HK1225071A1 - Methods, kits, and systems for multiplexed detection of target molecules and uses - Google Patents

Claims (12)

1. Verfahren zum Erkennen mehrerer Zielproteinmoleküle in einer Probe, Folgendes umfassend:

   a. Inberührungbringen einer Probe mit einer Zusammensetzung, die mehrere Zielsonden umfasst, wobei jede der mehreren Zielsonden Folgendes umfasst:

   i. ein zielbindendes Molekül, das sich in der Probe speziell an ein individuelles Zielmolekül bindet;

   ii. eine Identifikationsnukleotidsequenz, die das zielbindende Molekül identifiziert; und

   iii. einen spaltbaren Linker zwischen dem zielbindenden Molekül und der Identifikationsnukleotidsequenz;

   b. Trennen ungebundener Zielsonden von mehreren Komplexen in der Probe, wobei jeder Komplex ein Zielproteinmolekül und eine einzige daran gebundene Zielsonde aufweist, wobei der Komplex keine zweite Zielsonde aufweist, die an einen verschiedenen Bereich des Zielproteinmoleküls gebunden ist;

   c. Freisetzen der Identifikationsnukleotidsequenzen aus den mehreren Komplexen; und

   d. Erkennen von Signalen aus den freigesetzten Identifikationsnukleotidsequenzen auf Basis eines Nicht-Gelelektrophoreseverfahrens ohne jegliche Verstärkungsschritte, wobei die Signale für die Identifikationsnukleotidsequenzen unterscheidbar sind, wobei dadurch die entsprechenden zielbindenden Moleküle identifiziert und mehrere verschiedene Zielmoleküle in der Probe erkannt werden, und

   wobei das Verfahren ferner, vor dem Erkennungsschritt (d), ein Koppeln der freigesetzten Identifikationsnukleotidsequenzen aus dem Freisetzungsschritt (c) zu einer Erkennungszusammensetzung umfasst, die mehrere Reportersonden umfasst, wobei jede der mehreren Reportersonden Folgendes umfasst: einen ersten zielsondenspezifischen Bereich, der geeignet ist, um einen ersten Abschnitt der Identifikationsnukleotidsequenz zu binden; und eine erkennbare Markierung, die die Reportersonde identifiziert, wobei die Markierung für jede Reportersonde ein eindeutiges unterscheidbares Signal erzeugt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zielbindende Molekül ein Antikörper ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der spaltbare Linker ein spaltbarer, nicht hybridisierbarer Linker ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der spaltbare, nicht hybridisierbare Linker auf ein Enzym, pH-Wert, Temperatur, Licht, Schubspannung, Ultraschallbehandlung, ein chemisches Mittel (z. B. Dithiothreit) oder eine Kombination davon empfindlich reagiert.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der spaltbare, nicht hybridisierbare Linker einen photospaltbaren Linker umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Molekülen (i)-(xix) und jeglichen Kombinationen davon besteht, wobei die chemischen Strukturen der Moleküle (i)-(xix) wie folgt gezeigt werden: wobei jeder der schwarzen Punkte in jedem Molekül einen Verbindungs- oder Kopplungspunkt darstellt, der sich direkt oder indirekt mit dem zielbindenden Molekül oder der Identifikationsnukleotidsequenz verbindet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Freisetzen der Identifikationsnukleotidsequenzen aus den gebundenen Zielsonden ein Aussetzen der gebundenen Zielsonden einem ultravioletten Licht umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Erkennen ein Erkennen von Signalen von den jeweiligen erkennbaren Markierungen der Reportersonden umfasst, die an die freigesetzten Identifikationsnukleotidsequenzen gekoppelt sind, wobei die Signale für die jeweiligen Reportersonden unterscheidbar und an die Identifikationsnukleotidsequenz gebunden sind, wobei dadurch die entsprechenden zielbindenden Moleküle identifiziert und mehrere Zielmoleküle in der Probe erkannt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die Identifikationsnukleotidsequenzen derart ausgewählt sind, dass sie nicht mit einem menschlichen Genom kreuzreagieren, und wobei die Identifikationsnukleotidsequenzen aus einem Kartoffelgenom stammen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Identifikationsnukleotidsequenzen;

   i) eine Länge von etwa 30-100 Nukleotiden aufweisen;

   ii) eine Länge von etwa 70 Nukleotiden aufweisen; oder

   iii) eine Länge von etwa 70 Nukleotiden aufweisen und eine aus Tabelle 2 ausgewählte Sequenz (SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 110) aufweisen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei:

    i) die Probe weniger als 500 Zellen umfasst; oder

    ii) ferner umfassend, vor dem Inberührungbringen, Trennen von Zielzellen von störenden Zellen in der Probe und wobei die Zielzellen seltene Zellen umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus zirkulierenden Tumorzellen, Embryonalzellen, Stammzellen, Immunzellen, klonalen Zellen und einer beliebigen Kombination davon besteht.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei die Zusammensetzung ferner mehrere Kontrollsonden umfasst, wobei jede der mehreren Kontrollsonden Folgendes umfasst:

    i. ein kontrollbindendes Molekül, das sich speziell an ein Kontrollproteinmolekül in der Probe bindet;

    ii. eine Identifikationskontrollsequenz, die das kontrollbindende Molekül identifiziert; und

    iii. einen spaltbarer Linker zwischen dem kontrollbindenden Molekül und der Identifikationskontrollsequenz.

    und wobei das Verfahren ferner ein Quantifizieren der Signale durch Normalisieren der Signale, die mit den Zielsonden verknüpft sind, durch die Signale, die den Kontrollsonden zugeordnet sind, umfasst.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, ferner umfassend ein Extrahieren eines Nukleinsäuremoleküls aus derselben Probe und Unterziehen des Nukleinsäuremoleküls einer Nukleinsäureanalyse, wobei dadurch Nukleinsäuremoleküle aus derselben Probe erkannt werden.