (Newton et al., 1989) 과 같은 방법에서 3' 말단 또는 이의 근처에 의해 특이성이 결정되는 대립유전자 특이적 프라이머(Allele specific primer)를 사용하여 유전자 변이형의 특이적인 증폭을 유도하여 이를 검출하는 것을 특징으로 한다. 최근에는 AS-PCR에 형광체를 사용한 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR, LGC Biosearch Technologies, Teddington, UK) 및 PACE(PCR Allele Competitive Extension, Integrated DNA Technologies, Inc.) 방법이 보고되었으며, 형광공명에너지 전달(FRET)을 사용하여 유전자의 변이를 검출한다(Ruslan Kalendar et al., 2022).

3' 말단 근처에서 특이성을 갖는 프라이머를 사용한 AS-PCR 방법에 가장 큰 기술적 한계는 핵산중합효소의 교정(Proofreading) 기능에 있다. 일반적으로 핵산 중합효소의 엑소 뉴클라아제 활성은 DNA 복제과정에서 잘못된 염기의 중합을 교정하여 DNA 복제의 높은 정확도를 제공하나, 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하는 경우네는 3' 말단 부분의 미스매치 염기가 제거되어, 프라이머와 완전한 혼성화를 갖지 않는 야생형 유전자를 주형으로 하여 프라이머 말단이 신장되어 위양성 신호를 발생시키는 문제가 있다(Zhang, J. et al., Mol. Biotechnol., 24:105, 2003). 기존에 사용화된 변이 검출 키트(예, AmoyDx EGFR 29 Mutations Detection Kit, Roche)는 이러한 위양성 신호를 제거하기 위해, 야생형만을 증폭시키는 내부 대조군(Internal control) 또는 별도의 튜브를 배정한 외부 대조군(External Control)을 추가로 사용하여, Ct 값의 차이(대조군 Ct - 실험군 Ct = △ Ct)를 컷오프 값으로 변이를 검출하기 때문에, 비용적, 시간적으로 비효율적인 문제가 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해, 프라이머의 3' 말단의 염기 또는 결합을 변형하여 3'->5' 엑소 뉴클라아제 활성에 저항을 갖도록 하는 변형 프라이머가 대안으로 제안되었다. 예를 들어 3' 말단의 인산다이에스터 결합의 변형(예, 포스포로시오에이트 결합, inverted dT 등), 뉴클레오티드의 당 변형(예, Ribo 핵산, 2'-OMe, 2'-MethoxyMe 등)을 적용한 프라이머가 제안되어 엑소 뉴클레아제 활성에 의한 위양성 신호가 다소 감소하는 경향을 보였으나, 중합효소마다 갖는 구조적 유연성의 차이, 교정 활성의 차이, 효소와 템플릿 간의 소수성 및 base- stacking 상호작용 등을 원인으로 여전히 염기의 미스매치를 무시하고 신장하여 위양성 신호를 나타내는 것으로 보고된다 (S.Kwok et al., Nucleic acids Research, Vol 18, No4).

이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 표적 핵산을 보다 특이적으로 증폭시킬 수 있는 신규한 프라이머를 개발하기 예의 노력한 결과, 프라이머의 3' 말단의 특정 위치 범위에서 염기를 범용 염기(universal base)로 치환하는 경우, 프라이머와 핵산간의 워블 염기쌍(wobble base pair)로 인해 표적 핵산만을 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 확인하였으며, 나아가 기존의 프라이머보다 높은 특이도와 민감도로 유전자 변이체를 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 표적 핵산을 특이적으로 증폭 가능한 신규한 변형 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산의 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 핵산에 상보적인 서열을 포함하고, 3'-말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 하나 이상의 핵산의 염기(base)가 범용 염기(universal base)로 치환된, 표적 핵산의 검출용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산의 검출 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 올리고튜클레오티드의 표적 핵산의 검출용 조성물 또는 키트의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 시료에 상기 올리고뉴클레오티드 및 핵산중합효소를 첨가하여 핵산 중합 반응을 수행하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산의 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명은 기존의 대립 유전자 특이적 핵산 증폭 방법에서 사용되는 프라이머와 주형 핵산이 완전히 혼성화되지 않는 경우에도, 핵산중합효소의 구조적 유연성, 교정 활성, 주형핵산과 핵산중합효소의 상호작용 등에 의해 증폭되어 위양성 신호를 발생시켰던 단점을 해결하여, 완전히 혼성화되는 표적 핵산을 특이적으로 증폭시키면서도, 미스매치가 존재하는 핵산을 증폭시키지 않아 보다 정확한 검출이 가능하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유사서열이 존재하는 경우에도 표적 핵산을 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있으며, 나아가 유전자 맵핑, 유전자 분석, 돌연변이 검출뿐만 아니라, 바이오마커를 활용한 진단/동반 진단 및 약물반응성 예측, 예후예측과 같은 의료분야에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 특징을 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 2는 종래기술 대비 본 발명의 기술적 차이를 개략적으로 나타낸 그림이다.
도 3은 KRAS G12C를 증폭 표적으로 종래기술과 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭한 결과를 비교하여 나타낸 결과이다. 도 3의 표는 증폭 산물의 특정 Cut off를 기준으로 임계 사이클(Ct)을 나타낸 것이다.
도 4는 EGFR L858R를 증폭 표적으로 종래기술과 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭한 결과를 비교하여 나타낸 결과이다. 도 4의 표는 증폭 산물의 특정 Cut off를 기준으로 임계 사이클(Ct)을 나타낸 것이다.
도 5는 BRAF V600E를 증폭 표적으로 종래기술과 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭한 결과를 비교하여 나타낸 결과이다. 도 5의 표는 증폭 산물의 특정 Cut off를 기준으로 임계 사이클(Ct)을 나타낸 것이다.
도 6은 EGFR 19 Deletion 및 EGFR C797S 변이체를 특이적으로 증폭하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 동시에 사용한 다중 실시간 중합효소반응을 통해 표적 핵산을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 EGFR T790M, EGFR L861Q, EGFR G719X(G719A) 변이체를 특이적으로 증폭하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 동시에 사용한 다중 실시간 중합효소반응을 통해 표적 핵산을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 EGFR 20 Insertion 변이체를 특이적으로 증폭하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용한 실시간 중합효소반응을 통해 표적 핵산을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도면 9. EGFR L858R, EGFR S768I 변이체를 특이적으로 증폭하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 동시에 사용한 다중 실시간 중합효소반응을 통해 표적 핵산을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 기존의 대립 유전자 특이적 프라이머가 주형 가닥이 미스매치를 갖는 경우에도 교정 또는 이를 무시하고 증폭되어 위양성 신호를 발생시키는 기술적 문제를 해결하고자, 미스매치를 포함하는 유전자는 증폭시키지 않으면서도, 완전히 혼성화되는 표적 핵산을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 신규한 프라이머 플랫폼 및 검출 방법을 개발하였다.

본 발명의 실시예에서는 프라이머의 3'-말단의 2번째 내지 4번째 핵산의 염기(base) 중 어느 하나 이상을 범용 염기(universal base)로 치환하여, 워블 염기쌍(wobble base pair)를 형성시키는 경우, 야생형과 프라이머 간의 혼성화시 발생하는 3' 말단의 미스매치 부분의 이중가닥 결합을 불안정하게 하여 증폭되지 않고, 표적 핵산(예, 유전자 변이체)만을 특이적으로 증폭시켜 보다 위양성 신호없이 보다 높은 정확도로 유전자 변이체를 검출할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 표적 핵산에 상보적인 서열을 포함하고, 3'-말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 하나 이상의 핵산의 염기(base)가 범용 염기(universal base)로 치환된, 표적 핵산의 검출용 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 용어, '상보적인 핵산'은 왓슨-크릭 염기쌍 법칙에 따라 상호 수소 결합으로 혼성화 가능한 염기를 갖는 핵산을 의미한다. 상기 왓슨-크릭 염기쌍은 아데닌과 티민, 구아닌과 시토신, 아데닌과 우라실, 또는 이와 유사한 염기 유사체 사이의 쌍을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산의 검출용 올리고 뉴클레오타이드는 3' 말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 하나 이상의 핵산의 염기가 범용 염기(universal base)으로 치환된 핵산을 포함하여 워블 염기쌍(wobble base pair)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 '범용 염기(universal base)'는 자연적으로 발생하는 5개의 DNA/RNA 염기(A, T, G, C, U)와 상보적으로 수소결합을 형성할 수 있는 뉴클레오티드 유사체를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 범용 염기는 자연적으로 발생하는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 5개의 염기 모두와 상보적으로 수소결합을 형성할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 범용 염기는 주형 가닥의 핵산과 워블 염기쌍(wobble base pair)를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 용어, '워블 염기쌍'은 자연적으로 발생하는 5개의 DNA/RNA 염기(A, T, G, C, U) 사이의 왓슨-크릭 염기쌍 법칙을 따르지 않는 염기쌍을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 범용 염기에 의해 형성되는 워블 염기쌍(wobble base pair)은 왓슨-크릭 염기쌍에 비해 낮은 결합력을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 상기 범용 염기에 의해 형성되는 워블 염기쌍(wobble base pair)은 왓슨-크릭 염기쌍에 비해 낮은 Tm 값을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 기술분야에서, 상기 범용 염기의 다양한 종류가 잘 알려져 있으며, 통상의 기술자는 공지된 본 발명의 작동원리를 고려하여 범용 염기들을 본 발명의 표적 핵산 검출용 올리고뉴클레오티드에 적용할 수 있다(예, David Loakes, Nucleic Acids Research, 2001, Vol.29, No 12, 2437-2447). 예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 범용 염기는 니트로인돌, 니트로파이롤, 니트로아졸, 이노신, 디아미노퓨린(2,6-aminopurine), XNA, N4 에틸시토신 및 이들의 유사체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 5-니트로인돌을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 범용 염기는 3'-말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 하나 이상의 위치에 존재한다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 3'-말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 어느 하나의 핵산의 염기가 범용 염기로 치환될 수 있으며, 가장 바람직한 예로, 실시예에서는 3'-말단으로부터 3번째 핵산의 염기를 치환하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, '핵산은 뉴클레오티드(예, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 등) 또는 이의 중합체를 의미하며, 예를 들어, DNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, PNA 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 선형, 가지형, 또는 루프형 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 핵산은 전형적으로 단일가닥 또는 이중가닥이며, 일반적으로 포스포다이에스테르 결합에 의해 연결되나, 경우에 따라 포스포아마이드, 포스포로티오에이트 등의 대체 백본을 갖는 핵산 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, '표적 핵산'은 검출하고자 하는 서열을 포함하는 핵산을 의미한다.

본 발명에 의하여 검출 가능한 표적 핵산은 모든 종류의 서열 또는 유전자 변이체일 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 핵산은 바이오마커 유전자, 병원성 박테리아 및/또는 바이러스의 특정 유전자형, 특정 질환의 진단, 약제 내성 또는 예후 예측을 위한 바이오마커 또는 이들의 변이체일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여, 단일 뉴클레오티드 변이(SNV), 삽입, 결실 등의 다양한 변이를 갖는 유전자 변이체를 야생형 유전자와 구분하여 특이적으로 증폭시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산은 유전자 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어, '유전자'는 생물학적 기능과 관련된 DNA의 모든 부분을 의미하며, 코딩서열 및 비코딩서열(예, 조절 서열 등)을 포함하는 광의의 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 '유전자'는 검출 목적에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 병원성 박테리아 및/또는 바이러스의 특정 유전자형, 특정 질환과 관련된 바이오 마커일 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산은 종양 관련 바이오 마커일 수 있으며, 구체적인 예를 들어 KRAS, APC, BRAF, BRCA1, BRCA2, CDH1, CDKN2A, CTNNB1, beta 1, CYLD1, EGFR, ERBB2, FAM123B, FBXW7, FGFR3, MUC1, FLCN, FLT3, HRAS, IDH1, JAK2, SMCX, MLH1, MSH6, NF1, NF2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK3, PALB2, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RB1, RET, RUNX1, SMAD4, SOCS1, SOX2, STK11, TP53, UTX, VHL 유전자 및 이의 변이체로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산은 또 다른 예를 들어 약재 내성 관련 바이오마커, 감염원의 유전적유형검사(Genotyping)를 위한 표적 유전자 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, '야생형 유전자'는 자연에서 가장 보편적으로 보이거나 또는 임의의 정상이라고 지정된 대립 유전자를 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 KRAS, EGFR, BRAF의 야생형을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, '유전자 변이' 또는 '유전자 변이체'는 유전자를 이루는 핵산의 서열 또는 구조에 변화가 발생한 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 변이체는 하나 이상의 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입, 결실 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자 변이체는 점 돌연변이에 의한 SNP 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서, 상기 표적 핵산은 KRAS G12C 변이형, EGFR L858R 변이형, EGFR 19del 변이형, EGFR C797S 변이형, EGFR T790M 변이형, EGFR L861Q 변이형, EGFR G719X 변이형, , EGFR 20Isertion 변이형, EGFR S768I 변이형, 또는 BRAF V600E 변이형을 대상으로 시험되었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산을 선택적 또는 특이적으로 증폭 가능한 프라이머인 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 상보적으로 혼성화하여, 핵산 중합효소의 존재하에서 표적 핵산을 주형으로 3'-말단이 신장되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어, '프라이머'는 자유 3'-말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 주형 핵산에 혼성화되고 중합효소와 같은 생체 촉매에 의해 사슬 연장 또는 신장을 허용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 용어, '특이적' 또는 '선택적'은 표적과 비표적을 구분할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서와 같이 야생형 유전자와 구분하여 유전자 변이체를 특이적 또는 선택적으로 구분하는 것을 '대립유전자 특이적(allele specific)' 또는 '대립유전자 선택적(allele-selective)'이라 할 수 있다. 일반적으로, '특이적'은 보다 강력한 수준의 '선택성'을 의미하나, 본 명세서에서 표적 핵산의 증폭과 관련하여 사용되는 '특이적 증폭' 또는 '선택적 증폭'은 모두 표적 핵산과 비표적 핵산의 구분 가능한 증폭 결과를 나타내는 것을 포함하는 의미로 사용되며, 바람직하게는 비표적 핵산의 경우 비증폭 또는 감지할 수 없는 수준의 증폭을 나타내는 것을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산이 유전자 변이체인 경우, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 첫번째 핵산은 표적 핵산의 변이 부위에 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 표적 핵산이 하나 이상의 연속된 핵산의 변이를 포함하는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 첫번째 핵산은 표적 핵산의 변이가 시작되는 부위에 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 야생형 유전자와 혼성화되는 경우, 3'-말단이 혼성화된 주형가닥과 미스매치를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단이 혼성화된 주형가닥과 미스매치를 형성하는 경우, 범용 염기에 의한 워블 염기쌍 및 미스매치에 의한 구조적 불안정성으로 인해 핵산중합 반응이 일어나지 않거나, 감지될 수 없는 수준으로 발생하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 본 기술 분야에 잘 알려진 프라이머 길이의 짧은 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드는 5bp 내지 100bp, 바람직하게는 7bp 내지 75bp, 더욱 바람직하게는 10bp 내지 50bp의 길이를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 표적 핵산, 함께 사용되는 중합효소의 활성 온도 등에 따라 적절한 길이가 선택되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성에 저항성을 갖도록 변형된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 기술분야에서, 핵산 중합효소의 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성에 저항성을 갖도록 하는 3' 말단의 염기 또는 백본의 다양한 변형이 잘 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서 사용된 3' 말단의 첫번째 염기의 포스포로티오에이트 변형은 대표적인 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성에 저항성 변형으로, 당업계에 알려진 다양한 변형 방법으로 대체될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 3'->5' 엑소뉴클레아제에 저항성을 갖는 변형은 3' 말단의 핵산의 포스포다이에스터 연결의 변형, 핵산의 당(sugar)의 2`-잔기 변형, 메틸화, 및 inverted dT 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 혼성화되는 경우 핵산 중합효소에 의한 신장이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 3' 잔기의 수산화기가 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이를 위해, 보다 바람직한 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 3' 말단으로부터 적어도 하나 이상의 핵산간의 연결, 바람직하게는 첫번째 또는 두번째 핵산 간의 연결(internucleoside linkage)이 변형된 것을 특징으로 할 수 있다. 엑소뉴클라아제 저항성을 부여하기 위한 핵산간 연결의 변형은 당업계에 잘 알려져 있으며(RSC Chem Biol. 2021 Feb 1; 2(1): 94-150), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoate), 포스포로아미데이트(phosphoramidate), 메틸 포스포네이트(methoyp phosphonate), 페닐포스포네이트(phenyl phosphonate), 아미노메틸 포스포네이트, 아미노페닐 포스포네이트, 또는 포스포노아세테이트(Phosphonoacetate) 등의 연결로 변형될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서, 가장 바람직한 예로써,

표적 핵산에 상보적인 서열을 포함하며,

3'-말단의 첫번째 핵산이 유전자의 변이 부위에 상보적이고,

3'-말단의 첫번째 핵산과 두번째 핵산의 연결이 포스포로티오에이트 연결이며,

두번째 내지 네번째 핵산 중 하나의 핵산의 염기가 범용 염기(바람직하게는 5-니트로인돌)로 치환된, 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서, 다양한 유전자 변이체의 검출을 위해 서열번호 4 내지 6(표적 핵산: KRAS G12C), 13 내지 15(표적 핵산: EGFR L858R), 22 내지 24(표적 핵산: BRAF V600E), 29(EGFR 19del), 33(EGFR C797S), 37(EGFR T790M), 43(EGFR L861Q), 47(EGFR G719A), 49(EGFR 20ins), 54(EGFR S768I)를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있으며, 특히 표적 핵산이 유전자 변이체인 경우에 야생형의 유의미한 증폭 없이 표적 핵산을 특이적으로 증폭할 수 있어, 표적 핵산의 검출용 프라이머로서 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 표적 핵산의 검출용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산의 검출용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 정방향 또는 역방향 프라이머로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 프라이머의 방향성은 표적 핵산에 따라 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산이 센스가닥인 경우 정방향 프라이머로, 안티센스 가닥인 경우 역방향 프라이머로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 본 발명의 표적 핵산의 다른 부위에 결합하는 프라이머, 프로브, 핵산 중합효소 및/또는 dNTP를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 중합효소는 DNA 중합효소를 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 검출용 조성물 또는 키트는 다중 표적 핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 검출방법은 시료에 본 발명의 표적 핵산의 검출용 조성물을 첨가하여 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 검출방법은

a) 핵산을 포함하는 시료에 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 혼성화하는 단계; 및

b) 혼성화된 핵산에 핵산 중합효소 및 dNTP를 첨가하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 핵산을 포함하며, 보다 바람직하게는 표적 핵산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 대상체로부터 분리된 유전자를 포함하는 검체 또는 샘플인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대상체는 예를 들어 인간을 포함하는 동물, 식물, 균, 또는 바이러스 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 핵산을 포함하는 대상이라면 제한 없이 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭 단계는 당업계에 공지된 다양한 유전자 증폭 방법을 제한 없이 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 표적 핵산이 유전자 변이체인 경우, 상기 증폭 단계는 대립 유전자 특이적 PCR을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 표적 핵산의 검출용 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 조성물 또는 키트 및 이를 사용한 표적 핵산의 검출 방법은 표적 핵산의 검출이 필요한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 조성물 및/키트는 특정 질환의 바이오마커 유전자 또는 이의 변이체를 검출하기 위해 사용될 수 있으며, 이를 통해 질환의 발병 가능성 예측, 진단, 예후 예측, 약물 반응성 예측 등에 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. KRAS G12C 돌연변이 검출능 비교

실시예 1-1. 돌연변이 검출에 사용되는 올리고머(프라이머, 프로브) 합성

KRAS(Kirsten rat sarcoma virus) G12C 돌연변이(G>T)에 대한 검출능을 종래기술과 비교하기 위하여 정방향 프라이머(Forward Primer)를 하기 표 1에서와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)사에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 종래기술의 경우 돌연변이 서열만 정상유전자와 구별하는 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응(Allele specific PCR)과 대립유전자 특이적 프라이머 백본(Backbone)에 포스포로티오에이트(Phosphorothioate)를 수정(Modification)한 것 두 종류를 함께 제조하였고 서열에 “(PS)”로 표기하였다. 본 발명에 따른 5-나이트로인돌의 경우는 대체한 서열에 “/i5NitInd/”로 각각 표기하였다. 또한 공통으로 사용되는 프로브(Probe)및 역방향 프라이머(Reverse Primer)는 하기 표 2와 같다.

분류	명칭	염기서열(5' > 3')	비고
종래기술1	T1_G12C_F	AACTTGTGGTAGTTGGAGCT T	서열번호 1
종래기술2	T2_G12C_F	AACTTGTGGTAGTTGGAGCT(PS) T	서열번호 2
발명1.P5	I1_G12C_P5_F	AACTTGTGGTAGTTGG/i5NitInd/GCT(PS) T	서열번호 3
발명2.P4	I2_G12C_P4_F	AACTTGTGGTAGTTGGA/i5NitInd/CT(PS) T	서열번호 4
발명3.P3	I3_G12C_P3_F	AACTTGTGGTAGTTGGAG/i5NitInd/T(PS) T	서열번호 5
발명4.P2	I4_G12C_P2_F	AACTTGTGGTAGTTGGAGC/i5NitInd/(PS) T	서열번호 6

분류	명칭	염기서열(5' > 3')	비고
프로브	U_KRASG12C_P	FAM-GCCTTGACGATACAGCTAATTCAG-BHQ1	서열번호 7
역방향 프라이머	U_KRASG12C_R	TTGTTGGATCATATTCGTCCAC	서열번호 8

실시예 1-2. 돌연변이 cDNA 합성 및 실험용 표적 핵산 제조

돌연변이 검출능 비교를 위한 표적 핵산을 IDT에 의뢰하여 하기 표 3과 같이 cDNA 형태로 합성하였다.

KRAS G12C 돌연변이 서열(G>T)

1134 Base pair

TTAGAGGTGGGGGTCCACTAGGAAAACTGTAACAATAAGAGTGGAGATAGCTGTCAGCAACTTTTGTGAGGGTGTGCTACAGGGTGTAGAGCACTGTGAAGTCTCTACATGAGTGAAGTCATGATATGATCCTTTGAGAGCCTTTAGCCGCCGCAGAACAGCAGTCTGGCTATTTAGATAGAACAACTTGATTTTAAGATAAAAGAACTGTCTATGTAGCATTTATGCATTTTTCTTAAGCGTCGATGGAGGAGTTTGTAAATGAAGTACAGTTCATTACGATACACGTCTGCAGTCAACTGGAATTTTCATGATTGAATTTTGTAAGGTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT T GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGTAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTCTGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAAATGTACCTTGGGTTTCAAGTTATATGTAACCATTAATATGGGAACTTTACTTTCCTTGGGAGTATGTCAGGGTCCATGATGTTCACTCTCTGTGCATTTTGATTGGAAGTGTATTTCAGAGTTTCGTGAGAGGGTAGAAATTTGTATCCTATCTGGACCTAAAAGACAATCTTTTTATTGTAACTTTTATTTTTATGGGTTTCTTGGTATTGTGACATCATATGTAAAGGTTAGATTTAATTGTACTAGTGAAATATAATTGTTTGATGGTTGATTTTTTTAAACTTCATCAGCAGTATTTTCCTATCTTCTTCTCAACATTAGAGAACCTACAACTACCGGATAAATTTTACAAAATGAATTATTTGCCTAAGGTGTGGTTTATATAAAGGTACTATTACCAACTTTACCTTTGCTTTGTTGTCATT (서열번호9)

*변이 부위를 및줄로 표시함

야생형 표적 핵산은 로슈(Roche, 스위스)사의 Human Genomic DNA from human blood (buffy coat) (Cat. 11691112001) 제품을 구매하여 사용하였다. 상기에서 확보된 야생형 표적 핵산과 합성된 돌연변이 cDNA 표적 핵산(서열번호9)을 2x10³ copies/㎕의 농도로 각각 준비하여 하기 표 4의 비율로 혼합하여 5%, 1%, 0.1%, 0%(W)가 각각 함유되도록 샘플을 제작하였다.

돌연변이율	야생형DNA (ratio)	돌연변이형 DNA(ratio)
W (0%)	100	0
Mt 5%	95	5
Mt 1%	99	1
Mt 0.1%	99.9	0.1

실시예 1-3. 실시간 중합효소 연쇄반응을 위한 혼합액 제조

실험을 위해 서열번호 1~6의 정방향 프라이머가 1 pmol/㎕, 서열번호 7의 프로브가 1 pmol/㎕, 서열번호 8의 역방향 프라이머가 1 pmol/㎕이 되도록 표 5와 같이 6 종류에 대한 올리고머 혼합액을 각각 제조하였다.

항목	종래기술 1	종래기술2	발명1	발명2	발명3	발명4
정방향프라이머	서열번호 1	서열번호 2	서열번호 3	서열번호 4	서열번호 5	서열번호 6
프로브	서열번호 7	서열번호 7	서열번호 7	서열번호 7	서열번호 7	서열번호 7
역방향프라이머	서열번호 8	서열번호 8	서열번호 8	서열번호 8	서열번호 8	서열번호 8

또한 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 표 6과 같이 실시간 중합효소 연쇄반응 혼합액을 제조하였다. PCR 2X Premix 항목은 래피젠 바이올로지칼스(Rapigen Biologicals, 한국)사의 HK HKGampTM 2X Multiplex Real-time PCR Master Mix (for Probe)(Cat.62050) 제품을 사용하였다.

항목	용량(㎕)
PCR 2X Premix	10
올리고머 혼합액	5
표적 핵산	5
총	20

실시예 1-4. 각 혼합액의 검출능 비교

각 혼합액의 검출능을 비교하기 위하여 표 7의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 수행에는 바이오라드(Bio-Rad, 미국)사의 CFX96TM Real-time PCR System을 사용하였다.

온도(℃)	시간(분:초)	반복
95	05:00
98	00:10	40 회
60	00:20	40 회

종래기술과 발명기술의 비교를 위하여 각 혼합액을 표적 핵산의 돌연변이 함유량별로 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 종래기술 1과 2에서 모두 0.1%의 돌연변이 샘플과 돌연변이 0%의 야생형 샘플의 신호가 구분이 되지 않음을 확인하였다(도 3).

반면 발명 1에서는 돌연변이 0.1% 샘플과 야생형 샘플의 신호가 구분되기 시작하고, 발명 2~4 에서는 야생형 샘플의 신호가 완전히 억제되어 0.1% 신호가 잘 검출됨을 확인하였다.

실시예 2. EGFR L858R 돌연변이 검출능 비교

실시예 2-1. 돌연변이 검출에 사용되는 올리고머(프라이머, 프로브) 합성

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) L858R 돌연변이(T>G)에 대한 검출능을 종래기술과 비교하기 위하여 정방향 프라이머(Forward Primer)를 하기 표 8에서와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)사에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 종래기술의 경우 돌연변이 서열만 정상유전자와 구별하는 대립유전자 특이적 PCR(Allele specific PCR)과 대립유전자 특이적 PCR 프라이머 백본(Backbone)에 포스포로티오에이트(Phosphorothioate)를 수정(Modification)한 것 두 종류를 함께 제조하였고 서열에 “(PS)”로 표기하였다. 본 발명에 따른 5-나이트로인돌의 경우는 대체한 서열에 “/i5NitInd/”로 각각 표기하였다. 또한 공통으로 사용되는 프로브(Probe)및 역방향 프라이머(Reverse Primer)가 하기 표 9와 같이 제조되었다.

분류	명칭	염기서열(5' > 3')	비고
종래기술1	T1_L858R_F	GTCAAGATCACAGATTTTGGGC G	서열번호 10
종래기술2	T2_L858R_F	GTCAAGATCACAGATTTTGGGC(PS) G	서열번호 11
발명1.P5	I1_L858R_P5_F	GTCAAGATCACAGATTTT/i5NitInd/GGC(PS) G	서열번호 12
발명2.P4	I2_L858R_P4_F	GTCAAGATCACAGATTTTG/i5NitInd/GC(PS) G	서열번호 13
발명3.P3	I3_L858R_P3_F	GTCAAGATCACAGATTTTGG/i5NitInd/C(PS) G	서열번호 14
발명4.P2	I4_L858R_P2_F	GTCAAGATCACAGATTTTGGG/i5NitInd/(PS) G	서열번호 15

분류	명칭	염기서열(5' > 3')	비고
프로브	U_L858R_P	HEX-AGGAGGTGGCTTTAGGTCAG-BHQ1	서열번호 16
역방향프라이머	U_L858R_R	CAATACAGCTAGTGGGAAGGC	서열번호 17

실시예 2-2. 돌연변이 cDNA 합성 및 실험용 표적 핵산 제조

돌연변이 검출능 비교를 위한 표적 핵산을 IDT에 의뢰하여 하기 표 10과 같이 cDNA 형태로 합성하였다.

EGFR L858R 돌연변이 서열(T>G)

630 Base pair

ACGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC G GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTAACACATGCAGGGGAGGATGCTCTCCAGACATTCTGGGTGAGCTCGCAGCAGCTGCTGCTGGCAGCTGGGTCCAGCCAGGGTCTCCTGGTAGTGTGAGCCAGAGCTGCTTTGGGAACAGTACTTGCTGGGACAGTGAATGAGGATGTTATCCCCAGGTGATCATTAGCAAATGTTAGGTTTCAGTCTCTCCCTGCAGGATATATAAGTCCCCTTCAATAGCGCAATTGGGAAAGGTCACAGCTGCCTTGGTGGTCCACTGCTGTCAAGGACACCTAAGGAACAGGAAAGGCC (서열번호18)

*변이 부위를 및줄로 표시함

야생형 표적 핵산은 로슈(Roche, 스위스)사의 Human Genomic DNA from human blood (buffy coat) (Cat. 11691112001) 제품을 구매하여 사용하였다. 상기에서 확보된 야생형 표적 핵산과 합성된 돌연변이 cDNA 표적 핵산(서열번호18)을 2x10³ copies/㎕의 농도로 각각 준비하여 하기 표 11의 비율로 혼합하여 5%, 1%, 0.1%, 0%(W)가 각각 함유되도록 샘플을 제작하였다.

실시예 2-3. 실시간 중합효소 연쇄반응을 위한 혼합액 제조

실험을 위해 서열번호 10~15의 정방향 프라이머가 1 pmol/㎕, 서열번호 16의 프로브가 1 pmol/㎕, 서열번호 17의 역방향 프라이머가 1 pmol/㎕이 되도록 표 12와 같이 6종류에 대한 올리고머 혼합액을 각각 제조하였다.

항목	종래기술 1	종래기술2	발명1	발명2	발명3	발명4
정방향프라이머	서열번호 10	서열번호 11	서열번호 12	서열번호 13	서열번호 14	서열번호 15
프로브	서열번호 16	서열번호 16	서열번호 16	서열번호 16	서열번호 16	서열번호 16
역방향프라이머	서열번호 17	서열번호 17	서열번호 17	서열번호 17	서열번호 17	서열번호 17

또한 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 표 13과 같이 실시간 중합효소 연쇄반응 혼합액을 제조하였다. PCR 2X Premix 항목은 래피젠 바이올로지칼스(Rapigen Biologicals, 한국)사의 HK HKGampTM 2X Multiplex Real-time PCR Master Mix (for Probe)(Cat.62050) 제품을 사용하였다.

실시예 2-4. 각 혼합액의 검출능 비교

각 혼합액의 검출능을 비교하기 위하여 표14의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 수행에는 바이오라드(Bio-Rad, 미국)사의 CFX96TM Real-time PCR System을 사용하였다.

온도(℃)	시간(분:초)	반복
95	05:00
98	00:10	40 회
60	00:20	40 회

종래기술과 발명기술의 비교를 위하여 각 혼합액을 표적 핵산의 돌연변이 함유량별로 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 종래기술 1과 2에서 모두 0.1%의 돌연변이 샘플과 돌연변이 0%의 야생형 샘플의 신호가 구분이 되지 않음을 확인하였다(도 4).

실시예 3. BRAF V600E 돌연변이 검출능 비교

실시예 3-1. 돌연변이 검출에 사용되는 올리고머(프라이머, 프로브) 합성

BRAF(B type raf kinase) V600E 돌연변이(T>A)에 대한 검출능을 종래기술과 비교하기 위하여 정방향 프라이머(Forward Primer)를 하기 표 15에서와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)사에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 종래기술의 경우 돌연변이 서열만 정상유전자와 구별하는 대립유전자 특이적 PCR(Allele specific PCR)과 대립유전자 특이적 PCR 프라이머 백본(Backbone)에 포스포로티오에이트(Phosphorothioate)를 수정(Modification)한 것 두 종류를 함께 제조하였고 서열에 “(PS)”로 표기하였다. 본 발명에 따른 5-나이트로인돌의 경우는 대체한 서열에 “/i5NitInd/”로 각각 표기하였다. 또한 공통으로 사용되는 프로브(Probe)및 역방향 프라이머(Reverse Primer)가 하기 표 16과 같이 제조되었다.

분류	명칭	염기서열(5' > 3')	비고
종래기술1	T1_V600E_F	TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG A	서열번호 19
종래기술2	T2_V600E_F	TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG(PS) A	서열번호 20
발명1.P5	I1_V600E_P5_F	TAGGTGATTTTGGTCTAGCT/i5NitInd/CAG(PS) A	서열번호 21
발명2.P4	I2_V600E_P4_F	TAGGTGATTTTGGTCTAGCTA/i5NitInd/AG(PS) A	서열번호 22
발명3.P3	I3_V600E_P3_F	TAGGTGATTTTGGTCTAGCTAC/i5NitInd/G(PS) A	서열번호 23
발명4.P2	I4_V600E_P2_F	TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA/i5NitInd/(PS) A	서열번호 24

분류	명칭	염기서열(5' > 3')	비고
공통프로브	U_V600E_P	Quasar705-CAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCA-BHQ3	서열번호 25
공통리버스프라이머	U_V600E_R	TAGTAACTCAGCAGCATCTCAGG	서열번호 26

실시예 3-2. 돌연변이 cDNA 합성 및 실험용 표적 핵산 제조

BRAF V600E 돌연변이 서열(T>A)

1448 Base pair

ACATTACAAGAAAATCTATCAGAAGTCTTTACAATAGTAGGAGTTTTTGATTGCTTGCTTACATTTTATCAGCACTATAAAACTGATAGTTTTGTAGCTATCTATTAGTCCCTTTCAGACCTCTGACCTTGCTCAGTGGTAGTTGAGATATAACTGAAGACTCTAAATTATATAACAATGAGGTGAGAAAAACATAATATTTCTCTTCCCTAAGTGCAGACTAAGATACTATCTGCAGCATCTTCATTCCAATGAAGAGCCTTTACTGCTCGCCCAGGAGTGCCAAGAGAATATCTGGGCCTACATTGCTAAAATCTAATGGGAAAGTTTTAGGTTCTCCTATAAACTTAGGAAAGCATCTCACCTCATCCTAACACATTTCAAGCCCCAAAAATCTTAAAAGCAGGTTATATAGGCTAAATAGAACTAATCATTGTTTTAGACATACTTATTGACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTACTATGTTTTAAAGAATATTATATTACAGAATTATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG A GAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAGTATTCACAAAAATCAGTGTTCTTATTTTTTATGTAAATAGATTTTTTAACTTTTTTCTTTACCCTTAAAACGAATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAACAAAAATATATGTCTTATAAACAGTGTTTCATATTTTATTCTTAAATAAATATGAACCCTTAAAACGAATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAACAAAAATATATGTCTTATAAACAGTGTTTCATATTTTATTCTAAATTGTTTAAAGTATTTTGTGTTCAAAATGTTCTGTGTACCCTGTTGAAAAAAAAAACAGGTATGCAATTTAAGGCAGGTGTGATCCACAGCCATTATTATGGTTTTGCTAAGAGAACTACTCCTTTTAACAGAGAAGCTGTTTCGCAATCTTATTTAAGCCTAAATTGGAAAGTTACTTCCTTTAGACTAGAAAGTATCTCATAATTATGGGGCAGCTGGAAGAGGAAAGACAAAAAAAAATGAGAGGTAGATTAACAGCCTTGTGCTGTCTTGCATAGCTCTTTCTTTCTTCTTGTTTTTTGCTTTGTGGAAAAGAAGAAAGAGAAGTTCTAAAAGAAGGGAACAAAAACTTGTGTGCATTGCAGCAAG (서열번호27)

*변이 부위를 및줄로 표시함

야생형 표적 핵산은 로슈(Roche, 스위스)사의 Human Genomic DNA from human blood (buffy coat) (Cat. 11691112001) 제품을 구매하여 사용하였다. 상기에서 확보된 야생형 표적 핵산과 합성된 돌연변이 cDNA 표적 핵산(서열번호27)을 2x10³ copies/㎕의 농도로 각각 준비하여 하기 표 18의 비율로 혼합하여 5%, 1%, 0.1%, 0%(W)가 각각 함유되도록 샘플을 제작하였다.

실시예 3-3. 실시간 중합효소 연쇄반응을 위한 혼합액 제조

실험을 위해 서열번호19~24의 정방향 프라이머가 1 pmol/㎕, 서열번호25의 프로브가 1 pmol/㎕, 서열번호26의 역방향 프라이머가 1 pmol/㎕이 되도록 표 19와 같이 6종류에 대한 올리고머 혼합액을 각각 제조하였다.

항목	종래기술 1	종래기술2	발명1	발명2	발명3	발명4
정방향프라이머	서열번호 19	서열번호 20	서열번호 21	서열번호 22	서열번호 23	서열번호 24
프로브	서열번호 25	서열번호 25	서열번호 25	서열번호 25	서열번호 25	서열번호 25
역방향프라이머	서열번호 26	서열번호 26	서열번호 26	서열번호 26	서열번호 26	서열번호 26

또한 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 표 20과 같이 실시간 중합효소 연쇄반응 혼합액을 제조하였다. PCR 2X Premix 항목은 래피젠 바이올로지칼스(Rapigen Biologicals, 한국)사의 HK HKGampTM 2X Multiplex Real-time PCR Master Mix (for Probe)(Cat.62050) 제품을 사용하였다.

실시예 3-4. 각 혼합액의 검출능 비교

각 혼합액의 검출능을 비교하기 위하여 표 21의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 수행에는 바이오라드(Bio-Rad, 미국)사의 CFX96TM Real-time PCR System을 사용하였다.

온도(℃)	시간(분:초)	반복
95	05:00
98	00:10	40 회
60	00:20	40 회

종래기술과 발명기술의 비교를 위하여 각 혼합액을 표적 핵산의 돌연변이 함유량별로 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 종래기술 1과 2에서 모두 0.1%의 돌연변이 샘플과 돌연변이 0%의 야생형 샘플의 신호가 구분이 되지 않음을 확인하였다(도 5).

실시예 4. EGFR 돌연변이 검출 키트 제조 및 종래 기술과의 비교

실시예 4-1. 키트제조 및 검출에 사용되는 올리고머(프라이머, 프로브) 합성

본 발명의 기술을 이용하여 EGFR 돌연변이 8 타겟을 검출할 수 있는 키트를 제조하고, 이를 종래기술의 프라이머와 비교하기 위해 표 22와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)사에 의뢰하여 프라이머, 프로브를 제조하였다.

검출 표적	원재료명	염기서열(5’ > 3’)	비고
E19del (Deletion)	E19del-T-F	AAAATTCCCGTCGCTATCAA(PS) A	서열번호28
	E19del-F	AAAATTCCCGTCGCTATC/i5NitInd/A(PS) A	서열번호29
	E19del-P	HEX-GAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGG-BHQ1	서열번호30
	E19del-R	GGGAGTTATACCCACTAGAGC	서열번호31
C797S (G>C)	C797S1-T-F	GCAGCTCATGCCCTTCGGCT(PS) C	서열번호32
	C797S1-T	GCAGCTCATGCCCTTCGG/i5NitInd/T(PS) C	서열번호33
	C797S1-P	Quasar705-GCTCCCAGTACCTGCTCAA-BHQ3	서열번호34
	C797S1-R	CCTTCCCTGATTACCTTTGCGATC	서열번호35
T790M (CC> T G)	T790M-T-F	CCACCGTGCAGCTCATCA(PS) T	서열번호36
	T790M-T	CCACCGTGCAGCTCAT/i5NitInd/A(PS) T	서열번호37
	T790M-P	FAM-TGCCTCCTGGACTATGTCC-BHQ1	서열번호38
	T790M-R	CTTTGCGATCTGCACACACC	서열번호39
L861Q (T>A) Antisense (A>T)	L861Q-T-R	TCTTTCTCTTCCGCACCCAGC(PS) T	서열번호40
	L861Q-T	CTCAGAGCCTGGCATGAAC	서열번호41
	L861Q-P	Cy5-CGCAGCATGTCAAGATCACAG-BHQ2	서열번호42
	L861Q-R	TCTTTCTCTTCCGCACCCA/i5NitInd/C(PS) T	서열번호43
G719A (G>C) Antisense (C>G)	G719A-T-R	CCGTGCCGAACGCACCGGAG(PS) G	서열번호44
	G719A-T	GCCTCTTACACCCAGTGGAGAAG	서열번호45
	G719A-P	HEX-GCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGA-BHQ1	서열번호46
	G719A-R	CCGTGCCGAACGCACCGG/i5NitInd/G(PS) G	서열번호47
E20ins (Insertion)	E20ins-T-F	TACGTGATGGCCAGCGTGG(PS) C	서열번호48
	E20ins-T	TACGTGATGGCCAGCGT/i5NitInd/G(PS) C	서열번호49
	E20ins-P	FAM-AGCTCATCACGCAGCTCAT-BHQ1	서열번호50
	E20ins-R	TTCCCGGACATAGTCCAGGA	서열번호51
L858R (T>G)	L858R-P	FAM-AGGAGGTGGCTTTAGGTCAG-BHQ1	서열번호52
S768I (TC> AT )	S768I-T-F	GAAGCCTACGTGATGGCC A (PS) T	서열번호53
	S768I-T	GAAGCCTACGTGATGGC/i5NitInd/ A (PS) T	서열번호54
	S768I-P	Quasar705-GCTCATCACGCAGCTCATG-BHQ3	서열번호55
	S768I-R	GATTACCTTTGCGATCTGCACAC	서열번호56

실시예 4-2. 돌연변이 cDNA 합성 및 실험용 표적 핵산 제조

돌연변이 검출능 비교를 위한 표적 핵산을 IDT에 의뢰하여 하기 표 23과 같이 cDNA 형태로 합성하였다.

EGFR Exon 19 Deletion 돌연변이 서열	615 Base pair
GACTTTATAACAGGCTTTACAAGCTTGAGATTCTTTTATCTAAATAATCAGTGTGATTCGTGGAGCCCAACAGCTGCAGGGCTGCGGGGGCGTCACAGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT AAAATTCCCGTCGCTATCAA (Deletion) A ACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATGCTGGTATCCACCCCAAAAGGCTGGAAACAGGCAATTACTGGCATCTACCCAGCACTAGTTTCTTGACACGCATGATGAGTGAGTGCT (서열번호57)
EGFR C797S 돌연변이 서열	630 Base pair
CTTTTGCAGGCACAGCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCAC GCAGCTCATGCCCTTCGGCTC CCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGCGCTCCTGGGATAGCAAGAGTTTGCCATGGGGATATGTGTGTGCGTGCATGCAGCACACACACATTCCTTTATTTTGGATTCAATCAAGTTGATCTTCTTGTGCACAAATCAGTGCCTGTCCCATCTGCATGTGGAAACTCTCATCAATCAGCTACCTTTGAAGAATTTTCTCTTTATTGAGTGCTCAGTGTGGTCTGATGTCTCTGTTCTTATTTCTCTGGAATTCTTTGTGAAT (서열번호58)
EFGR T790M 돌연변이 서열	740 Base pair
TCTTCATAACAAAGATACTATCAGTTCCCAAACTCAGAGATCAGGTGACTCCGACTCCTCCTTTATCCAATGTGCTCCTCATGGCCACTGTTGCCTGGGCCTCTCTGTCATGGGGAATCCCCAGATGCACCCAGGAGGGGCCCTCTCCCACTGCATCTGTCACTTCACAGCCCTGCGTAAACGTCCCTGTGCTAGGTCTTTTGCAGGCACAGCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCA T GCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGCGCTCCTGGGATAGCAAGAGTTTGCCATGGGGATATGTGTGTGCGTGCATGCAGCACACACACATTCCTTTATTTTGGATTCAATCAAGTTGATCTTCTTGTGCACAAATCAGTGCCTGTCCCATCTGCATGTGGAAACTCTCATCAAT (서열번호59)
EGFR L861Q 돌연변이 서열	630 Base pair
GCTCCTGCTCTTCTTTGTCCTCATATACGAGCACCTCTGGACTTAAAACTTGAGGAACTGGATGGAGAAAAGTTAATGGTCAGCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCTTTCCATTCTTTGGATCAGTAGTCACTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCCTCGACGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAAC A GCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTAACACATGCAGGGGAGGATGCTCTCCAGACATTCTGGGTGAGCTCGCAGCAGCTGCTGCTGGCAGCTGGGTCCAGCCAGGGTCTCCTGGTAGTGTGAGCCAGAGCTGCTTTGGGAACAGTACTTGCTGG (서열번호60)
EGFR G719A 돌연변이 서열	630 Base pair
CTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGG C CTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGGCACAGGCCTCTGGGCTGGGCCGCAGGGCCTCTCATGGTCTGGTGGGGAGCCCAGAGTCCTTGCAAGCTGTATATTTCCATCATCTACTTTACTCTTTGTTTCACTGAGTGTTTGGGAAACTCCAGTGTTTTTCCCAAGTTATTGAGAGGAAATCTTTTATAACCACAGTAATCAGTGGTCCTGTGAGACCAATTCACAGACCAAAGGCATTTTTATGAAAGGGGCCATTGACCTTGCCATGGGGTGCAGCACAGGGCGGGAGGAGGGCCGCCTCTCACCGCACGGCATCAGAATGCAGCCCAGCTGAAATGGGCTCATCTTCGTTTGCTTCTTCTAGATCCTCTTTGCATGAAATCTGATTTCAGTTAGGCCTAGACGCAGCATCATTAAATTCTGGATGAAATGATCCACACGGACTTTATAACAGGCTTTACAAGCTTGAGATTCTTTTATCTAAATAATCAGTGTGATTCGTGGAGCCCAACAGCTGCAGG (서열번호61)
EGFR Exon 20 insertion 돌연변이 서열	698 Base pair
CTCTCTGTCATGGGGAATCCCCAGATGCACCCAGGAGGGGCCCTCTCCCACTGCATCTGTCACTTCACAGCCCTGCGTAAACGTCCCTGTGCTAGGTCTTTTGCAGGCACAGCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGG(Insertion) C CAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGCGCTCCTGGGATAGCAAGAGTTTGCCATGGGGATATGTGTGTGCGTGCATGCAGCACACACACATTCCTTTATTTTGGATTCAATCAAGTTGATCTTCTTGTGCACAAATCAGTGCCTGTCCCATCTGCATGTGGAAACTCTCATCAATCAGCTACCTTTGAAGAATTTTCTCTTTATTGAGTGCTCAGTGTGGTCTG (서열번호62)
EGFR S768I 돌연변이 서열	700 Base pair
AACACAGCATCCTCAACCTTGAGGCGGAGGTCTTCATAACAAAGATACTATCAGTTCCCAAACTCAGAGATCAGGTGACTCCGACTCCTCCTTTATCCAATGTGCTCCTCATGGCCACTGTTGCCTGGGCCTCTCTGTCATGGGGAATCCCCAGATGCACCCAGGAGGGGCCCTCTCCCACTGCATCTGTCACTTCACAGCCCTGCGTAAACGTCCCTGTGCTAGGTCTTTTGCAGGCACAGCTTTTCCTCCATGAGTACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTGCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCC AT CGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGCGCTCCTGGGATAGCAAGAGTTTGCCATGGGGATATGTGTGTGCGTGCATGCAGCACACACACATTCCTTTATTTTGGA (서열번호63)

*변이 부위를 및줄로 표시함

야생형 표적 핵산은 로슈(Roche, 스위스)사의 Human Genomic DNA from human blood (buffy coat) (Cat. 11691112001) 제품을 구매하여 사용하였다. 상기에서 확보된 야생형 표적 핵산과 합성된 돌연변이 cDNA 표적 핵산(서열번호 18,서열번호 57~63, 총 8 타겟)을 2x10³ copies/㎕의 농도로 각각 준비하여 하기 표 24의 비율로 혼합하여 5%, 1%, 0.1%, 0%(W)가 각각 함유되도록 샘플을 제작하였다

실시예 4-3. 실시간 다중 중합효소 연쇄반응을 위한 혼합액 제조

실시간 다중 중합효소 연쇄반응을 위해 4개의 반응 튜브를 위한 혼합액을 각각 제조하였다. 각각의 제1 내지 제4 반응 튜브는 하기 표 25 내지 28과 같이 제조되었으며 종래기술과 발명기술을 비교하기 위해 2 종류씩 제조되었다. 모든 항목은 최종 농도가 각 1 pmol/㎕이 되도록 제조하여 최종 테스트 당 각 항목 5 pmol의 양이 반응에 참여할 수 있도록 하였다.

타겟	항목	종래기술	발명기술
Exon 19 Deletion	정방향 프라미어	서열번호28	서열번호29
	프로브	서열번호30	서열번호30
	역방향 프라이머	서열번호31	서열번호31
C797S	정방향 프라미어	서열번호32	서열번호33
	프로브	서열번호34	서열번호34
	역방향 프라이머	서열번호35	서열번호35

타겟	항목	종래기술	발명기술
T790M	정방향 프라미어	서열번호36	서열번호37
	프로브	서열번호38	서열번호38
	역방향 프라이머	서열번호39	서열번호39
L861Q	정방향 프라미어	서열번호40	서열번호40
	프로브	서열번호42	서열번호42
	역방향 프라이머	서열번호41	서열번호43
G719A	정방향 프라미어	서열번호45	서열번호45
	프로브	서열번호46	서열번호46
	역방향 프라이머	서열번호44	서열번호47

타겟	항목	종래기술	발명기술
Exon 20 insertion	정방향 프라미어	서열번호48	서열번호49
	프로브	서열번호50	서열번호50
	역방향 프라이머	서열번호51	서열번호51

타겟	항목	종래기술	발명기술
L858R	정방향 프라미어	서열번호11	서열번호14
	프로브	서열번호52	서열번호52
	역방향 프라이머	서열번호17	서열번호17
S768I	정방향 프라미어	서열번호53	서열번호54
	프로브	서열번호55	서열번호55
	역방향 프라이머	서열번호56	서열번호56

또한 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위해 표 29와 같이 실시간 중합효소 연쇄반응 혼합액을 제조하였다. PCR 2X Premix 항목은 래피젠 바이올로지칼스(Rapigen Biologicals, 한국)사의 HK HKGampTM 2X Multiplex Real-time PCR Master Mix (for Probe)(Cat.62050) 제품을 사용하였다.

실시예 4-4. 종래기술과의 검출능 비교

각 혼합액의 검출능을 비교하기 위하여 표 30의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 수행에는 바이오라드(Bio-Rad, 미국)사의 CFX96TM Real-time PCR System을 사용하였다.

온도(℃)	시간(분:초)	반복
95	05:00
98	00:30	5회
58	00:20	5회
98	00:10	40 회
60	00:20	40 회

도 6 내지 도 9에 도시된 것과 같이, 모두 종래기술에서는 W(야생형)에 대한 증폭 신호가 검출되어 하기와 같이 별도의 야생형 내부 대조군의 Ct 값을 계산하여 샘플과 내부 대조군의 Ct 값의 차이로 표적 핵산을 검출하여야 한다.

ΔCt 값 = 샘플 Ct 값 - 야생형샘플 Ct 값 (상용화된 키트에서의 계산법)

이러한 종래의 방법은 통과기준(Cut-off)에 따라 검출 가능한 수준이 다를 수 있으며, 0.1% 신호와 WT 신호가 차이나지 않아 검출이 불가능하다. 이는 동일 기술을 사용하여 상용화된 키트에서 제공하는 최소 검출 한계와 유사한 수준이다(0.5% 이상의 최소 검출 한계 제시). 특히, 동시에 다양한 종류의 유전자의 변이체를 다중 검출하고자 하는 경우 각각의 야생형 유전자에 대한 내부 대조군을 각각 시험해야하므로, 시간적, 경제적인 부담이 가중된다.

반면, 발명기술에서는 W(야생형) 신호가 완벽하게 억제되고, 표적 핵산만을 증폭하기 때문에, 내부 대조군 없이도 높은 민감도로 EGFR 돌연변이를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 이는 발명기술을 사용하여 상용화된 키트보다 더 높은 민감도를 확보한 키트가 제공 가능하다는 점을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

표적 핵산에 상보적인 서열을 포함하고, 3'-말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 하나 이상의 핵산의 염기(base)가 범용 염기(universal base)로 치환되고, 3'-말단으로부터 첫번째 핵산은 표적 핵산에 상보적인 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 3'-말단으로부터 2번째 내지 4번째 핵산 중 하나의 핵산의 염기가 범용 염기로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 범용 염기는 니트로인돌, 니트로파이롤, 니트로아졸, 이노신, 디아미노퓨린(2,6-aminopurine), XNA, N4 에틸시토신 및 이들의 유사체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 범용 염기는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 표적 핵산은 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 상기 변이는 하나 이상의 염기의 치환, 삽입 또는 결실인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 첫번째 핵산은 표적 핵산의 변이 부위에 상보적인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단은 3'->5' 엑소뉴클레아제 활성에 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서, 상기 3'-말단으로부터 하나 이상의 핵산의 핵산간 연결이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoate), 포스포로아미데이트(phosphoramidate), 메틸 포스포네이트(methoyp phosphonate), 페닐포스포네이트(phenyl phosphonate), 아미노메틸 포스포네이트, 아미노페닐 포스포네이트, 또는 포스포노아세테이트(Phosphonoacetate) 로 변형된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 3'-말단으로부터 첫번째 및 두 번째 염기의 연결이 포스포로시오에이트 연결로 변형된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 5 bp 내지 100 bp의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산의 검출용 조성물.
제12항에 있어서, 표적 핵산의 다른 부위에 결합하는 프라이머, 프로브, 핵산 중합효소 및/또는 dNTP를 추가로 포함하는 표적 핵산의 검출용 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산의 검출용 키트.
제14항에 있어서, 하나 이상의 표적 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산의 검출용 키트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 표적 핵산의 검출방법.
제16항에 있어서, a) 핵산을 포함하는 시료에 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 혼성화하는 단계; 및
b) 혼성화된 핵산에 핵산 중합효소 및 dNTP를 첨가하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산의 검출방법.