CN111518884B

CN111518884B - miRNA30簇作为阿尔茨海默病诊断标志物的应用

Info

Publication number: CN111518884B
Application number: CN202010269842.2A
Authority: CN
Inventors: 刘睿; 李卓荣; 曾利; 孙婷; 姜海伦; 赵凯悦; 张俊霞
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2040-04-08
Also published as: AU2020103933A4; CN111518884A

Abstract

本发明公开了miRNA30簇作为阿尔茨海默病诊断标志物的应用。本发明的miRNA 30簇的微小RNA在阿尔茨海默病诊断、治疗方面具有作用，通过AD模式细胞、AD模式动物和自然老化动物、临床血液样本，利用针对miRNA30簇的微小RNA标志物的引物和/或探针，检测其在人体中的相对表达量，本发明的miRNA30簇的微小RNA在阿尔茨海默病进程中表达显著升高，在转录和翻译水平负向调控ADAM10和SIRT1的表达，同时抑制ADAM10介导的非淀粉样蛋白生成途径和SIRT1去乙酰化作用介导的淀粉样蛋白降解途径，导致淀粉样蛋白在大脑过度聚集，促进AD的发生发展。因此miRNA 30簇的微小RNA可以作为一种新的阿尔茨海默病标志物，用于阿尔茨海默病的辅助诊断。

Description

miRNA30簇作为阿尔茨海默病诊断标志物的应用

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及miRNA30簇作为阿尔茨海默病诊断标志物的应用。

背景技术

目前，阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种皮层和海马区慢性神经系统退行性疾病，临床主要表现为渐进性记忆和认知功能障碍、情绪失常、社交困难等神经症状，主要的病理机制为β-淀粉样蛋白(β-Amyloid-beta peptide,Aβ)聚集引起的老年斑沉积、Tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结、突触功能障碍、神经细胞炎症反应、大脑皮质萎缩等。由于缺乏高效精准筛查检测技术、致病机理不清、药物靶标进展研究缓慢导致AD的诊断和/或治疗仍存在问题和挑战。目前临床在研药物以及上市药物只能缓解轻中度患者病症，不能从根本上改善病症和治愈疾病。因此，寻求可靠的AD诊断标志物、阐明AD发病机制是目前防治AD亟待解决的科学问题。研究表明，PSEN1、PSEN2、APP等基因突变导致罕见的阿尔茨海默病，可以通过早期基因筛查发现发病人数小于10％的家族性AD；发病率大于90％的散发性AD的遗传病理和相关信号通路的调控机制复杂而且至今没有相关的基因报道。研究散发性AD中，转录组学中微小RNA非编码基因的变化对AD的防治及临床生物标志物的发现具有重要的意义。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种用于阿尔茨海默病诊断和/或治疗的miRNA生物标志物，以解决现有技术中的在基因水平上，没有阿尔茨海默病诊断标志物的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于阿尔茨海默病诊断和/或治疗的miRNA生物标志物，所述miRNA生物标志物为miRNA30簇。

本发明的一个实施例中，所述miRNA30簇选自hsa-miR-30a，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

所述miRNA30簇选自hsa-miR-30a-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种引物在制备试剂盒中的应用，所述引物是针对上述所述的miRNA生物标志物的特异性的引物。

本发明的一个实施例中，所述试剂盒用于提供患有或有风险形成阿尔茨海默病的患者中诊断阿尔茨海默病，预测形成阿尔茨海默病的风险，或预测阿尔茨海默病的结果。

本发明的一个实施例中，所述引物用于测定样品中所述miRNA生物标志物的表达水平。

本发明的一个实施例中，所述样品为血清。

本发明的一个实施例中，所述miRNA生物标志物的表达水平是以患者的miRNA生物标志物表达水平与健康人miRNA生物标志物参照表达水平。

本发明的一个实施例中，所述miRNA生物标志物的表达水平的测定是基于测序的方法、基于阵列的方法或基于PCR的方法。

一种以上述所述miRNA生物标志物的抑制剂在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，也属于本发明保护的范围。

本发明中，miRNA 30簇的微小RNA在阿尔茨海默病中表达显著升高，与ADAM10的3’UTR结合，抑制ADAM10作为α-分泌酶产生可溶性Aβ的非淀粉样蛋白途径；

miRNA 30簇的微小RNA和SIRT1的3’UTR结合，抑制SIRT1使维甲酸β受体去乙酰化并激活ADAM10转录的淀粉样蛋白降解途径；miRNA 30簇的微小RNA通过抑制SIRT1的生物学活性，激活NF-κB信号通路中β-分泌酶的活性，促进不可溶性淀粉样蛋白Aβ的产生。与此同时，miRNA 30簇的微小RNA抑制SIRT1介导的过度磷酸化的Tau蛋白去乙酰化作用，导致神经纤维缠结，导致神经少突胶质细胞的死亡。其中，miRNA 30簇的微小RNA为：

(1)miRNA 30簇的微小RNA选自如下特征：(a)miRNA类微小RNA，的miRNA 30a类微小RNA选自hsa-miR-30a，其序列如SEQ ID NO.1：gcgacuguaaacauccucgacuggaagcugugaagccacagaugggcuuucagucggauguuugcagcugc所示，其默认成熟体(hsa-miR-30a-5p)序列如SEQ ID NO.2：gaaggucagcuccuacaaaugu所示；(b)经修饰的miRNA类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；本发明实施例提供一种制剂和药物，该制剂和药物为(1)中的微小RNA的抑制剂。

本发明实施例具有如下优点：

本发明的miRNA 30簇的微小RNA在阿尔茨海默病诊断、治疗方面具有作用，通过AD模式细胞、AD模式动物和自然老化动物、临床血液样本，利用针对miRNA30簇的微小RNA标志物的引物和/或探针，检测其在人体中的相对表达量，本发明的miRNA30簇的微小RNA在阿尔茨海默病进程中表达显著升高，因此miRNA 30簇的微小RNA可以作为一种新的阿尔茨海默病标志物，用于阿尔茨海默病的辅助诊断。

本发明实施例发现miRNA30簇的微小RNA表达上调可同时负向调控ADAM10及SIRT1的表达，导致Aβ的过度沉积和神经细胞凋亡；miRNA 30簇的微小RNA表达下调则明显减少Aβ的沉积水平，减少神经细胞凋亡，miRNA30簇的微小RNA通过负向调控ADAM10与SIRT1的表达加重AD的病理进程。

本发明实施例对miRNA30簇的微小RNA的功能研究深入系统，基于以上发现，miRNA30簇的微小RNA，具有特异性多靶标效应，可以作为阿尔茨海默病新的治疗靶点，以miRNA30簇的微小RNA作为阿尔茨海默病生物标志物的靶向治疗提供了新的思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例的miRNA高通量芯片技术检测AD病理进程中差异表达的微小RNA；

图2为本发明实施例的miR-30a在AD模式细胞、AD模式动物和自然老化动物、AD患者血液中的表达量检测，A:在AD细胞模型中，与对照组相比miR-30a表达量显著升高；B:在AD动物模型小鼠皮层中，与野生型小鼠对照组相比miR-30a表达量显著升高；C:在AD动物模型小鼠海马中，与野生型小鼠对照组相比miR-30a表达量显著升高；D:在AD患者血清中，与正常同龄人对照组相比miR-30a表达量显著升高；

图3为本发明实施例的miR-30a对AD神经细胞活力的影响；

图4为本发明实施例的miR-30a对淀粉样蛋白(Aβ)的影响；

图5为本发明实施例的miR-30a特异性靶向ADAM10与SIRT1的mRNA 3’UTR；其中，A:ADAM10与miR-30a结合序列在多个物种高度保守；B:SIRT1与miR-30a结合序列在多个物种高度保守；C:Luc-ADAM10-WT和Luc-ADAM10-MUT双荧光素酶报告基因载体构建示意图；D:Luc-SIRT1-WT和Luc-SIRT1-MUT双荧光素酶报告基因载体构建示意图；E:miR-30a与ADA10靶标结合特异性验证；F:miR-30a与SIRT1靶标结合特异性验证；

图6为本发明实施例的miR-30a在转录和翻译水平特异性负向调控ADAM10与SIRT1两个特异性靶标的表达；其中，A:在mRNA水平，miR-30a负向调控ADAM10和SIRT1的表达水平；B:在翻译水平，miR-30a负向调控ADAM10和SIRT1的表达水平(蛋白印迹)；C:在翻译水平，miR-30a负向调控ADAM10表达水平(相对定量)；D:在翻译水平，miR-30a负向调控SIRT1表达水平(相对定量)。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，术语“表达水平”是指与来自参照核酸(例如来自对照)比较，或与计算的平均表达值(例如在RNA芯片分析中)比较的测定表达水平。某个“表达水平”也可作为结果(result)并通过下文公开的几种感兴趣核酸的比较和测量来测定，并展示出这些转录物彼此的相对丰度。表达水平还可相对于不同组织，患者对健康对照等中的表达来评估。

在本发明的上下文中，“样品”或“生物样品”是源自生物学生物体或已经与生物学生物体接触的样品。生物样品的例子是：细胞、组织、体液、活组织检查样本、血液、尿液、唾液、痰液、血浆、血清、细胞培养上清液等。

“基因”是含有以受控方式产生功能性RNA产物必需的信息的核酸区段。“基因产物”是通过基因转录或表达产生的生物分子，例如mRNA或翻译蛋白。

“miRNA”是短的、天然存在的RNA分子，并且应当具有本领域技术人员所理解的一般含义。“源自miRNA的分子”是以化学方法或酶促方法自miRNA模板获得的分子，诸如cDNA。

本发明实施例中，术语“阵列”指装置(例如芯片装置)上可寻址位置的排列。位置的数目可从几个变化到至少几百或几千个。每个位置代表独立的反应位点。阵列包括但不限于核酸阵列、蛋白质阵列和抗体阵列。“核酸阵列”指含有核酸探针(诸如寡核苷酸、多核苷酸或基因的较大部分)的阵列。阵列上的核酸优选为单链的。

“基于PCR的方法”指包含聚合酶链式反应PCR的方法。这是通过利用一种、两种或更多种引物在体外酶促复制指数扩增核酸“例如DNA或RNA”的方法。对于RNA扩增，可使用逆转录作为第一步。基于PCR的方法包含动力学或定量PCR(qPCR)，其特别适宜于分析表达水平。当其实现表达水平的测定时，可以例如使用基于PCR的方法以检测给定mRNA的存在，其在逆转录酶的帮助下将完整的mRNA库(所谓的转录物组)逆转录为cDNA，并在相应引物的帮助下检测给定cDNA的存在。此方法通常称为逆转录酶PCR(rtPCR)。

本发明实施例中，术语“基于PCR的方法”包含端点PCR应用及应用特殊的荧光团或嵌入染料的动力学/实时PCR技术两者，所述荧光团或嵌入染料发射荧光信号作为扩增靶标的函数，并允许靶标的监测和定量。

本发明实施例中，术语“标志物”或“生物标志物”指其存在或浓度可进行检测并与已知的状况(诸如疾病状态)或临床结果(诸如对治疗的响应)相关联的生物分子，例如核酸、肽、蛋白质、激素等。

实施例1、miRNA高通量芯片技术检测AD病理进程中差异表达的微小RNA

采用稳定转染APP/PS1基因的1、3、6、9月龄双转基因小鼠(实验组)和野生型小鼠(对照组)。利用Northern bloting的原理，进行“高密度、灵活定制、微量样品”的高通量基因组学表达谱生物芯片技术，利用Trizol的方法提取小鼠脑组织RNA并进行分离、标记，本发明实施例的miRNA 30簇的微小RNA为hsa-miR-30a，其序列如SEQ ID NO.1所示：gcgacuguaaacauccucgacuggaagcugugaagccacagaugggcuuucagucggauguuugcagcugc。其默认成熟体(hsa-miR-30a-5p)序列如SEQ ID NO.2：gaaggucagcuccuacaaaugu所示。其中，成熟体(hsa-miR-30a-5p)miRNA逆转录引物：SEQ ID NO.3：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacattt；定量PCR(qPCR)正向引物：SEQ ID NO.4：cgcggaaggtcagctcctac；反向引物：SEQ ID NO.5：agtgcagggtccgaggtatt。将标记的样品与miRCURYTM LNA Array(v.18.0)芯片进行预杂交、杂交、洗片，使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，利用GenePixpro V6.0软件进行数据统计分析。

如图1所示，与野生型小鼠相比，miR-30a在不同月龄APP/PS1小鼠脑组织中表达显著增加(mean±SEM，n＝3，fold change＞2)。

实施例2、miRNA 30簇的微小RNA在AD模式细胞中的表达

采用细胞培养技术、脂质体瞬时转染、抗生素加压筛选、有限稀释法获得单克隆株，同时利用Western blot或ELISA进行相关蛋白检测，构建稳定转染人鼠嵌合型APP基因的人神经母细胞瘤细胞。同时使用铜离子诱导处理细胞，铜离子与APP、Aβ形成螯合物，加重Aβ的产生与沉积，诱导氧化应激反应和神经细胞的凋亡。因此，用来模拟AD神经细胞的病理状态和药物作用机制的研究。

采用RT-PCR和qPCR技术进行逆转录和实时荧光定量检测miR-30a在AD细胞模型病理进程中的表达变化。如图2中A所示，与对照组相比，miR-30a的表达量显著增加(mean±SEM)(n＝3)，**p＜0.01)。

实施例3、miRNA 30簇的微小RNA在AD模式动物中的表达

采用稳定转染APP/PS1基因的双转基因小鼠(实验组)和SAMP8自然快速老化小鼠(对照组)。分别提取1、3、6、9月龄APP/PS1双转基因小鼠与SAMP8自然快速老化小鼠的海马和皮层组织，利用Trizol方法提取小鼠皮层和海马总mRNA，同时利用紫外吸收法进行浓度和纯度的测定，利用RT-PCR和qPCR技术检测miR-30a在AD病理进程中的表达变化。

如图2中，B-C所示，在两种动物模型皮层或海马组织中，与同月龄对照组小鼠(WTcontrol/SAMR8小鼠)相比，miR-30a的表达水平在1、3、6、9月龄显著增加。((mean±SEM)(n＝4)，**p＜0.01，***p＜0.001)。

实施例4、miRNA 30簇的微小RNA在AD患者血液中的表达验证

获取临床上确诊为AD的患者和正常同龄人的血清，提取病人和正常同龄人总RNA,利用紫外吸收法和酶标仪进行RNA浓度和纯度验证，利用RT-PCR和qPCR技术检测miR-30a在AD患者血清中的含量。

如图2中，D所示，AD患者血液中miR-30a的含量与同龄健康志愿者相比显著升高。((mean±SEM)(n＝5～7)，**p＜0.01)。

实施例5、miRNA 30簇的微小RNA表达上调和下调对细胞存活率的影响

构建AD模式细胞系，采用脂质体共转染miRNA mimics和miRNA inhibitor方法建立miR-30a表达上调和下调的细胞模型，选用MTS比色法于12h、24h、48h进行细胞存活率检测。如图3所示，miR-30a表达下调可缓解Cu²⁺诱导损伤作用，增加AD模式细胞的存活率，发挥神经保护作用；miR-30a表达上调降低AD模式细胞的存活率。(mean±SEM)(n＝3)，*p＜0.05，，**p＜0.01，***p＜0.001)。

实施例6、miR-30a簇的微小RNA表达上调和下调对细胞内淀粉样蛋白(Aβ)的影响

构建AD模式细胞，利用脂质体瞬时转染miRNA mimics和miRNA inhibitor的方法建立miR-30a表达上调和下调的细胞模型，利用免疫荧光技术进行细胞Aβ检测。如图4所示，miR-30a表达上调能够显著增加Aβ过度沉积，导致神经细胞的死亡；miR-30a表达下调能够明显抑制Aβ过度沉积，减少神经细胞的死亡；发挥神经保护作用。(mean±SEM)(n＝3))。

实施例7、miR-30a簇的微小RNA与ADAM10与SIRT1的结合情

利用生物信息学软件TargetScan、miRanda以及miRBase分别预测miR-30a与ADAM10和SIRT1两个靶标的结合位点，并证实结合序列在人、鼠、兔等多个物种高度保守，如图5中，A所示。利用双荧光素酶报告基因技术，截取miR-30a/ADAM10和miR-30a/SIRT1结合位点上下游约150bp碱基的片段克隆到双荧光素酶报告基因的下游，构建双荧光素酶报告基因载体Luc-ADAM10-WT和Luc-SIRT1-WT；利用碱基突变的方法，构建突变型双荧光素酶报告载体Luc-ADAM10-MUT和Luc-SIRT1-MUT，如图5中，B-C所示。利用脂质体共转染技术，分别将Luc-ADAM10-WT和Luc-ADAM10-MUT报告载体与miR-30a mimics共转染至HEK293细胞，利用双荧光素酶报告基因检测系统检测36h后检测Firefly和Renilla荧光素酶的活性，计算相对荧光强度。同理，利用脂质体技术共转染Luc-SIRT1-WT或Luc-SIRT1-MUT和miR-30amimics，计算相对荧光强度。如图5中，B所示，Luc-ADAM10-WT与miR-30a mimics共转染后，miR-30a表达上调能显著降低荧光素酶活性，而结合位点突变后，miR-30a对荧光素酶活性的抑制丧失。如图5中，C所示，Luc-SIRT1-WT与miR-30a mimics共转染后，miR-30a表达上调也能显著降低荧光素酶活性，而结合位点突变后，miR-30a对荧光素酶活性的抑制丧失。因此，miR-30a对ADAM10和SIRT1同时具有特异性靶向调控作用。((mean±SEM)(n＝3)，*p＜0.05，***p＜0.001)。

实施例8、miR-30a簇的微小RNA在转录水平特异性调控ADAM10与SIRT1的表达

构建AD模式细胞，利用脂质体共转染miRNA mimics/inhibitor的方法建立miR-30a表达上调或下调的细胞模型，通过Trizol方法提取总RNA,利用RT-PCR和qPCR技术分别检测细胞内ADAM10与SIRT1mRNA的含量，如图6中，A所示，miR-30a表达上调可以在mRNA水平负向调控两个特异性靶点ADAM10和SIRT1的表达；miR-30a表达下调可以同时在mRNA水平促进ADAM10和SIRT1的表达。((mean±SEM)(n＝3)，*p＜0.05，***p＜0.001)。

实施例9、miR-30a簇的微小RNA在翻译水平特异性调控ADAM10与SIRT1的表达

通过脂质体共转染构建miR-30a过表达和沉默细胞模型，通过水溶液提取法提取细胞中的蛋白质，进行定量、变性，利用蛋白印迹Western Blot技术检测细胞内ADAM10和SIRT1在翻译水平蛋白的表达量。如图6中，B～D所示，miR-30a表达上调可以在翻译水平负向调控两个特异性靶点ADAM10和SIRT1的表达，降低ADAM10和SIRT1的蛋白表达量；miR-30a表达下调可以促进ADAM10和SIRT1的高表达，发挥神经保护作用。((mean±SEM)(n＝3)，*p＜0.05，***p＜0.001)。

本发明实施例1至实施例9表明，本发明的miRNA 30簇的微小RNA在阿尔茨海默病病理进程中表达显著升高，并通过负向调控ADAM10与SIRT1的表达，抑制ADAM10介导的非淀粉样蛋白生成途径和SIRT1去乙酰化作用介导的淀粉样蛋白降解途径，导致Aβ蛋白在大脑皮质的过度聚集，导致神经损伤和认知功能障碍。

因此，下调miRNA 30簇的微小RNA活性或表达促进双靶标ADAM10和SIRT1高表达，降低Aβ过度沉积引起的老年斑，从而延缓病理过程。所以miRNA 30簇的微小RNA有成为阿尔茨海默病诊治的新靶点。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

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序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> miRNA30簇作为阿尔茨海默病诊断标志物的应用

<130> GG20756636A

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 71

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcgacuguaa acauccucga cuggaagcug ugaagccaca gaugggcuuu cagucggaug 60

uuugcagcug c 71

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaaggucagc uccuacaaau gu 22

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacattt 50

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgcggaaggt cagctcctac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

agtgcagggt ccgaggtatt 20

Claims

1. miRNA30簇微小RNA表达抑制剂在制备减少神经细胞死亡，神经保护药物中的应用，其中，miRNA30簇微小RNA通过在转录和翻译水平特异性负性调控ADAM10和SIRT1的表达，降低Aβ过度沉积，发挥神经保护作用；所述miRNA30簇选自hsa-miR-30a，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；或所述miRNA30簇选自hsa-miR-30a-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，制备所述hsa-miR-30a-5p的逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。