HK40087991B - Methods for targeted nucleic acid sequence enrichment with applications to error corrected nucleic acid sequencing - Google Patents

Claims (15)

1. Verfahren, umfassend:

   Bereitstellen von doppelsträngigem Nukleinsäurematerial, umfassend ein oder mehrere doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, wobei jedes doppelsträngige Nukleinsäuremolekül eine Einzelmolekül-Identifizierungssequenz auf jedem Strang und einen Adapter auf zumindest einem der 5'- und/oder 3'-Enden des Nukleinsäuremoleküls umfasst, und wobei für jedes Nukleinsäuremolekül eine erste Adaptersequenz mit einem ersten Strang assoziiert ist und eine zweite Adaptersequenz mit einem zweiten Strang des Nukleinsäuremoleküls assoziiert ist und wobei der Adapter zumindest eine Nukleotidposition umfasst, die zumindest teilweise nichtkomplementär ist;

   Amplifizieren des Nukleinsäurematerials;

   Trennen des amplifizierten Nukleinsäurematerials in eine erste Probe und eine zweite Probe;

   Amplifizieren des ersten Strangs in der ersten Probe unter Verwendung zumindest eines einzelsträngigen Oligonukleotids, das zumindest teilweise komplementär zu einer Sequenz in der ersten Adaptersequenz ist, und zumindest eines einzelsträngigen Oligonukleotids, das zumindest teilweise komplementär zu einer Zielsequenz von Interesse ist, so dass die Einzelmolekül-Identifizierungssequenz zumindest teilweise beibehalten wird, um ein erstes Nukleinsäureprodukt bereitzustellen;

   Amplifizieren des zweiten Strangs in der zweiten Probe unter Verwendung zumindest eines einzelsträngigen Oligonukleotids, das zumindest teilweise komplementär zu einer Sequenz ist, die in der zweiten Adaptersequenz vorliegt, und zumindest eines einzelsträngigen Oligonukleotids, das zumindest teilweise komplementär zu der Zielsequenz von Interesse ist, so dass die Einzelmolekül-Identifizierungssequenz zumindest teilweise beibehalten wird, um ein zweites Nukleinsäureprodukt bereitzustellen;

   Sequenzieren jedes des ersten Nukleinsäureprodukts und des zweiten Nukleinsäureprodukts; und

   Vergleichen der Sequenz des ersten Nukleinsäureprodukts mit der Sequenz des zweiten Nukleinsäureprodukts.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bereitstellungsschritt Folgendes umfasst: Ligieren eines doppelsträngigen Nukleinsäurematerials an zumindest eine degenerierte oder halbdegenerierte Barcodesequenz, um einen doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül-Barcodekomplex zu bilden, wobei die Barcodesequenz die Einzelmolekül-Identifizierungssequenz umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Barcodesequenz doppelsträngig ist, optional wobei die Einzelmolekül-Identifizierungssequenz vor oder nach der Ligation an ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül einzelsträngig ist und eine komplementäre Einzelmolekül-Identifizierungssequenz durch Verlängern des Gegenstrangs mit einer DNA-Polymerase erzeugt wird, um eine komplementäre doppelsträngige SMI-Sequenz zu erhalten.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Einzelmolekül-Identifizierungssequenz:

   a) zumindest von eines von einer degenerierten oder halbdegenerierten Barcodesequenz, einem oder mehreren Nukleinsäurefragmentenden des Nukleinsäurematerials oder einer Kombination davon ist, die das doppelsträngige Nukleinsäuremolekül eindeutig kennzeichnet; oder

   b) einen endogenen Scherpunkt oder eine endogene Sequenz umfasst, die positionsweise mit dem Scherpunkt in Beziehung gesetzt werden kann.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäurematerial aus einer Probe bereitgestellt wird, die ein oder mehrere doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle umfasst, die von einem Subjekt oder einem Organismus stammen, wobei die Probe ein Körpergewebe, eine Biopsie, Flüssigbiopsie, eine Hautprobe, Blut, Serum, Plasma, Schweiß, Speichel, Liquor, Schleim, Uterusspülungsflüssigkeit, ein Vaginalabstrich, ein Pap-Abstrich, ein Nasenabstrich, ein oraler Abstrich, ein Gewebeabschabsel, Haare, ein Fingerabdruck, Urin , Stuhl, Glaskörperflüssigkeit, Peritonealspülung, Sputum, Bronchialspülung, Oralspülung, Pleuraspülung, Magenspülung, Magensaft, Galle, Pankreasgangspülung, Gallengangspülung, Hauptgallengangspülung, Gallenblasenflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, eine infizierte Wunde, eine nicht infizierte Wunde, eine archäologische Probe, eine forensische Probe, eine Wasserprobe, eine Gewebeprobe, eine Lebensmittelprobe, eine Bioreaktorprobe, eine Pflanzenprobe, eine Bakterienprobe, eine Protozoenprobe, eine Fungusprobe, ein Tierprobe, eine Virusprobe, eine Multi-Organismus-Probe, ein Fingernagelabschabsel, Sperma, Prostataflüssigkeit, Vaginalflüssigkeit, ein Vaginalabstrich, eine Eileiterspülung, eine zellfreie Nukleinsäure, eine Nukleinsäure innerhalb einer Zelle, eine metagenomische Probe, eine Spülung oder ein Abstrich eines implantierten Fremdkörpers, eine Nasenspülung, Darmflüssigkeit, Epithelabbürstung, Epithelspülung, Gewebebiopsie, eine Autopsieprobe, eine Nekropsieprobe, eine Organprobe, eine menschliche Identifizierungsprobe, eine nichtmenschliche Identifizierungsprobe, eine künstlich hergestellte Nukleinsäureprobe, eine synthetische Genprobe, eine eingelagerte oder gelagerte Probe, Tumorgewebe, eine fötale Probe, eine Organtransplantationsprobe, eine mikrobielle Kulturprobe, eine Kern-DNA-Probe, eine mitochondriale DNA-Probe, eine Chloroplasten-DNA-Probe, eine Apicoplasten-DNA-Probe, eine Organellenprobe und eine beliebige Kombination davon ist oder dies umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren vor dem Bereitstellungsschritt Folgendes umfasst:

   Schneiden des Nukleinsäurematerials mit einer oder mehreren zieltgerichtetenen Endonukleasen, so dass ein Zielnukleinsäurefragment mit im Wesentlichen bekannter Länge gebildet wird; und

   Isolieren des Zielnukleinsäurefragments basierend auf der im Wesentlichen bekannten Länge,

   wobei optional die eine oder mehreren zielgerichteten Endonukleasen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem Ribonukleoprotein, einem Cas-Enzym, einem Cas9-ähnlichen Enzym, einer Meganuklease, einer transkriptionsaktivatorähnlichen, effektorbasierten Nuklease (TALEN), einer Zinkfinger-Nuklease, einer Argonauten-Nuklease oder einer Kombination davon besteht,

   wobei optional die eine oder mehreren zielgerichteten Endonukleasen Cas9 oder CPF1 oder ein Derivat davon umfassen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Schneiden des Nukleinsäurematerials Schneiden des Nukleinsäurematerials mit einer oder mehreren zielgerichteten Endonukleasen enthält, so dass mehr als ein Zielnukleinsäurefragmente von im Wesentlichen bekannter Länge gebildet werden, wobei optional die Zielnukleinsäurefragmente jeweils eine genomische Sequenz von Interesse von einer oder mehreren unterschiedlichen Stellen in einem Genom umfassen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei:

   a) die Adaptersequenz sich an jedem der 5'- und 3'-Enden jedes Strangs des Nukleinsäurematerials befinden; und/oder

   b) wobei die nichtkomplementäre Sequenz innerhalb der Adaptersequenz durch einen Adapter bereitgestellt wird, der eine Y-Form umfasst.
9. Verfahren zum Erzeugen eines fehlerkorrigierten Sequenz-Reads eines doppelsträngigen Zielnukleinsäurematerials, umfassend:

   a) Ligieren eines doppelsträngigen Zielnukleinsäurematerials an zumindest eine Adaptersequenz, um einen Adapter-Zielnukleinsäurematerial-Komplex zu bilden, wobei die zumindest eine Adaptersequenz Folgendes umfasst:

   (i) eine degenerierte oder halbdegenerierte Einzelmolekül-Identifizierungs (SMI)-Sequenz, die jedes Molekül des doppelsträngigen Zielnukleinsäurematerials eindeutig kennzeichnet, und

   (ii) eine erste Nukleotid-Adaptersequenz, die einen ersten Strang des Adapter-Zielnukleinsäurematerial-Komplexes markiert, und eine zweite Nukleotid-Adaptersequenz, die zumindest teilweise nichtkomplementär zu der ersten Nukleotidsequenz ist, die einen zweiten Strang des Adapter-Zielnukleinsäurematerial-Komplexes markiert, so dass jeder Strang des Adapter-Zielnukleinsäurematerial-Komplexes eine unzweideutig identifizierbare Nukleotidsequenz relativ zu seinem komplementären Strang aufweist;

   b) Amplifizieren jedes Strangs des Adapter-Zielnukleinsäurematerial-Komplexes, um eine Vielzahl von Adapter-Zielnukleinsäure-Komplex-Amplicons für den ersten Strang und eine Vielzahl von Adapter-Zielnukleinsäure-Komplex-Amplicons für den zweiten Strang zu produzieren, und Trennen der Adapter-Zielnukleinsäure-Komplex-Amplicons in eine erste Probe und eine zweite Probe;

   c) Amplifizieren des ersten Strangs in der ersten Probe durch Verwendung eines ersten Primers, der zumindest teilweise zu der ersten Nukleotid-Adaptersequenz komplementär ist, und eines Primers, der zumindest teilweise zu einer Zielsequenz von Interesse komplementär ist, um ein erstes Nukleinsäureprodukt bereitzustellen;

   d) Amplifizieren des zweiten Strangs in der zweiten Probe durch Verwendung eines zweiten Primers, der zumindest teilweise zu der zweiten Nukleotid-Adaptersequenz komplementär ist, und eines Primers, der zumindest teilweise zu der Zielsequenz von Interesse komplementär ist, um ein zweites Nukleinsäureprodukt bereitzustellen, optional wobei das Verfahren ferner Folgendes enthält:

   e) Sequenzieren jedes des ersten Nukleinsäureprodukts und des zweiten Nukleinsäureprodukts, um eine Vielzahl von Erststrang-Sequenz-Reads und eine Vielzahl von Zweitstrang-Sequenz-Reads zu produzieren, und Bestätigen des Vorhandenseins zumindest eines Erststrang-Sequenz-Reads und zumindest eines Zweitstrang-Sequenz-Reads und optional;

   f) Vergleichen des zumindest einen Erststrang-Sequenz-Reads mit dem zumindest einen Zweitstrang-Sequenz-Read und Erzeugen eines fehlerkorrigierten Sequenz-Reads des doppelsträngigen Zielnukleinsäurematerials durch Nichtberücksichtigen nicht übereinstimmender Nukleotidpositionen oder alternativ Entfernen verglichener Erst- und Zweitstrang-Sequenz-Reads, die eine oder mehrere Nukleotidpositionen aufweisen, an denen die verglichenen Erst- und Zweitstrang-Sequenz-Reads nichtkomplementär sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9(f), wobei das fehlerkorrigierte Sequenz-Read verwendet wird, um einen Krebs, ein Krebsrisiko oder einen Krebsrückfall zu identifizieren oder zu charakterisieren.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-10, wobei:

    a) die SMI-Sequenz der Teil der Adaptersequenz ist, der an das doppelsträngige ZielNukleinsäurematerial ligiert wird; und/oder

    b) wobei die Adaptersequenz eine Y-Form umfasst.
12. Verfahren zum Herstellen einer Sequenzierungsbibliothek, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

    a) Kennzeichnen fragmentierter doppelsträngiger Nukleinsäuren, die obere Stränge und untere Stränge aufweisen, mit Duplex-Sequenzierungsadaptern, die einen Einzelmolekül-Identifikator beinhalten;

    b) Amplifikation;

    c) nach der Amplifikation und Schritten zum Entfernen der Reaktionsnebenprodukte wird die Probe in zwei oder mehr separate Proben aufgeteilt;

    d) nach dem Aufteilen der Probe in zwei Röhrchen werden Zielnukleinsäureregionen mit Multiplex-PCR unter Verwendung eines Primers/von Primern, die für eine Adaptersequenz spezifisch ist/sind, und eines Primers/von Primern, die für die Zielnukleinsäureregion(en) von Interesse spezifisch ist/sind, angereichert; und nach der PCR wird in dem ersten Röhrchen eine Vielzahl von Kopien der oberen Stränge erzeugt und in dem zweiten Röhrchen wird eine Vielzahl von Kopien der unteren Stränge erzeugt.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zum Untersuchung auf Koinzidenzvarianten bei Krebs dient, wobei es sich bei den Varianten optional um arzneimittelsensibilisierende Mutationen oder Resistenzmutationen handelt.
14. Verfahren zum Identifizieren von Krebsmutationen bei einem Patienten, wobei das Verfahren einen der Ansprüche 1 bis 13 umfasst.
15. Verfahren zum Überwachen von Tumormutationen bei einem Patienten als Reaktion auf eine Therapie, wobei das Verfahren einen der Ansprüche 1 bis 13 umfasst.