CN118059323A

CN118059323A - 一种血管支架及其制备工艺

Info

Publication number: CN118059323A
Application number: CN202410199022.9A
Authority: CN
Inventors: 刘少军; 刘世明; 陈静
Original assignee: Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2024-02-22
Filing date: 2024-02-22
Publication date: 2024-05-24
Also published as: US20250268736A1

Abstract

本发明提供了一种血管支架及其制备工艺，属于医疗器械技术领域。本发明提供的血管支架上负载有活化蛋白C和利莫司类药物，所述负载包括但不限于喷涂、包裹。本发明的血管支架通过同时负载活化蛋白C和利莫司类药物，既能抑制血管平滑肌细胞、从而防止再狭窄，又能促进内皮细胞功能及支架的再内皮化进程、从而预防支架内血栓，具有双重功效。同时，本发明所用的活化蛋白C在缓解因利莫司类药物引发的对内皮细胞及内皮化过程的抑制作用时，不影响利莫司类药物的药效。

Description

一种血管支架及其制备工艺

技术领域

本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种血管支架及其制备工艺。

背景技术

心脑血管意外是全球最常见的死亡原因。血管介入治疗是常用的恢复动脉血流的方法，包括动脉球囊血管成形术、血管支架植入等。药物洗脱支架(DES)应用在心脑血管事件中应用很广泛。DES主要有两种商用的类型。即紫杉醇和利莫司类。目前以利莫司类，包括雷帕霉素(西罗莫司)，以及雷帕霉素的各种衍生物依维莫司和佐他莫司等，占主导地位。利莫司类抑制血管平滑肌细胞(SMC)mTOR的激活，防止细胞周期从G1期进展到S期、阻止SMC的增殖，从而防止血管再狭窄。紫杉醇改变β-微管蛋白与微管的相互作用，诱导细胞周期停滞，抑制SMC增殖、迁移、内膜增生和血管再狭窄。

与早期金属裸支架(BMS)相比，DES的应用显著降低了支架内再狭窄的发生率，但在晚期(1个月至1年)和极晚期(>1年)显著增加了支架血栓形成(ST)的风险^1,2。ST是血管介入术后最严重的并发症之一，致死率高。ST主要归因于支架药物(利莫司类或紫杉醇)对内皮细胞(EC)的非选择性抑制，从而延迟了支架的再内皮化进程。血管中的未被EC包裹的支架持续暴露，作为异物反复刺激机体，最终形成血栓。此外，雷帕霉素、依维莫司、佐他莫司和紫杉醇增加组织因子活性，促进血栓形成³。传统DES只关注抑制再狭窄的效应，而忽略了防止ST的作用。

近年来，人们发现可生物降解支架(BRS)的应用具有更有利于主动血管重塑的特点。然而，尽管在其他方面取得了良好的效果，但许多临床研究对BRS是否能降低ST以及由此导致的心脏猝死等的发生率还有很大争论^4～8。因此，亟需开发出一种既能抑制SMC(从而防止再狭窄)，又能促进EC功能、促进支架的再内皮化进程(从而预防ST)的具有双重效应的新型血管支架。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种血管支架及其制备工艺，本发明提供的血管支架上负载有活化蛋白C和利莫司类药物，既能抑制血管再狭窄，又能预防支架内血栓。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种的血管支架，所述血管支架上负载有活化蛋白C和利莫司类药物，所述负载包括但不限于喷涂、包裹。

优选地，所述利莫司类药物包括雷帕霉素、依维莫司、佐他莫司、他克莫司、deforolimus、biolimus A9、吡美莫司中的一种或几种。

优选地，所述喷涂包括但不限于在金属支架上喷涂有活化蛋白C和利莫司类药物的涂层；所述包裹包括但不限于在生物可降解支架中包裹活化蛋白C和利莫司类药物。

优选地，所述喷涂时活化蛋白C、利莫司类药物的喷涂量分别为1μg/mm～100μg/mm、1μg/mm～100μg/mm。

优选地，所述包裹时活化蛋白C、利莫司类药物的包裹量分别为1μg/mm～100μg/mm、1μg/mm～100μg/mm。

本发明还提供一种上述技术方案中所述血管支架的制备工艺，包括以下步骤：

S1、支架预处理：

S2、配制活化蛋白C/利莫司类药物溶液：将利莫司类药物以及活化蛋白C溶于含有10％ PLGA的四氢呋喃溶液中；

S3、旋转喷涂。

优选地，所述S2中利莫司类药物和活化蛋白C的终浓度均为50μg/mL。

有益技术效果：本发明提供了一种血管支架及其制备工艺，所述血管支架上负载有活化蛋白C和利莫司类药物，所述负载包括但不限于喷涂、包裹。本发明的血管支架通过负载活化蛋白C和利莫司类药物，既能抑制血管平滑肌细胞、从而防止再狭窄，又能促进内皮细胞功能及支架的再内皮化进程、从而预防支架内血栓，具有双重功效。同时，本发明所用的活化蛋白C在缓解因利莫司类药物引发的对内皮细胞及内皮化过程的抑制作用时，不影响利莫司类药物的药效。

附图说明

图1为APC保护性激活EPCR并增加其表达；其中，图1A为APC增加HCAECs EPCR蛋白的相对表达量及激活EPCR通路；图1B为APC能够恢复雷帕霉素造成的HCAECs的EPCR蛋白下降、EPCR通路被抑制；

图2为在支架模拟环境下APC促进内皮化进程；其中，图2A为支架模拟环境下APC保护性增加HCAECs的数量；图2B-D为APC保护性地对抗雷帕霉素损伤的HCAECs细胞活力(图2B)、细胞增殖能力(图2C)、细胞迁移能力(图2D)；图2E为APC保护性地抑制血小板粘附到HCAECs；图2F为APC保护性地抑制中性粒细胞粘附到HCAECs；其中，绿色为Calcein-AM标记的HCAECs，红色为PKH-26标记的血小板或中性粒细胞，n＝5-6。比例尺：200μm，“**”表示P<0.01、“***”表示P<0.001；

图3为APC涂层促进支架体外的内皮化进程；其中，图3A为代表性血管金属支架的宏观形状，比例尺：2mm；图3B为代表性金属裸支架和雷帕霉素涂层支架的代表性扫面电镜图像；图3C为APC联用的涂层促进支架体外的内皮化进程；支架表面HCAECs用Calcein-AM染色，n＝6，比例尺：200μm，“***”代表P<0.001；

图4为在体APC/雷帕霉素涂层促进金属支架的再内皮化、抑制血小板黏附和再狭窄图4A为在体APC/雷帕霉素涂层促进金属支架的再内皮化及抑制血小板黏附的代表性扫描电镜图，其中，金属裸支架，n＝6；雷帕霉素支架，n＝5；APC/雷帕霉素支架，n＝5，箭头表示粘附的血小板；图4B为在体APC/雷帕霉素涂层抑制支架植入术后动脉血管再狭窄的代表性HE染色图及内膜狭窄率，其中，“*”表示P<0.05、“**”表示P<0.01，n.s.表示该比较没有统计学意义；

图5为APC/雷帕霉素可降解支架的在体效果；其中，图5A左图为兔腹主动脉支架植入45d后光学相干断层扫描图显示APC/雷帕霉素促进可降解支架的在体内皮化进程，右图为不同支架的新生内膜内皮覆盖率；图5B为支架动脉血管损伤的伊文思蓝染色，其中，比例尺：1mm；图5C为支架动脉的CD31阳性荧光证实APC/雷帕霉素促进可降解支架的在体内皮化进程的，箭头表示雷帕霉素BRS组中未完全再内皮化的支架节段，比例尺：0.8mm；图5D为兔腹部主动脉再内皮化的扫描电镜图像，其中，箭头表示内皮化不完全和血小板粘附；对照BRS，n＝11；雷帕霉素BRS，n＝10；APC/雷帕霉素BRS，n＝6；比例尺：0.5mm。“*”代表P<0.05、“**”代表P<0.01、“***”代表P<0.001、n.s.表示该比较没有统计学意义。

具体实施方式

本发明提供了一种的血管支架，所述血管支架上负载有活化蛋白C和利莫司类药物，所述负载包括但不限于喷涂、包裹。

在本发明中，所述活化蛋白C(APC)作为内皮蛋白C受体(EPCR)的配体、天然的激动剂，能够发挥与EPCR相似的功能：抗凝、抗炎、抗细胞凋亡、稳定内皮屏障和促进血管生成^9～11。而且，单独使用APC的涂层支架也具有抗凝作用^12～13。本发明发现APC不仅能保护性激活诱导人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)的EPCR通路，诱导EPCR的蛋白表达，还能拮抗利莫司类药物(如雷帕霉素)对EPCR的抑制作用。

在本发明中，所述利莫司类药物优选包括雷帕霉素、依维莫司、佐他莫司、他克莫司、deforolimus、biolimus A9、吡美莫司中的一种或几种，更优选为雷帕霉素。

在本发明中，所述喷涂包括但不限于在金属支架上喷涂有活化蛋白C和利莫司类药物的涂层；所述包裹包括但不限于在生物可降解支架中包裹活化蛋白C和利莫司类药物。本发明针对不同支架的特性，采用不同的负载形式，实现活化蛋白C和利莫司类药物的缓慢释放。

在本发明中，所述喷涂时活化蛋白C、利莫司类药物的喷涂量分别优选为1μg/mm～100μg/mm、1μg/mm～100μg/mm，更优选为10μg/mm～12μg/mm。本发明针对喷涂及可喷涂支架的特性，通过合理配比活化蛋白C、利莫司类药物的用量，不仅可以使利莫司类药物有效发挥作用，还能缓解因利莫司类药物引发的对内皮细胞及内皮化过程的抑制作用，降低血管介入术后ST的风险。

在本发明中，所述包裹时活化蛋白C、利莫司类药物包裹量分别为1μg/mm～100μg/mm、1μg/mm～100μg/mm，更优选为10μg/mm～12μg/mm。本发明针对包裹及可包裹支架的特性，合理配比活化蛋白C、利莫司类药物的用量，使两种物质在降解过程中的释放量达到平衡。

S1、支架预处理：

S3、旋转喷涂。

在本发明中，所述S2中利莫司类药物和活化蛋白C的终浓度均为50μg/mL。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

1.1材料

APC：Sigma-Aldrich Cat#P2200；

雷帕霉素：MedChemExpress Cat#HY-10219；

金属支架：辽宁垠艺生物技术有限公司提供；

可降解支架：华安生物技术(山东，中国)提供；

新西兰兔：广东省动物中心提供；

人类冠状动脉内皮细胞(HCAECs)细胞：购自Cell Applications公司。

1.2APC诱导人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)中EPCR的表达

具体为：HCAECs细胞在EBM-2(Lonza，CC3156)培养基中，补充3％FBS和内皮细胞生长因子补充混合物(Lonza，CC4176)，在标准细胞培养条件(37℃，5％CO₂)下培养，P3-5代细胞在70％-80％时进行实验。10μMAPC、100nM雷帕霉素或10μM APC+100nM雷帕霉素处理HCAECs 24h后进行免疫印迹检测蛋白的表达。

结果如图1所示。由图1可以看出，APC不仅能保护性激活诱导人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)的EPCR通路，而且能够诱导其EPCR的蛋白表达(图1A)。APC也能拮抗利莫司类药物(如雷帕霉素)对EPCR的抑制作用(图1B)。

1.3在支架模拟环境下APC促进内皮化进程

考察APC在316L钢片PLGA缓释涂层模拟支架环境中的作用。用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA 75:25)包裹的溶剂对照(四氢呋喃，THF)、雷帕霉素(50μg/mL)、APC(50μg/mL)+雷帕霉素(50μg/mL)缓释涂层分别涂覆于316L不锈钢板表面。

待HCAECs于316L不锈钢板上生长48h后，CCK-8法检测细胞活力、EdU法检测细胞增殖能力、划痕法检测细胞迁移能力；与2μM PKH-26进行标记的中性粒细胞(10⁶/孔)或血小板(5×10⁶/孔)进行共培养1h。Calcein-AM染色后荧光显微镜观察。

以2×10⁴细胞/mL的密度种在24孔板中的316SS，316L SS/Rapamycin，316L SS/Rapamycin/APC上。按照CCK-8操作说明将10μL CCK-8反应液加入24孔板中，用450nm波长的分光光度测定仪在4h测定吸光度值(OD值)。对于EdU分析，将试剂A加入24孔板中的培养基中，37℃下培养4h以标记EdU，然后按照制造商的说明用荧光显微镜(EVOS FL)捕获细胞。用Calcein-AM(5μM)染色1h来检查细胞粘附。

结果显示，PLGA-雷帕霉素抑制了HCAECs在316L不锈钢表面上的生长、活力、增殖和迁移(图2A-D)，促进了血小板(图2E)和中性粒细胞(图2F)粘附到EC表面。相反，APC+雷帕霉素缓释涂层能够恢复HCAECs的生长、活力、增殖和迁移的功能(图2A-D)，并且抑制血小板和中性粒细胞的粘附(图2E-F)。

实施例2喷涂方式的血管支架

2.1制备血管支架(喷涂)

该血管支架为在金属支架上喷涂有活化蛋白C和雷帕霉素涂层。步骤为：

(1)支架预处理：临床级316L裸金属支架(2.5mm×15mm，直径×长度)经过常规激光切割、灭菌等处理；

(2)配制活化蛋白C/雷帕霉素溶液：50μg/mL的雷帕霉素以及50μg/mL的APC溶于含10％ PLGA的四氢呋喃溶液中。

(3)旋转喷涂。临床级316L金属裸支架和可生物降解支架经过旋转喷涂覆盖技术在表面涂覆大约12μg/mm的雷帕霉素以及10μg/mm的APC。

简要地，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA 75：25)包裹溶解在四氢呋喃(THF)中，浓度为10％(w/v)，并在室温下搅拌12h备用。然后，添加并溶解雷帕霉素12μg/mL和/或10μg/mL APC 1h。2mL PLGA/Rapamycin或PLGA/Rapamycin/APC溶液由注射泵推动，速度分别为1mL/h和0.1mL/h，施加15KV的高电压，收集距离固定在15cm。使用相同体积的PLGA溶液但不含rapamycin和APC作为对照。本实验中，所有涂层在旋转滚筒上收集1h，然后在40℃下真空干燥12h以上以去除残留溶剂，以便进一步使用。

2.2支架体外的内皮化试验

以金属裸支架、雷帕霉素涂层金属支架为对照(制备过程如上述)，将HCAECs细胞分别与金属裸支架、雷帕霉素涂层金属支架、APC+雷帕霉素涂层金属支架共培养3d后，用5μM钙黄绿素AM(绿色)对内皮细胞进行染色，并通过荧光显微镜进行检测。

结果如图3所示。由图3可以看出，雷帕霉素支架的内皮细胞数较金属裸支架显著下降，而APC+雷帕霉素涂层金属支架的内皮细胞数较雷帕霉素支架显著上升，说明APC可显著缓解雷帕霉素对内皮细胞的抑制作用。体外中APC+雷帕霉素涂层能够促进支架的内皮化进程。

2.3支架体内的内皮化试验

本发明所用动物为健康的新西兰白兔(3.0kg～3.5kg)，将其放置在温度和光控室内的个体笼内，免费提供标准兔粮及灭菌饮用水。所有实验程序符合美国国家卫生研究院(NIH Publication No.85-23，1996年修订)发布的《实验动物护理和使用指南》，并且经广州医科大学动物伦理委员会批准。简要来说，兔子在植入支架前每日口服2mg/kg的阿司匹林和1.5mg/kg的氯吡格雷。兔子被分成三组：金属裸支架(BMS)，涂有雷帕霉素的BMS，涂有APC+雷帕霉素的BMS。兔子采用耳缘静脉注射pentobarbital sodium(30mg/kg)进行麻醉，支架(直径3.5mm，长12mm)涂有不同药物，并装配在充气管支架上，通过6F鞘管(Terumo，RS*A60K10SQ)从右股动脉切口处的分歧处向下10mm植入腹主动脉，把球囊充气到12-16ATM，持续30s，然后放气30s，以维持负压。重复三次以完全展开支架。随后，球囊放气后慢慢抽出，留下支架在原位并进行造影观察(GE Healthcare)。右股动脉用7-0生物可溶解线缝合，所有动物术后3天内注射青霉素(5000U/kg)。整个手术过程中给兔子每次注射2-2.5mL肝素(250mL 0.9％NaCl+6000U)。28d后，扫描电镜下观察各组支架动脉管腔超微结构；支架植入术后动脉血管再狭窄的HE染色分析。

结果如图4所示。由图4A可以看出，28d后，扫描电镜下观察各组支架动脉管腔超微结构发现，与雷帕霉素支架相比，APC+雷帕霉素支架表面上粘附的内皮细胞形成均匀的鹅卵石状细胞层；支架几乎完全被内皮细胞覆盖，且主轴方向与血流一致；而支架表面血小板黏附情况明显减少(金色箭头)(图4A)。由图4B可以看出，苏木精和伊红(HE)染色图像显示金属裸支架相比雷帕霉素和APC+雷帕霉素支架有更多的血管内膜增生，而后两者在植入后的血管内膜增生无明显统计学差异，表明APC并未影响雷帕霉素抑制平滑肌细胞增殖、再狭窄的作用。即APC不影响雷帕霉素的药物效果，二者联用不冲突。因此，APC+雷帕霉素支架具有明显的促进金属支架的内皮化进程，而不影响再狭窄。

实施例3包裹方式的血管支架

3.1定制各种支架

(1)BRS对照

(2)雷帕霉素BRS

(3)APC+雷帕霉素BRS

在华安生物技术定制上述三种类型的支架，其中，(1)、(2)为该公司生产供临床使用的可降解支架(Xinsorb，型号：3.5mm×12mm，其中雷帕霉素载药量为12μg/mm)；(3)为该公司根据我们的要求，在可降解支架制作过程中加入雷帕霉素+APC，成型后雷帕霉素的终含量为12μg/mm，APC的终含量为10μg/mm。

3.2可降解支架的体内效果

分别将BRS对照、雷帕霉素BRS、APC+雷帕霉素BRS植入兔腹主动脉(具体步骤同2.3)。45d后，进行光学相干断层扫描检查、伊文思蓝染色、CD31免疫荧光和扫描电镜检测。

结果如图5所示。光学相干断层扫描检查结果显示，APC+雷帕霉素BRS组的内膜覆盖面积明显增加(图5A)。伊文思蓝染色结果显示，APC+雷帕霉素BRS组的血管损伤明显好于雷帕霉素BRS组(图5B)。CD31免疫荧光结果显示，APC+雷帕霉素BRS的EC覆盖明显优于雷帕霉素BRS(图5C)。扫描电镜结果显示，APC+雷帕霉素BRS表面上粘附的内皮细胞形成均匀的鹅卵石状细胞层，且主轴方向与血流一致，很少有血小板黏附，再内皮化较完全(图5D)。因此，在体实验表明，APC+雷帕霉素可降解支架能够明显促进支架的内皮化进程和降低血小板黏附。

综上所述，APC联用利莫司类(如雷帕霉素)的血管支架，能够有效促进支架的内皮化进程、减少血小板黏附和血栓形成，且不影响利莫司类(如雷帕霉素)抑制再狭窄的功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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Claims

1.一种血管支架，其特征在于，所述血管支架上负载有活化蛋白C和利莫司类药物，所述负载包括但不限于喷涂、包裹。

2.根据权利要求1所述的血管支架，其特征在于，所述利莫司类药物包括雷帕霉素、依维莫司、佐他莫司、他克莫司、deforolimus、biolimus A9、吡美莫司的一种或几种。

3.根据权利要求1或2所述的血管支架，其特征在于，所述喷涂包括但不限于在金属支架上喷涂有活化蛋白C和利莫司类药物的涂层；所述包裹包括但不限于在生物可降解支架中包裹活化蛋白C和利莫司类药物。

4.根据权利要求1或3任一所述的血管支架，其特征在于，所述喷涂时活化蛋白C、利莫司类药物的喷涂量分别为1μg/mm～100μg/mm、1μg/mm～100μg/mm。

5.根据权利要求1或3所述的血管支架，其特征在于，所述包裹时活化蛋白C、利莫司类药物的包裹量分别为1μg/mm～100μg/mm、1μg/mm～100μg/mm。

6.一种权利要求1～5任一所述血管支架的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1、支架预处理：

S2、配制活化蛋白C-利莫司类药物溶液：将利莫司类药物以及活化蛋白C溶于含有10％PLGA的四氢呋喃溶液中；

S3、旋转喷涂。

7.根据权利要求6所述的制备工艺，其特征在于，所述S2中利莫司类药物和活化蛋白C的终浓度均为50μg/mL。