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CN116322706A - 新人工核酸、其制造方法和用途 - Google Patents

新人工核酸、其制造方法和用途 Download PDF

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CN116322706A CN202180065756.2A CN202180065756A CN116322706A CN 116322706 A CN116322706 A CN 116322706A CN 202180065756 A CN202180065756 A CN 202180065756A CN 116322706 A CN116322706 A CN 116322706A
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Abstract

本发明的课题在于提供一种新人工核酸、其制造方法和用途。可以通过具有来源于下式(1)所表示的化合物或其盐的单元的人工核酸来解决课题：
Figure DDA0004143951890000011
上式中，Base是任选有取代基的芳香族杂环基或芳香烃环基，A1是单键或亚烷基，R1和R2相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、烯基、环烷基、环烯基或芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、或者任选有取代基的二羟基亚膦酰基或羟基巯基亚膦酰基，或者R1和R2与相邻的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成任选有取代基的环，R3是氢原子、任选有取代基的烷基、烯基、环烷基、芳基或酰基、具有取代基的磺酰基或甲硅烷基、功能性分子单元取代基、或式：R31‑X‑(式中，R31是任选有取代基的氨基，X是任选有取代基的亚烷基、或该亚烷基中的至少一个亚甲基被置换为‑N(R32)‑(式中，R32是氢原子或烷基)、‑O‑或‑S(＝O)k‑(式中，k是0、1或2)的基团)所表示的基团，R4是氢原子、任选有取代基的烷基或芳基，R5是氢原子或任选有取代基的烷基或芳基，R4和R5不同时是氢原子，n是0或1。

Description

新人工核酸、其制造方法和用途
技术领域
本发明涉及一种新人工核酸、其制造方法和用途等。
背景技术
寡核苷酸是天然DNA或天然RNA或人工核酸的短序列，已知其对于通过在各种基因转录和翻译水平上调节基因的表达或者检查基因的序列状况来治疗或诊断特定的疾病非常有用。
调节基因表达或检查/诊断基因信息的方法可根据目标对象大致分成两种。第一种是如信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)这样，目标对象是单链RNA、单链DNA的情况，第二种是目标对象是双链基因组DNA的情况。
在目标对象是单链RNA或单链DNA的情况下，可通过寡核苷酸与单链RNA或单链DNA互补结合形成双链的反义法来抑制(或基因诊断)基因的翻译过程。另外，在寡核苷酸是双链RNA分子的情况下，寡核苷酸与目标mRNA的互补结合通过RISC复合体的“剪切”酶引起目标mRNA的分解(RNA干涉法)。在RNA干涉法的情况下，寡核苷酸可以是与能够结合于目标mRNA的3’UTR区域(3’非翻译区域)而由不完全互补性的效力来抑制目标mRNA翻译的内源性微RNA同等的寡核苷酸(微RNA模拟物)。
寡核苷酸例如可通过与长的反义非编码RNA互补结合或者通过抑制互补的微RNA来诱导基因的活化或其转录的增加，其结果是也能够增加微RNA的目标mRNA的翻译(抗微RNA)。
作为在调节基因表达或检查/诊断基因信息的方法中使用的功能性材料的寡核苷酸，要求其与目标核酸的序列特异性优异的结合亲和性、对分解酶的强抵抗性、生物体内的安全性等特性。天然材料的DNA、RNA缺乏对分解酶的抵抗性，结合亲和性也不充分，不适合用作功能性材料。因此，到目前为止，为了实现寡核苷酸的高功能化，开发了许多人工核酸。
作为其代表性核酸，可举出：肽核酸(PNA)、桥接结构型核酸、吗啉代寡核苷酸(Morpholino nucleic acid,PMO)、以及核酸的磷酸二酯部的一个非结合氧原子用硫原子取代的硫代磷酸酯型核酸(S寡核苷酸)等。作为前述桥接结构型核酸的代表例，可举出：LNA(下述结构式1)、BNANC(下述结构式2)、ENA(下述结构式3)。
[化1]
Figure BDA0004143951850000021
所述硫代磷酸酯型核酸的结构用下述结构式4所表示。
[化2]
Figure BDA0004143951850000022
已证实这些桥接结构型核酸经由沃森-克里克型氢键对于单链RNA序列高选择性地结合的能力优异(专利文献1～3)。这样，以往的人工核酸作为控制特定基因的表达、以高灵敏度高精度检验/诊断基因序列的功能性材料而被利用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2003/105309号说明书
专利文献2：美国专利申请公开第2007/167387号说明书
专利文献3：美国专利申请公开第2003/207841号说明书
发明内容
发明所要解决的问题
在寡核苷酸的用途多样化发展的过程中，对于已开发的人工核酸的功能性仍留有改善的余地，要求开发以进一步高功能化为目标的新人工核酸。
本发明的目的在于提供一种对于各种各样的基因组技术有用的新人工核酸、它们的制造方法及用途等。
解决问题的技术方案
本发明人等为了达成上述课题而进行了深入研究，结果发现：在上述结构式2所表示的BNANC中，在呋喃糖的4位的碳原子与R所结合的氮原子之间的碳原子上结合有任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基的人工核酸兼具针对单链DNA和单链RNA的序列高度选择性且牢固的结合能力，以及优异的分解酶抗性能力。本发明人基于该发现进一步反复研究，从而完成了本发明。
本发明包含以下方式：
项1.
一种下式(1)所表示的化合物或其盐：
[化3]
Figure BDA0004143951850000031
[式(1)中，
Base是任选有取代基的芳香族杂环基或任选有取代基的芳香烃环基，
A1是单键或亚烷基，
R1和R2相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基或任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，或者R1和R2与相邻的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成任选有取代基的环，
R3是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的芳基、任选有取代基的酰基、具有取代基的磺酰基、具有取代基的甲硅烷基、功能性分子单元取代基、或式：R31-X-(式中，R31是任选有取代基的氨基，X是任选有取代基的亚烷基、或该亚烷基中的至少一个亚甲基被置换为-N(R32)-(式中，R32是氢原子或烷基)、-O-或-S(＝O)k-(式中，k是0、1或2)的基团)所表示的基团，
R4是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R5是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R4和R5不同时是氢原子，
下式：
[化4]
Figure BDA0004143951850000032
所表示的记号表示单键或双键，
该记号是单键时，n是1，
该记号是双键时，n是0]。
项2.
根据项1所述的化合物或其盐，其中，A1是单键。
项3.
根据项1或2所述的化合物或其盐，其中，下式：
[化5]
Figure BDA0004143951850000033
所表示的记号是单键，n是1。
项4.
根据项1～3中任一项所述的化合物或其盐，其中，R4是烷基。
项5.
根据项1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，R5是氢原子或烷基。
项6.
根据项1～5中任一项所述的化合物或其盐，其中，R3是氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、式：-Si(R6)3(式中，各R6相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团、标记官能团、具有嵌入能力的基团、具有核酸结合能力的基团、核酸切割活性官能团、具有细胞内迁移或核内迁移能力的基团、或具有金属螯合能力的基团。
项7.
根据项1～5中任一项所述的化合物或其盐，其中，R3是式：R31-X-所表示的基团，
R31是下式(A)所表示的基团或者是下式(B)所表示的基团，
[化6]
Figure BDA0004143951850000041
(式(A)中，R3a和R3b相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、或氨基的保护基，或者R3a和R3b与相邻的氮原子一同形成任选有取代基的环)
[化7]
Figure BDA0004143951850000042
(式(B)中，R3c～R3f相同或不同，是氢原子、烷基、或氨基的保护基)
X是-CmH2m-(式中，m是1～10的整数)。
项8.
根据项1～7中任一项所述的化合物或其盐，其中，R1和R2相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的芳基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、式：-Si(R6)3(式中，各R6相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团、式：-P(R7)(R8)(式中，R7和R8相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基或烷基氨基)所表示的基团、二羟基亚膦酰基、或羟基巯基亚膦酰基，或者，
R1和R2与相邻的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成任选有取代基的环。
项9.
根据项1～8中任一项所述的化合物或其盐，其中，Base是任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基、任选有取代基的2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基、任选有取代基的嘌呤-9-基、或任选有取代基的6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基。
项10.
根据项1所述的化合物或其盐，其是下式(1A)所表示的化合物或其盐。
[化8]
Figure BDA0004143951850000051
(式(1A)中，Base和R1～R5与上述相同)
项11.
根据项1所述的化合物或其盐，其是下式(1B)所表示的化合物或其盐。
[化9]
Figure BDA0004143951850000052
(式(1B)中，Base和R1、R2及R4与上述相同)
项12.
一种项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐中n是0或n是1且R5是氢原子的化合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(I)使下式(1E)所表示的化合物与式：R4·(式中，R4与项1相同)所表示的自由基或式：R4M(式中，M是金属原子或含金属原子的原子团，R4与项1相同)所表示的有机金属试剂进行反应的工序；
[化10]
Figure BDA0004143951850000053
(式(1E)中，Base、A1、R1和R2与项1相同)
进一步任选包括：
(II)将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化的工序；
(III)将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化并接着进行氢化的工序、或(IV)使在所述工序(I)中得到的化合物或将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化并接着进行氢化后的化合物与式：R3-L(式中，L是离去基团，R3与项1相同但不是氢)所表示的化合物进行反应的工序。
项13.
一种项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐中n是1、R3是任选有1个或2个取代基的甲基且R5是氢原子的化合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(I)使下式(1E)所表示的化合物与式：R4·(式中，R4与项1相同)所表示的自由基或式：R4M(式中，M是金属原子或含金属原子的原子团，R4与项1相同)所表示的有机金属试剂进行反应的工序；
[化11]
Figure BDA0004143951850000061
(式(1E)中，Base、A1、R1和R2与项1相同)
以及，
(II)使在所述工序(I)中得到的化合物与羰基化合物进行反应或将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化并接着进行氢化后的化合物与羰基化合物进行反应的工序。
项14.
一种具有下式(6)所表示的单元的寡核苷酸或其盐：
[化12]
Figure BDA0004143951850000062
[式(6)中，
Base是任选有取代基的芳香族杂环基或任选有取代基的芳香烃环基，
A1是单键或亚烷基，
R3是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的芳基、任选有取代基的酰基、具有取代基的磺酰基、具有取代基的甲硅烷基、功能性分子单元取代基、或式：R31-X-(式中，R31是任选有取代基的氨基，X是任选有取代基的亚烷基、或该亚烷基中的至少一个亚甲基被置换为-N(R32)-(式中，R32是氢原子或烷基)、-O-或-S(＝O)k-(式中，k是0、1或2)的基团)所表示的基团，
R4是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R5是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R4和R5不同时是氢原子，
下式：
[化13]
Figure BDA0004143951850000071
所表示的记号表示单键或双键，
该记号是单键时，n是1，
该记号是双键时，n是0]。
项15.
一种目标核酸的检测方法，其包括：
(I)将目标核酸通过核酸扩增法选择性地扩增的工序；以及，
(II)对在所述工序(I)中扩增的目标核酸进行检测的工序；
其中，所述扩增或检测中使用的寡核苷酸包含项14所述的寡核苷酸或其盐。
项16.
一种用于检测目标核酸或选择性地扩增目标核酸的试剂盒，其中，
(a)所述试剂盒包含引物和探针，该引物和探针中的至少一者包含项14所述的寡核苷酸或其盐，或者，
(b)所述试剂盒包含Clamp核酸和引物，该Clamp核酸和引物中的至少一者包含项14所述的寡核苷酸或其盐。
项17.
一种药物组合物，其含有项1～11中任一项所述的化合物或其盐、或者项14所述的寡核苷酸或其盐。
发明效果
根据本发明，可提供一种对于各种各样的基因组技术有用的新人工核酸。
附图说明
图1A是表示终浓度5.00μg/mL的消化酶的反应时间与未消化寡核苷酸的残留率的关系的图表。
图1B是表示终浓度1.60μg/mL的消化酶的反应时间与未消化寡核苷酸的残留率的关系的图表。
图1C是表示终浓度4.38μg/mL的消化酶的反应时间与未消化寡核苷酸的残留率的关系的图表。
图2A是本发明的试剂盒的一例，是包含容纳有含引物和探针的组合物的容器的试剂盒的示意图。
图2B是本发明的试剂盒的一例，是包含容纳有含引物的组合物的容器和容纳有含探针的组合物的容器的试剂盒的示意图。
图2C是本发明的试剂盒的一例，是包含容纳有含正向引物的组合物的容器、容纳有含反向引物的组合物的容器和容纳有含探针的组合物的容器的试剂盒的示意图。
具体实施方式
<<术语的定义>>
在本说明书中，“烷基”是指从直链或支链状的饱和烃中除去1个氢原子的一价基团。
烷基的碳原子数没有特别限定，例如为1～20，优选为1～10，进一步优选为1～6，特别优选为1～4。
作为烷基的例子，可举出：甲基、乙基、丙基(例：正丙基、异丙基)、丁基(例：正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例：正戊基、异戊基、新戊基)、己基、庚基、辛基(例：正辛基、2-乙基己基)、壬基、癸基等。
在本说明书中，“亚烷基”是指从直链或支链状的饱和烃除去2个氢原子的二价基团。
亚烷基的碳原子数没有特别限定，例如为1～10，优选为1～8，进一步优选为1～6。
作为亚烷基的例子，可举出：C1亚烷基(例：亚甲基)、C2亚烷基(例：甲基亚甲基、二亚甲基)、C3亚烷基(例：三亚甲基、二甲基亚甲基)、C4亚烷基(例：四亚甲基)、C5亚烷基(例：五亚甲基)、C6亚烷基(例：六亚甲基)等。
在本说明书中，“烯基”是指为直链或支链状的从含碳-碳双键的不饱和烃中除去1个氢原子的一价基团。
烯基的碳原子数没有特别限定，例如为2～20，优选为2～10，进一步优选为2～6。
作为烯基的例子，可举出：乙烯基(即，vinyl group)、丙烯基(例：1-丙烯基、烯丙基)、丁烯基、戊烯基、己烯基、香叶基(geranyl group)、法呢基(farnesyl group)等。
在本说明书中，“炔基”是指为直链或支链状的从含碳-碳三键的不饱和烃中除去1个氢原子的一价基团。
炔基的碳原子数没有特别限定，例如为2～20，优选为2～10，进一步优选为2～6。
作为炔基的例子，可举出：乙炔基、炔丙基、1-丁炔基等。
在本说明书中，“环烷基”是指来源于饱和脂肪族烃环的一价基团。
环烷基的碳原子数没有特别限定，例如为3～20，优选为5～12，进一步优选为5～10。
作为环烷基的例子，可举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片基、金刚烷基等。
在本说明书中，“环烯基”是指来源于含碳-碳双键的不饱和脂肪族烃环的一价基团。
环烯基的碳原子数没有特别限定，例如为3～20，优选为5～12，进一步优选为5～10。
作为环烯基的例子，可举出：环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、降冰片烯基、金刚烯基等。
在本说明书中，“芳香烃环基”是指来源于芳香烃环的一价基团，也称为“芳基”。
芳香烃环的构成原子数没有特别限定，例如为6～20，优选为6～14，进一步优选为6～12，特别优选为6～10。
芳香烃环可以是单环，也可以是稠环(例：二～三环式稠环)。
作为芳香烃环基的例子，可举出：苯基、茚基、萘基、芴基、菲基、蒽基等。
在本说明书中，“杂环”以包含“脂肪族杂环”和“芳香族杂环”的含义来使用。
在本说明书中，“脂肪族杂环”是指含有碳原子和选自氮原子、氧原子、硫原子、硅原子等所组成的组中的至少一个杂原子作为环的构成原子的脂肪族环。
脂肪族杂环的构成原子数没有特别限定，例如为5～20，优选为5～12，进一步优选为6～10。
脂肪族杂环的构成原子之中，杂原子数没有特别限定，例如为1～4。
作为脂肪族杂环的例子，可举出：含氧脂肪族杂环(例：四氢呋喃、二氧杂环戊烷、吡喃、四氢吡喃、二噁烷)、含硫脂肪族杂环(例：四氢噻吩、硫代吡喃、四氢硫代吡喃)、含氮脂肪族杂环(例：吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷)、含氮和氧的脂肪族杂环(例：吗啉)、含氮和硫的脂肪族杂环(例：硫代吗啉)、含硅氧烷键的脂肪族杂环等。
在本说明书中，“芳香族杂环”是指含有碳原子和选自氮原子、氧原子、硫原子等所组成的组中的至少一个杂原子作为环的构成原子的芳香族环。
芳香族杂环的构成原子数没有特别限定，例如为5～20，优选为5～12，进一步优选为6～10。
芳香族杂环的构成原子之中，杂原子数没有特别限定，例如为1～4。
芳香族杂环可以是单环，也可以是稠环(例：二～三环式稠环)。
作为芳香族杂环的例子，可举出：含氧芳香族杂环(例：呋喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、色原烷、苯并吡喃、呫吨)、含硫芳香族杂环(例：噻吩、噻蒽)、含氮芳香族杂环(例：吡咯、咪唑、吡唑、三唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚、异吲哚、吲哚嗪、嘌呤、喹啉、异喹啉、1,8-萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、蝶啶、咔唑、菲啶、吖啶、嘧啶、吩嗪)、含氧和硫的芳香族杂环(例：吩噁)、含氮和氧的芳香族杂环(例：噁唑、异噁唑、呋咱、吩噁嗪)、含氮和硫的芳香族杂环(例：噻唑、异噻唑、吩噻嗪)等。
在本说明书中，“杂环基”是指从上述杂环中除去1个氢原子的一价基团。
在本说明书中，“任选有取代基的”或“任选被取代基取代”是指以包括不具有取代基的情况和代替任意的氢原子而具有1个取代基、或2个以上同种或异种取代基的情况这两者的含义来使用。予以说明，具有取代基的情况下，取代基数目没有特别限定，例如为1～3，优选为1或2。
在本说明书中，“取代基”是指代替氢原子的原子或原子团。作为取代基的例子，可举出：卤素原子(例：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、氧代基(＝O)、硫代基(＝S)、羟基、巯基、氨基、羧基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、炔基、酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氰基、杂环基、它们2种以上的组合(例：卤代烷基、氰烷基、芳烷基、烷氧基、烷基氨基)等。
予以说明，“2种以上的组合”包含作为各自的取代基而例示的基团的任意的组合。
在本说明书中，“Cx-y”是指后续基团的碳原子数是x以上且y以下。x和y是正的整数，x<y。
在本说明书中，“卤代烷基”是指被1个或2个以上的同种或异种卤素原子取代的烷基。
卤代烷基的优选例是C1-6卤代烷基，更优选例是C1-4卤代烷基，进一步优选例是三氟甲基、三氯甲基或2,2,2-三氟乙基。
在本说明书中，“氰烷基”是指被1个或2个以上的氰基取代的烷基。
氰烷基的优选例是C1-6氰烷基，更优选例是C1-4氰烷基，进一步优选例可举出氰甲基或2-氰乙基。
在本说明书中，“芳烷基”是指被1个或2个以上的同种或异种芳基取代的烷基。
芳烷基的优选例是C6-14芳基C1-4烷基，更优选例是苯甲基(即，苄基)、苯基乙基(即，苯乙基)、萘甲基、萘乙基、三苯基甲基(即，三苯甲基)或芴甲基。
在本说明书中，“烷氧基”是指式：-O-烷基所表示的基团。烷氧基的优选例是C1-6烷氧基，更优选例是甲氧基、乙氧基、丙氧基(例：正丙氧基、异丙氧基)或丁氧基(例：叔丁氧基)。
予以说明，卤代烷氧基和氰基烷氧基分别是指式：-O-卤代烷基所表示的基团和式：-O-氰烷基所表示的基团。
在本说明书中，“烷硫基”是指式：-S-烷基所表示的基团。烷硫基的优选例是C1-6烷硫基，更优选例是甲硫基、乙硫基、丙硫基(例：正丙硫基、异丙硫基)或丁硫基。
予以说明，卤代烷硫基和氰基烷硫基分别是指式：-S-卤代烷基所表示的基团和式：-S-氰烷基所表示的基团。
在本说明书中，“烷基氨基”是指被1个或2个的同种或异种烷基取代的氨基。
烷基氨基包含单烷基氨基和二烷基氨基。
单烷基氨基的优选例是单C1-6烷基氨基，更优选例是单甲基氨基、单乙基氨基、单丙基氨基(例：单(正丙基)氨基、单(异丙基)氨基)或单丁基氨基。
二烷基氨基的优选例是二C1-6烷基氨基，更优选例是二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基(例：二(正丙基)氨基、二(异丙基)氨基)或二丁基氨基。
在本说明书中，“具有取代基的膦基”是指膦基(-PH2)中的至少1个氢原子被其他原子或原子团取代的基团。
作为具有取代基的膦基的例子，可举出：式：-P(R7)(R8)(式中，R7和R8相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基或烷基氨基)所表示的基团等。
在本说明书中，“任选有取代基的二羟基亚膦酰基”是指二羟基亚膦酰基(即，膦酰基)(-P(＝O)(OH)2)、或至少1个氢原子被其他原子或原子团(例：羟基的保护基)取代的二羟基亚膦酰基。
后者的基团包含任选有取代基的下式：
Figure BDA0004143951850000111
所表示的基团(以下称为“二磷酸基”)和任选有取代基的下式：
[化15]
Figure BDA0004143951850000112
所表示的基团(以下称为“三磷酸基”)。
在本说明书中，“任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基”是指羟基巯基亚膦酰基(-P(＝O)(OH)(SH))、或至少1个氢原子被其他原子或原子团(例：羟基的保护基)取代的羟基巯基亚膦酰基。
在本说明书中，“羟基的保护基”是指为了使羟基在化合物或其盐的合成中或者在寡核苷酸或其盐的合成中不参与反应的一价基团。
羟基的保护基，例如可举出在酸性或中性条件下稳定并可通过加氢分解、水解、电分解和光分解这样的方法裂解的基团等，但不限定于此。
羟基的保护基的例子包含任选有取代基的酰基、具有取代基的磺酰基和具有取代基的甲硅烷基。
在本说明书中，“酰基”是指式：-C(＝O)-R(式中，R是烃基)所表示的基团。R所表示的烃基可以是直链或支链状烃基(例：烷基)，可以是饱和或不饱和烃环基(例：环烷基、芳基)，也可以是它们的组合(例：芳烷基)。
酰基包含烷基羰基、芳基羰基和芳烷基羰基。
烷基羰基的优选例是(C1-10烷基)羰基，更优选例是乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、新戊酰基、戊酰基、异戊酰基、辛酰基、壬酰基或癸酰基。
芳基羰基的优选例是(C6-14芳基)羰基，更优选例是苯甲酰基或萘甲酰基(即，α-萘甲酰基、β-萘甲酰基)。
芳烷基羰基的优选例是(C6-14芳基C1-4烷基)羰基，更优选例是苄基羰基。
予以说明，“酰基氧基”、“酰基硫基”和“酰基氨基”中的酰基也可例示与上述同样的基团。
在本说明书中，“具有取代基的磺酰基”是指式：-S(＝O)2R(式中，R与上述相同)所表示的基团。
具有取代基的磺酰基包含具有任选有取代基的烷基的磺酰基和具有任选有取代基的芳基的磺酰基。具有烷基的磺酰基的优选例是C1-6烷基磺酰基，更优选例是甲磺酰基或乙磺酰基。
具有芳基的磺酰基的优选例是C6-14芳基磺酰基，更优选例是苯磺酰基或对甲苯磺酰基。
在本说明书中，“具有取代基的甲硅烷基”是指甲硅烷基(-SiH3)中的至少1个氢原子被其他原子或原子团取代的甲硅烷基。
“具有取代基的甲硅烷基”的典型例子是式：-Si(R6)3(式中，各R6相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团。作为该基的例子，可举出：三烷基甲硅烷基(例：三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基等三C1-6烷基甲硅烷基)、二烷基芳基甲硅烷基(例：二甲基苯基甲硅烷基等二C1-6烷基C6-14芳基甲硅烷基)、烷基二芳基甲硅烷基(例：叔丁基二苯基甲硅烷基等C1-6烷基二C6-14芳基甲硅烷基)、三芳基甲硅烷基(例：三苯基甲硅烷基等三C6-14芳基甲硅烷基)等。
在本说明书中，“氨基的保护基”是指为了使氨基在化合物或其盐的合成中或者在寡核苷酸或其盐的合成中不参与反应的一价基团。
氨基的保护基，例如可举出在酸性或中性条件下稳定并可通过加氢分解、水解、电分解和光分解这样的方法裂解的基团等，但不限定于此。
氨基的保护基的例子包含任选有取代基的酰基(例：任选有取代基的烷基羰基、任选有取代基的芳基羰基、任选有取代基的芳烷基羰基)、任选有取代基的N,N-二烷基胺基甲亚基、任选有取代基的烷氧基羰基、任选有取代基的烯氧基羰基、任选有取代基的芳氧基羰基、任选有取代基的芳烷氧基羰基和具有取代基的磺酰基。
在本说明书中，“胺基甲亚基”(ホルムアミジル基、formamidyl group)是指式：＝CH-NH2所表示的基团。N,N-二烷基胺基甲亚基的优选例是N,N-二(C1-6烷基)胺基甲亚基，更优选例是N,N-二(C1-4烷基)胺基甲亚基，进一步优选例是N,N-二甲基胺基甲亚基或N,N-二乙基胺基甲亚基。
在本说明书中，“烷氧基羰基”是指式：-C(＝O)-O-烷基所表示的基团。
烷氧基羰基的优选例是(C1-6烷氧基)羰基，更优选例是甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基或丁氧基羰基(例：叔丁氧基羰基)。
在本说明书中，“烯氧基羰基”是指式：-C(＝O)-O-烯基所表示的基团。
烯氧基羰基的优选例是(C2-9烯氧基)羰基，更优选例是烯丙氧基羰基。
在本说明书中，“芳氧基羰基”是指式：-C(＝O)-O-芳基所表示的基团。
芳氧基羰基的优选例是(C6-14芳氧基)羰基，更优选例是苯氧基羰基或萘氧基羰基。
在本说明书中，“芳烷氧基羰基”是指式：-C(＝O)-O-芳烷基所表示的基团。
芳烷氧基羰基的优选例是(C6-14芳基C1-4烷氧基)羰基，更优选例是苄氧基羰基或芴甲基氧基羰基。
在本说明书中，“功能性分子单元取代基”是指包含如下基团的概念：标记官能团(例：荧光标记官能团、化学发光标记官能团、含放射性核素基团)、具有嵌入能力的基团、具有核酸结合能力的基团、核酸切割活性官能团、具有细胞内迁移或核内迁移能力的基团和具有金属螯合能力的基团等。
作为荧光标记官能团的例子，可举出：羧基荧光素(FAM)、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、噻唑橙(对甲苯磺酸1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉盐)等荧光标记试剂的残基等。作为化学发光标记官能团的例子，可举出：氯化三(联吡啶)钌(II)等化学发光标记试剂的残基等。作为含放射性核素基团的例子，可举出：含有11CH3-、14CH3-、18F-或32P-的基团等。
作为具有嵌入能力的基团的例子，可举出：具有蒽骨架的基团、具有芘骨架的基团、具有蒽醌骨架、吖啶骨架的基团、具有萘甲酰胺骨架的基团等。另外，作为其他例子，可举出：他莫昔芬等嵌入剂的残基等。
作为具有核酸结合能力的基团的例子，可举出：纺锤菌素、远霉素、PI(吡咯咪唑)聚酰胺等核酸结合剂的残基等。
作为核酸切割活性官能团的例子，可举出：核酸内切酶、双(联吡啶)
Figure BDA0004143951850000131
醌二亚胺铑(II)配合物等核酸切割剂的残基等。
作为具有细胞内迁移或核内迁移能力的基团的例子，可举出：TAT(Twin-ArginineTranslocation)信号肽、聚精氨酸、GalNac(N-乙酰半乳糖胺)、来源于SV40T抗原的信号肽等细胞内迁移或核内迁移信号肽的残基等。
作为具有金属螯合能力的基团的例子，可举出：EDTA、冠醚、穴状配体等金属螯合剂的残基等。
在本说明书中，“杂交”是指指定的多核苷酸或寡核苷酸的全部或一部分在严格的条件下与其他多核苷酸或寡核苷酸的全部或一部分经氢键形成双链。“严格的条件”只要是在进行多核苷酸或寡核苷酸的杂交时本领域技术人员一般使用的条件即可。例如可举出：在两个多核苷酸分子或寡核苷酸分子之间有至少50％、优选至少75％、更优选至少90％的序列一致性时一方的多核苷酸分子或寡核苷酸分子可与另一方的多核苷酸分子或寡核苷酸分子特异性地杂交的条件。已知杂交的严格度是温度、盐浓度、多核苷酸或寡核苷酸的碱基长和GC含量、以及杂交缓冲液中所含的离液剂(chaotropic agent)的浓度的函数。作为严格的条件，例如可使用美国纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York)出版的Sambrook,J.等人于1998年编著的《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版))中记载的条件等。
在本说明书中，“检查”是指以诊断、研究等目的考察试样中的核酸等受测物。“检查试样”是指供检查的试样。
在本说明书中，各数值范围的上限和下限可任意地组合。
<<化合物或其盐>>
本发明的化合物或其盐是下式(1)所表示的化合物或其盐：
[化16]
Figure BDA0004143951850000141
(式中，Base、A1、R1～R5和n与上述相同。予以说明，在呋喃糖的碳原子处标注位置编号)
下面将式(N)所表示的化合物或其盐称为“化合物(N)”。
化合物(1)在R1或R2是任选有取代基的二羟基亚膦酰基或任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基的情况下称为“核苷酸”，在其他基团的情况下称为“核苷”。
Base的优选例是任选有取代基的芳香族杂环基。
上述芳香族杂环基优选为含氮芳香族杂环基。
上述含氮芳香族杂环基优选为六至十元环的含氮芳香族杂环基。上述六至十元环的含氮芳香族杂环基优选为2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基、2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基、嘌呤-9-基或6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基。
取代上述芳香族杂环基的取代基的优选例是选自烷基、酰基和任选被氨基的保护基取代的氨基组成的组中的至少一种。上述取代基数目没有特别限定，例如为1～3。
Base的更优选例是任选有取代基的胸腺嘧啶基、任选有取代基的胞嘧啶基、任选有取代基的腺嘌呤基或者任选有取代基的鸟嘌呤基。上述取代基优选为选自烷基、酰基和N,N-二烷基胺基甲亚基组成的组中的至少一种，更优选为C1-4烷基、(C1-4烷基)羰基、(C6-14芳基)羰基或N,N-二(C1-4烷基)胺基甲亚基。上述取代基数目优选为1～3。
Base的进一步优选例是选自下述组成的组中的基团：
2,4-二氧代-5-甲基-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基(例：胸腺嘧啶-1-基)、
2-氧代-4-氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，胞嘧啶-1-基)、
2-氧代-4-酰基氨基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，N-酰基-胞嘧啶-1-基)、
2-氧代-4-氨基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，5-甲基胞嘧啶-1-基)、
2-氧代-4-酰基氨基-5-甲基-1,2-二氢嘧啶-1-基(即，N-酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基)、
6-氨基-9H-嘌呤-9-基(即，腺嘌呤-9-基)、
6-酰基氨基-9H-嘌呤-9-基(即，N-酰基-腺嘌呤-9-基)、
2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基(例：鸟嘌呤-9-基)、
2-酰基氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基(例：N-酰基-鸟嘌呤-9-基)，以及，
2-(N,N-二烷基胺基甲亚基)氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基(例：N-(N,N-二烷基胺基甲亚基)-鸟嘌呤-9-基)。
Base的最优选例是选自下述组成的组中的基团：
胸腺嘧啶-1-基、
5-甲基胞嘧啶-1-基、
N-乙酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基、
N-异丁酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基、
N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基、
腺嘌呤-9-基、
N-乙酰基-腺嘌呤-9-基、
N-异丁酰基-腺嘌呤-9-基、
N-苯甲酰基-腺嘌呤-9-基、
鸟嘌呤-9-基、
N-乙酰基-鸟嘌呤-9-基、
N-异丁酰基-鸟嘌呤-9-基、
N-苯甲酰基-鸟嘌呤-9-基，以及，
N-(N,N-二甲基胺基甲亚基)-鸟嘌呤-9-基。
A1优选为单键或C1-2亚烷基(例：亚甲基、二亚甲基)，进一步优选为单键。
R1的优选例是选自下述组成的组中的基团：
氢原子、
任选有取代基的烷基、
任选有取代基的芳基、
羟基的保护基、
具有取代基的膦基、
任选有取代基的二羟基亚膦酰基，以及，
任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基。
R1所表示的“任选有取代基的烷基”优选为任选有选自卤素原子、烷氧基和芳基组成的组中的至少一种取代基的烷基，更优选为任选被烷氧基取代的烷基或任选被烷氧基取代的芳烷基。上述取代基数目优选为1～3。
R1所表示的“任选有取代基的芳基”优选为任选有选自卤素原子、烷基和烷氧基组成的组中的至少一种取代基的芳基，更优选为任选被烷氧基取代的芳基。上述取代基数目优选为1～3。
R1所表示的“羟基的保护基”优选为烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基或是式：-Si(R6)3(式中，各R6相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团。
R1所表示的“具有取代基的膦基”优选为式：-P(R7)(R8)(式中，R7和R8相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基或烷基氨基)所表示的基团。该基的更优选例是下式：
[化17]
Figure BDA0004143951850000161
(式中，R7a和R7b相同或不同，是氢原子或烷基，R8a是氢原子、烷基、卤代烷基或氰烷基)所表示的膦基。
R1所表示的“任选有取代基的二羟基亚膦酰基”优选为二羟基亚膦酰基、二磷酸基或三磷酸基，更优选为二羟基亚膦酰基。这些基团可具有羟基的保护基作为取代基，其存在的全部或一部分羟基也可用羟基的保护基取代。
R1所表示的“任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基”优选为羟基巯基亚膦酰基。
R1的最优选例是氢原子、甲基、乙基、丙基、丁基、烯丙基、苄基、三苯甲基、甲氧基甲基、对甲氧基苄基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基、甲烷磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、下式中任一者所表示的膦基、二羟基亚膦酰基或羟基巯基亚膦酰基。
[化18]
Figure BDA0004143951850000162
R2的优选例与R1的优选例相同。
R1与R2组合的优选例是R1是氢原子或二甲氧基三苯甲基(例：4,4’-二甲氧基三苯甲基)与R2是下式所表示的膦基的组合。
[化19]
Figure BDA0004143951850000163
(式中，R7a和R7b相同或不同，是氢原子或烷基，R8a是氢原子、烷基、卤代烷基或氰烷基)
R1和R2与相邻的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成环的情况下，该环的优选例是任选有取代基的六至十元环的脂肪族杂环，该取代基的优选例是烷基。
该环的更优选例是下式中任一者所表示的脂肪族杂环。
[化20]
Figure BDA0004143951850000171
(式中，R9和R10相同或不同，是氢原子或烷基，R11～R14相同或不同，是烷基)
该环的进一步优选例是下式中任一者所表示的环。
[化21]
Figure BDA0004143951850000172
一个实施方式中，R3优选为氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、式：-Si(R6)3(式中，各R6相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团、标记官能团、具有嵌入能力的基团、具有核酸结合能力的基团、核酸切割活性官能团、具有细胞内迁移或核内迁移能力的基团或具有金属螯合能力的基团。
其他实施方式中，R3优选为式：R31-X-所表示的基团。
R31的优选例是下式(A)所表示的基团。
[化22]
Figure BDA0004143951850000173
(式中，R3a和R3b相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、或氨基的保护基，或者R3a和R3b与相邻的氮原子一同形成任选有取代基的环)
R3a优选为氢原子、烷基、芳基、芳烷基、或氨基的保护基，更优选为氢原子、烷基、或氨基的保护基。
R3a所表示的“氨基的保护基”优选为(C1-4烷基)羰基或(C1-4卤代烷基)羰基，更优选为乙酰基或三氟甲基羰基。
R3b的优选例与R3a的优选例相同。
R3a与R3b组合的优选例是R3a和R3b同时是氢原子的组合、R3a是氢原子和R3b是乙酰基或三氟甲基羰基的组合、R3a和R3b同时是甲基的组合、或者R3a和R3b同时是乙酰基或三氟甲基羰基的组合。
R3a和R3b与相邻的氮原子一同形成环的情况下，该环的优选例是任选有取代基的五至十元环的含氮脂肪族杂环，该取代基的优选例是烷基或酰基。
该环的更优选例是下式所表示的含氮脂肪族杂环。
[化23]
Figure BDA0004143951850000181
[式中，Z是单键、氧原子、S(＝O)p(式中，p是0、1或2)、C(R15)(R16)(式中，R15和R16相同或不同，是氢原子或烷基)或NR17(式中，R17是氢原子、烷基或酰基)]
该环的进一步优选例是下式所表示的含氮脂肪族杂环。
[化24]
Figure BDA0004143951850000182
[式中，R17a是氢原子、直链或支链状C1-4烷基(例：甲基、乙基、丙基、丁基)、或者(直链或支链状C1-4烷基)羰基(例：甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、丁基羰基)]
该环的最优选例是4-甲基哌嗪-1-基。
R31的优选的其他例是下式(B)：
[化25]
Figure BDA0004143951850000183
(式(B)中，R3c～R3f相同或不同，是氢原子、烷基、或氨基的保护基)所表示的基团。
R3c～R3f的优选例是氢原子、或氨基的保护基。
R3c优选为氢原子。
R3d优选为氨基的保护基，更优选为烷氧基羰基、卤代烷氧基羰基或氰基烷氧基羰基，特别优选为(C1-4烷氧基)羰基、(C1-4卤代烷氧基)羰基或(C1-4氰基烷氧基)羰基。
R3e优选为氨基的保护基，更优选为烷氧基羰基、卤代烷氧基羰基或氰基烷氧基羰基，特别优选为(C1-4烷氧基)羰基、(C1-4卤代烷氧基)羰基或(C1-4氰基烷氧基)羰基。
R3f优选为氢原子。
R31的最优选例是选自下述组中的基团。
[化26]
Figure BDA0004143951850000184
X的优选例是亚烷基、或该亚烷基中与氮原子结合的亚甲基和与R31结合的亚甲基以外的亚甲基中的至少一个被置换为-N(R32)-(式中，R32是氢原子或烷基)、-O-或-S(＝O)k-(式中，k是0、1或2)的基团。或者X的优选例是亚烷基、或该亚烷基中的相邻的两个碳原子之间具有-N(R32)-(式中，R32与上述相同)、-O-或-S(＝O)k-(式中，k是0、1或2)的基团。
X的进一步优选例是选自下述所组成的组中的基团：
式：-CmH2m-(式中，m是1～10的整数)所表示的基团、
式：-(CH2)m1-(N(R321)-(CH2)m2)m3-(式中，R321是氢原子或C1-4烷基，m1是2～10的整数，m2是2～4的整数，m3是1～5的整数，m3为2以上的整数时各R321可以互相相同或不同，各m2可以互相相同或不同)所表示的基团、
式：-(CH2)m4-(O-(CH2)m5)m6-(式中，m4是2～10的整数，m5是2～4的整数，m6是1～5的整数，m6为2以上的整数时各m5可以互相相同或不同)所表示的基团，以及，
式：-(CH2)m7-(S-(CH2)m8)m9-(式中，m7是2～10的整数，m8是2～4的整数，m9是1～5的整数，m9为2以上的整数时各m8可以互相相同或不同)所表示的基团。
X的最优选例是选自下述的基团：
式：-(CH2)m10-(式中，m10是1～6的整数)所表示的基团、
式：-C2H4-(N(R322)-C2H4)m11-(式中，R322是氢原子或C1-4烷基，m11是1～5的整数，m11为2以上的整数时，各R322可以互相相同或也可以不同)所表示的基团、
式：-C2H4-(O-C2H4)m12-(式中，m12是1～5的整数)所表示的基团，以及，
式：-C2H4-(S-C2H4)m13-(式中，m13是1～5的整数)所表示的基团。
上述亚烷基的碳原子上可任意取代的取代基优选为卤素原子、羟基、烷氧基、巯基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、酰基氧基、酰基氨基、酰基硫基。取代基数目根据亚烷基的碳原子数而不同，例如为1～3，优选为2或3。
一个实施方式中，优选为R3是式：R31-X-所表示的基团，R31是式(A)或式(B)所表示的基团，X是-CmH2m-(式中，m是1～10的整数)。
R4的优选例是氢原子或者任选有取代基的烷基。上述取代基优选为选自卤素原子、氧代基、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基和氰基所组成的组中的至少一种。上述取代基数目优选为1～3。
R4的更优选例是烷基。
R4的进一步优选例是C1-6烷基。
R4的最优选例是C1-4烷基。
R5的优选例是氢原子或者任选有取代基的烷基，上述取代基优选为选自卤素原子、氧代基、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基和氰基所组成的组中的至少一种。上述取代基数目优选为1～3。
R5的更优选例是氢原子或烷基。
R5的进一步优选例是氢原子或C1-6烷基。
R5的最优选例是氢原子或C1-4烷基。
化合物(1)优选为下述化合物(1A)或(1B)：
[化27]
Figure BDA0004143951850000201
(式中，Base和R1～R5与上述相同)。
化合物(1)进一步优选为化合物(1A)。一个实施方式中，化合物(1A)优选为下述化合物(1C)或(1D)：
[化28]
Figure BDA0004143951850000202
(式中，R33～R35相同或不同，是氢原子、烷基、或氨基的保护基，Base、R1、R2、R4、R5和m与上述相同)。
其他实施方式中，化合物(1A)优选为下述化合物(1A’)或(1A”)：
[化29]
Figure BDA0004143951850000203
(式中，Base和R1～R4与上述相同)。
上述盐可以是药学上允许的盐，也可以不是药学上允许的盐。上述盐可以是无机盐，也可以是有机盐。
作为上述盐的例子，可举出：碱金属盐(例：钠盐、钾盐、锂盐)、碱土金属盐(例：钙盐、镁盐)、其他金属盐(例：铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐)、铵盐、四甲基铵盐、胺盐(例：叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、氨基葡萄糖盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐)、无机酸盐(例：氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐)、有机酸盐(例：甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐)、氨基酸盐(例：甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐)。
<<化合物(1)的制造方法>>
化合物(1)例如可通过以下的反应方案1来获得，但并不限定于该反应方案，可组合公知的反应来合成。
[化30]
方案1
Figure BDA0004143951850000211
(式中，L是离去基团，Base、A1和R1～R4与前述相同)。
[反应方案1]
<工序(I)>
工序(I)是将化合物(2A)进行脱氢化(将-CH2-NH-氧化为-CH＝N-)得到化合物(1E)的工序。
化合物(2A)可通过已知的方法，例如美国专利申请公开第2007/167387号说明书中记载的方法来获得(美国专利申请公开第2007/167387号说明书作为参考包含在本说明书中)。
作为将化合物(2A)进行脱氢化的试剂(氧化剂)的例子，可举出：高价碘化合物。作为高价碘化合物的例子，可举出：(二乙酰氧基碘)苯、[双(三氟乙酰氧基)碘]苯、2-碘酰基苯磺酸、2-碘酰基苯甲酸、戴斯-马丁试剂等。
相对于化合物(2A)1摩尔，上述试剂的用量通常为0.5～6摩尔，优选为1～2摩尔。
脱氢化优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：亚砜系溶剂(例：二甲基亚砜)、卤素系溶剂(例：二氯甲烷)、这些两种以上的混合溶剂等。
脱氢化的温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为0～100℃，优选为20～60℃。
脱氢化的时间没有特别限定，例如为1～12小时，优选为4～6小时。
<工序(II)>
工序(II)是使化合物(1E)与式(3A)：R4·(式中，R4与上述相同)所表示的自由基或式(3B)：R4M(式中，M是金属原子或含金属原子的原子团，R4与上述相同)所表示的有机金属试剂进行反应得到化合物(1F)的工序。
作为产生自由基(3A)的化合物的例子，可举出：在氧的存在下产生乙基自由基的化合物(例：三乙基硼)等。R4为乙基的情况下，可单独使用三乙基硼，R4为乙基以外的情况下，可将三乙基硼与式：R4-Halo(式中，Halo是卤素原子)所表示的化合物组合使用。
相对于化合物(1E)1摩尔，上述反应系中产生的自由基(3A)的量通常为4～20摩尔，优选为8～12摩尔。
化合物(3B)中，作为M，例如可举出：Li、Na、K、Zn、Cu、Ce、MgCl、MgBr、MgI等。一个实施方式中，化合物(3B)优选为格利雅试剂(Grignard reagent)。
相对于化合物(1E)1摩尔，化合物(3B)的用量通常为1～10摩尔，优选为2～6摩尔。
上述反应优选在路易斯酸的存在下进行。
作为路易斯酸的例子，例如可举出：氯化锌、四氯化锡、四氯化钛、三氟化硼、三氟化硼二乙醚(BF3·OEt2)、三氯化硼、三氟甲磺酸三甲基硅脂((CH3)3SiOSO2CF3)等。
相对于化合物(1E)1摩尔，路易斯酸的用量通常为4～20摩尔，优选为8～12摩尔。
上述反应优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：芳香烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、卤代烃系溶剂(例：二氯甲烷)、这些两种以上的混合溶剂等。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为-78～40℃，优选为0～30℃。
上述反应的反应时间没有特别限定，例如为0.1～2小时，优选为0.5～1小时。
<工序(IIIa)>
工序(IIIa)是将化合物(1F)脱氢化(将-C(H)(R4)-NH-氧化为-CR4＝N-)得到化合物(1G)的工序。该脱氢化可与工序(I)同样进行。
予以说明，可通过使化合物(1G)与式(3C)：R5·(式中，R5与上述相同)所表示的自由基或式(3D)：R5M(式中，M是金属原子或含金属原子的原子团，R4与上述相同)所表示的有机金属试剂所表示的化合物进行反应来导入R5。该反应可通过《有机化学通讯》(OrganicLetters)1999,1,4,569-572，《四面体通讯》(Tetrahedron Letters)39(1998)3237-3240所述的方法进行。
<工序(IIIb)>
工序(IIIb)是将化合物(1G)氢化(将-CR4＝N-还原为-C(H)(R4)-NH-)得到化合物(1H)的工序。
作为将化合物(1G)氢化的试剂(还原剂)的例子，可举出：氢化二异丁基铝、氢化铝锂、硼氢化钠等。
相对于化合物(1G)1摩尔，上述试剂的用量通常为1～10摩尔，优选为3～5摩尔。
氢化优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：芳香烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、卤代烃系溶剂(例：二氯甲烷)、这些两种以上的混合溶剂等。
氢化的温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为-20～-78℃，优选为-60～-78℃。
氢化的时间没有特别限定，例如为0.5～6小时，优选为1～3小时。
<工序(IIIc)>
工序(IIIc)是使化合物(1H)与式(4A)：R3-L(式中，L是离去基团，R3与上述相同，但不是氢)所表示的化合物进行反应得到化合物(1I)的工序。
化合物(4A)中，作为L所表示的离去基团的例子，可举出：卤素原子(例：氯原子、溴原子、碘原子)、烷基磺酰氧基(例：甲磺酰氧基)、卤代烷基磺酰氧基(例：三氟甲基磺酰氧基)或芳基磺酰氧基(例：甲苯磺酰氧基)等。
相对于化合物(1H)1摩尔，化合物(4A)的用量通常为1～8摩尔，优选为1～4摩尔。
上述反应优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：醚系溶剂(例：四氢呋喃)、腈系溶剂(例：乙腈)、芳香烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、这些两种以上的混合溶剂等。其中，优选芳香烃系溶剂，更优选选自甲苯和二甲苯所组成的组中的至少一种。
上述反应优选在碱的存在下进行。
作为碱的例子，可举出：无机碱[例：碱金属的碳酸盐(例：碳酸钠、碳酸铯)、碱金属的碳酸氢盐(例：碳酸氢钠)、碱土金属的碳酸盐(例：碳酸钙)、碱金属的氢氧化物(例：氢氧化钠、氢氧化钾)、碱土金属的氢氧化物(例：氢氧化钙)、金属醇化物(例：甲醇钠、乙醇钠)]、有机碱[例：叔胺(例：三烷基胺)、环状胺(例：4-(二甲基氨基)吡啶、二氮杂二环十一碳烯(DBU)、二氮杂二环壬烯(DBN)]、它们的组合等。其中，优选叔胺，更优选三C1-4烷基胺。
相对于化合物(2A)1摩尔，碱基的用量通常为2～10摩尔，优选为5～8摩尔。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为30～150℃，优选为50～120℃。
上述反应的反应时间没有特别限定，例如为1～24小时，优选为1～12小时。
予以说明，R3是任选有1或2个取代基的甲基的化合物(1Q)例如可通过包含下述工序(IIIc’)的方法来获得。
<工序(IIIc’)>
工序(IIIc’)是使化合物(1H)与式(4B)：R3g-C(＝O)-R3h(式中，R3g和R3h是R3的残基)所表示的羰基化合物进行反应得到化合物(1Q)的工序。
相对于化合物(1H)1摩尔，化合物(4B)的用量通常为1～6摩尔，优选为1～3摩尔。
上述反应优选在还原剂的存在下进行。
作为还原剂的例子，可举出：硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氰基硼氢化锂、三乙基硼氢化锂、三(仲丁基)硼氢化锂、三(仲丁基)硼氢化钾、三乙酰氧基硼氢化钠、氢化铝锂、双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠、它们的组合等。
相对于化合物(1H)1摩尔，还原剂的用量通常为1～8摩尔，优选为1～4摩尔。
上述反应优选在酸催化剂的存在下进行。作为酸催化剂的例子，可举出：对甲苯磺酸吡啶(PPTS)、乙酸、盐酸等。
上述反应优选在溶剂的存在下进行。作为溶剂的例子，可举出：醇系溶剂(例：甲醇)、醚系溶剂(例：四氢呋喃)、这些两种以上的混合溶剂等。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为0～100℃，优选为0～40℃。
上述反应的反应时间没有特别限定，例如为0.5～12小时，优选为1～4小时。
予以说明，R3是式：R31-X-所表示的基团的化合物(1I)例如可通过包含下述的工序(IIId)～(IIIf)的方法获得。
(IIId)使化合物(1H)与下式(4C)所表示的化合物进行反应，得到下式(1H’)所表示的化合物的工序；
[化31]
Figure BDA0004143951850000241
(式(4C)中，X和L与上述相同)
[化32]
Figure BDA0004143951850000242
(式(1H’)中，Base、A1、R1、R2、R4和X与上述相同)
(IIIe)使化合物(1H’)与肼化合物进行反应，得到下式(1H”)所表示的化合物的工序；
[化33]
Figure BDA0004143951850000251
以及，
(IIIf)任选将化合物(1H”)的氨基用氨基的保护基保护或者将化合物(1H”)进行胍基化的工序。
<工序(IIId)>
工序(IIId)可与工序(IIIc)同样进行。
<工序(IIIe)>
相对于化合物(1H’)1摩尔，肼化合物的用量通常为1～10摩尔，优选为1.1～3.5摩尔。
反应优选在溶剂的存在下进行。作为溶剂的例子，可举出：水、醇系溶剂(例：甲醇、乙醇)、这些两种以上的混合溶剂等。
<工序(IIIf)>
将化合物(1H”)的氨基用氨基的保护基保护的方法，可采用公知或惯用的方法。例如，导入三氟甲基羰基作为化合物(1H”)的氨基的保护基的工序是使化合物(1H”)与三氟乙酸或其衍生物(例：三氟乙酸酐)进行反应的工序。上述反应优选在溶剂的存在下进行。溶剂的优选例是环状胺(例：吡啶)。
化合物(1H”)的胍基化通常通过与胍基化剂的反应来进行。作为胍基化剂的例子，可举出：氮系胍基化剂、硫系胍基化剂等。
作为氮系胍基化剂的例子，可举出下式所表示的化合物等：
[化34]
Figure BDA0004143951850000252
(式中，L3是离去基团，R3c～R3e与上述相同)。
L3所表示的离去基团的例子与L同样。
氮系胍基化剂优选为1-脒基吡唑盐酸盐、1-甲脒基-1,2,4-三唑盐酸盐、1-(N-叔丁氧基-脒基)吡唑、1-(N-苄氧基-脒基)吡唑、1-[N,N’-(二叔丁氧基)脒基]吡唑、1-[N,N’-(二苄氧基)脒基]吡唑、1,2,3-三(叔丁氧基羰基)胍或Goodman试剂。
作为硫系胍基化剂的例子，可举出下式所表示的化合物等：
[化35]
Figure BDA0004143951850000253
(式中，R3c～R3e与上述相同)。
硫系胍基化剂优选为N,N’-二叔丁氧基-S-甲基异硫脲或1,3-二叔丁氧基硫脲。
相对于化合物(1H”)1摩尔，胍基化剂的用量通常为0.5～10摩尔，优选为0.8～2.0摩尔。
化合物(1H”)与胍基化剂的反应优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：卤代烃系溶剂(例：二氯甲烷)、酰胺系溶剂(例：N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮)、这些两种以上的混合溶剂等。其中，优选酰胺系溶剂，更优选N,N-二甲基甲酰胺。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为15～30℃。
<工序(IV)>
工序(IV)是使化合物(1F)与化合物(4A)进行反应得到化合物(IJ)的工序。该反应可与工序(IIIc)同样进行。另外，R3是式：R31-X-所表示的基团的化合物(1J)例如可通过包含与工序(IIId)～(IIIf)同样的工序的方法来得到。
<工序(IV’)>
工序(IV’)是使化合物(1F)与化合物(4B)进行反应得到化合物(1R)的工序。该工序可与工序(IIIc’)同样进行。
化合物(1)、(1A)～(1J)、(1Q)、(1R)和(2A)的Base例如可通过以下的反应方案2转化。
[化36]
Figure BDA0004143951850000261
(式中，Q1是氢原子或取代基，Q2和Q3相同或不同，是氢原子或氨基的保护基(但Q2和Q3不同时是氢原子)，Q4～Q7相同或不同，是氢原子或氨基的保护基，环G是五元或六元的含氮杂环)
[反应方案2]
<工序(V)>
工序(V)是将化合物(1)、(1A)～(1J)、(1Q)、(1R)和(2A)中的Base从“任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基”转化为“任选有取代基的2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基”的工序，包含工序(Va)～工序(Vc)。
<工序(Va)>
工序(Va)是将Base是“任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基”的化合物(1K)与式(5A)所表示的化合物和磷酸卤化物进行反应得到化合物(1L)的工序。
化合物(1K)中，Q1优选为氢原子或烷基，进一步优选为氢原子或C1-4烷基。
化合物(5A)优选为五元的含氮杂环化合物，更优选为三唑。
相对于化合物(1K)1摩尔，化合物(5A)的用量通常为5～20摩尔，优选为7～9摩尔。
磷酸卤化物优选为三氯氧磷。
相对于化合物(1K)1摩尔，磷酸卤化物的用量通常为1～5摩尔，优选为1～3摩尔。
上述反应优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：腈系溶剂(例：乙腈)、醚系溶剂(例：四氢呋喃)、卤素系溶剂(例：卤代烷烃)、这些两种以上的混合溶剂等。其中，优选腈系溶剂(例：乙腈)。
上述反应优选在碱的存在下进行。
作为碱的例子，可举出：无机碱[例：碱金属的碳酸盐(例：碳酸钠、碳酸铯)、碱金属的碳酸氢盐(例：碳酸氢钠)、碱土金属的碳酸盐(例：碳酸钙)、碱金属的氢氧化物(例：氢氧化钠、氢氧化钾)、碱土金属的氢氧化物(例：氢氧化钙)、金属醇化物(例：甲醇钠、乙醇钠)]、有机碱[例：叔胺(例：三烷基胺)、环状胺(例：4-(二甲基氨基)吡啶、二氮杂二环十一碳烯(DBU)、二氮杂二环壬烯(DBN)]、它们的组合等。其中，优选叔胺，更优选三C1-4烷基胺。
相对于化合物(1K)1摩尔，碱基的用量通常为5～20摩尔，优选为10～15摩尔。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限定，例如为-5℃～10℃。
上述反应，例如也可采用美国专利第5359067号说明书中记载的方法。
<工序(Vb)>
工序(Vb)是使化合物(1L)与氨进行反应得到化合物(1M)的工序。
相对于化合物(1L)1摩尔，氨的用量通常为5～100摩尔，优选为20～50摩尔。
上述反应优选在溶剂的存在下进行。
作为溶剂的例子，可举出：酰胺系溶剂(例：N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮)、醚系溶剂(例：四氢呋喃、二噁烷等环状醚)、这些两种以上的混合溶剂等。其中，优选醚系溶剂，更优选环状醚，进一步优选选自四氢呋喃和二噁烷中的至少一种。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限定，例如为15～30℃。
<工序(Vc)>
工序(Vc)是将化合物(1M)的氨基用保护基保护得到化合物(1N)的工序。将上述氨基用保护基保护的方法，可采用公知(例如，美国专利申请公开第2007/167387号说明书)或惯用的方法。
<工序(VI)>
工序(VI)是将化合物(1)、(1A)～(1J)、(1Q)、(1R)和(2A)中的Base从“任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基”转化为“任选有取代基的嘌呤-9-基”的工序。
工序(VI)具体是将Base是“任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基”的化合物(1K)与式(5B)所表示的化合物进行反应得到化合物(1O)的工序。
相对于化合物(1K)1摩尔，化合物(5B)的用量通常为1～5摩尔，优选为1～3摩尔。
上述反应优选在路易斯酸的存在下进行。
作为路易斯酸的例子，可举出：三氟甲磺酸三甲基硅酯。
相对于化合物(1K)1摩尔，路易斯酸的用量通常为0.5～5摩尔，优选为1～3摩尔。
上述反应优选在甲硅烷基化剂的存在下进行。
作为甲硅烷基化剂的例子，可举出：N,O-双-三甲基甲硅烷基乙酰胺(BSA)、N,O-双-甲硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)、六甲基二硅氮烷(HMD)、N,O-双-叔丁基二甲基甲硅烷基乙酰胺、N-(三甲基甲硅烷基)二乙基胺、N-(三甲基甲硅烷基)二甲胺、N-甲氧基-N,O-双(三甲基甲硅烷基)氨基甲酸酯、N-甲基-N-三甲基甲硅烷基乙酰胺、N-甲基-N-三甲基甲硅烷基七氟丁酰胺、N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺、N-三甲基甲硅烷基乙酰胺、这些两种以上的组合等。其中，优选N,O-双-三甲基甲硅烷基乙酰胺(BSA)。
相对于化合物(1K)1摩尔，甲硅烷基化剂的用量通常为1～20摩尔，优选为3～8摩尔。
上述反应的反应温度，只要反应进行就没有特别限制，例如为30～150℃，优选为50～120℃。
上述反应，例如也可采用美国专利申请公开第2012/071646号说明书中记载的方法(美国专利申请公开第2012/071646号说明书作为参考包含在本发明中)。
<工序(VII)>
工序(VII)是将化合物(1)、(1A)～(1J)、(1Q)、(1R)和(2A)中的Base从“任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基”转化为“任选有取代基的6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基”的工序。
工序(VII)具体是使Base是“任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基”的化合物(1K)与式(5C)所表示的化合物进行反应得到化合物(1P)的工序。
该反应可在与工序(VI)同样的条件下进行。
根据需要，化合物(1)的制造方法可进一步包含通过常规方法，例如，浓缩、重结晶、硅胶柱色谱等对中间产物和终产物进行纯化的工序。
<<包含化合物(1)的组合物>>
本发明的组合物含有以上所述的化合物(1)。
组合物可仅含有一种的化合物(1)，也可含有两种以上的化合物(1)。例如，组合物可含有选自下述所组成的组中的1种、2种、3种或4种的化合物：
Base是胸腺嘧啶-1-基的化合物(1)；
Base是5-甲基胞嘧啶-1-基、N-乙酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基、N-异丁酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基或N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶-1-基的化合物(1)；
Base是腺嘌呤-9-基、N-乙酰基-腺嘌呤-9-基、N-异丁酰基-腺嘌呤-9-基或N-苯甲酰基-腺嘌呤-9-基的化合物(1)；以及，
Base是鸟嘌呤-9-基、N-乙酰基-鸟嘌呤-9-基、N-异丁酰基-鸟嘌呤-9-基；N-苯甲酰基-鸟嘌呤-9-基或N-(N,N-二甲基胺基甲亚基)-鸟嘌呤-9-基的化合物(1)。
作为组合物的形态，可举出：液体。
组合物的形态为液体的情况下，组合物通常包含溶剂。作为溶剂，可使用公知的溶剂，可优选举出：卤代烃系溶剂(例：二氯甲烷)、腈系溶剂(例：乙腈)、芳香烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、水、TE缓冲液等。其中，优选使用二氯甲烷、甲苯、乙腈等。
组合物通常容纳在容器中提供给使用者。
组合物可用于后述的寡核苷酸或其盐的合成。另外，组合物可用作药物组合物。
<<寡核苷酸或其盐>>
本发明的寡核苷酸或其盐具有下式(6)所表示的单元。
[化37]
Figure BDA0004143951850000291
(式中，Base、A1、R3～R5和n与上述相同)
上述单元优选为下式(6a)所表示的单元。
[化38]
Figure BDA0004143951850000292
(式中，A2为OH、O-、SH或S-，Base、A1、R3～R5和n与上述相同)
式(6a)所表示的单元优选为下式(6a-1)所表示的单元，进一步优选为下式(6a-2)或(6a-3)所表示的单元：
[化39]
Figure BDA0004143951850000301
(式中，Base、A1、A2、R3～R5、R33～R35和m与上述相同)。
下面，将具有式(6)或(6a)所表示的单元的寡核苷酸或其盐称为“寡核苷酸(6)”。
寡核苷酸(6)具有两个以上式(6)或(6a)所表示的单元的情况下，各单元的结构可以相同，也可不同。
寡核苷酸(6)除了包含式(6)或(6a)所表示的单元以外，还可包含其他单元。作为其他单元的例子，可举出：选自下式(7)～(10)所表示的单元中的至少一种等。
[化40]
Figure BDA0004143951850000302
(式中，A3相同或不同，是单键或任选有取代基的亚烷基，Ra是氢原子或羟基，Rb与R3相同，Base与上述相同)
上述其他单元，可优选举出：选自下式(7a)～(10a)所表示的单元中的至少一种。
[化41]
Figure BDA0004143951850000303
(式中，A4～A7相同或不同，是OH、O-、SH或S-，Base、A3、Ra和Rb与上述相同)
予以说明，其他单元，例如可以是来源于美国专利申请公开第2003/105309号说明书、美国专利申请公开第2017/044528号说明书、美国专利申请公开第2006/166908号说明书、美国专利申请公开第2012/208991号说明书、美国专利申请公开第2015/266917号说明书、美国专利申请公开第2003/207841号说明书中记载的核苷酸的单元等(美国专利申请公开第2003/105309号说明书、美国专利申请公开第2017/044528号说明书、美国专利申请公开第2006/166908号说明书、美国专利申请公开第2012/208991号说明书、美国专利申请公开第2015/266917号说明书和美国专利申请公开第2003/207841号，作为参考包含在本说明书中)。
寡核苷酸(6)的碱基序列只要对目标DNA或目标RNA的碱基序列(全长或其一部分)是互补的，就没有特别限制。
寡核苷酸(6)的长度没有特别限定，可根据目标的碱基序列的长度进行选择。寡核苷酸(6)的长度下限，例如为5mer，优选为10mer，进一步优选为15mer，寡核苷酸(6)的长度上限，例如为200mer，优选为100mer，更优选为50mer，进一步优选为30mer。寡核苷酸(6)的长度例如为5～200mer，优选为5～50mer，更优选为10～40mer，进一步优选为15～30mer。寡核苷酸(6)的长度越长，对目标的碱基序列的结合力就越强。
寡核苷酸(6)中，式(6)所表示的单元的数目相对于核苷酸单元的总数的比例没有特别限定，可根据使用目的(引物、探针、Clamp核酸、药品等)适当设计。
寡核苷酸(6)可以是盐的形态。即，构成寡核苷酸(6)的核苷酸单元中至少一个核苷酸单元可以是盐的形态。上述盐可以是药学上允许的盐，也可以是药学上不允许的盐。上述盐可以是无机盐，也可以是有机盐。作为上述盐的例子，与化合物(1)例示的盐同样，可举出：碱金属盐、碱土金属盐、其他金属盐、铵盐、四甲基铵盐、胺盐、无机酸盐、有机酸盐、氨基酸盐等。
寡核苷酸(6)可通过标记物质修饰。标记物质没有特别限定，可以使用荧光物质、半抗原(例如，生物素、地高辛(digoxigenin)、DNP等)、放射性同位素等用作对核酸赋予标记的本领域中公知的物质。
寡核苷酸(6)的序列特异性高。
寡核苷酸(6)对于单链DNA的Tm值和对于单链RNA的Tm值高。即，寡核苷酸(6)牢固地结合于单链DNA和单链RNA，具有高的双链形成能力。特别是，寡核苷酸(6)对于单链RNA的Tm值与式(7)的DNA或RNA相比极高。
寡核苷酸(6)可适宜用作检查、或序列高选择性地检测单链RNA或单链DNA碱基序列的探针。
寡核苷酸(6)不易被核酸酶分解，给予到生物体后，可长时间存在于生物体内。寡核苷酸(6)例如可与正义RNA形成双链，抑制作为病因的生物体内成分(蛋白质)的mRNA的转录。另外，寡核苷酸(6)也可抑制感染病毒的增殖。
寡核苷酸(6)作为抗肿瘤剂、抗病毒剂等抑制基因活动而治疗疾病的药物是有用的。
另外，寡核苷酸(6)具有稳定且优异的作为反义或反基因或者适体的活性，或者具有作为特定基因的检测药或用于扩增开始的引物的优异的活性。
寡核苷酸(6)作为如下材料是有用的：各种生理/生物活性物质、医药品的材料、RNA干涉法、诱骗(Decoy)法用等的双链寡核苷酸的功能性材料、以cDNA等单链核酸为目标的DNA芯片、分子信标(molecular beacon)等功能性材料、用于各种反义法(包括核糖体、DNA酶)、反基因法、基因同源重组法用途的功能性材料、与荧光、发光物质组合的生物体微量成分的高灵敏度分析用材料、基因功能阐明等的研究用试剂的开发材料等。
<<寡核苷酸(6)的制造方法>>
寡核苷酸(6)可按照惯用的方法，例如，亚磷酰胺方案等合成。
例如，寡核苷酸(6)的制造方法包含如下工序。
(I)使下式(6B)所表示的化合物或其盐与选自下式(6C)～(10C)所表示的化合物或其盐中的至少一种进行反应的工序；
[化42]
Figure BDA0004143951850000321
(式(6B)中，R2a是任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基或者任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，Base、A1、R3～R5和n与上述相同)
Figure BDA0004143951850000322
(式中，R1a是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基或者任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，RA和RB相同或不同，是氢原子或烷基，RC是氢原子、烷基、卤代烷基或氰烷基，Base、A1、A3、R3～R5、n、Ra和Rb与上述相同)
以及/或，
(II)使下式(6C)所表示的化合物或其盐与选自下式(6B)～(10B)所表示的化合物或其盐中的至少一种进行反应的工序；以及，(III)将工序(I)和/或工序(II)中得到的化合物氧化(特别是将磷原子氧化)的工序。
[化44]
Figure BDA0004143951850000331
(式(6C)中，Base、A1、R1a、R3～R5、n和RA～RC与上述相同)
[化45]
Figure BDA0004143951850000332
(式中，Base、A1、A3、R2a、R3～R5、n、Ra和Rb与上述相同)
根据需要，寡核苷酸(6)的制造方法进一步包含将中间产物和终产物通过常规方法，例如，浓缩、重结晶、硅胶柱色谱、凝胶过滤、乙醇沉淀、制备HPLC等进行纯化的工序。
<<包含寡核苷酸(6)的组合物>>
本发明的组合物含有如上所述的寡核苷酸(6)。
组合物可仅含有一种的寡核苷酸(6)，也可含有两种以上的寡核苷酸(6)。
作为组合物的形态，可举出：液体、固体等。
组合物的形态为液体的情况下，组合物通常包含溶剂。作为溶剂，可使用公知的溶剂，可优选举出：卤代烃系溶剂(例：二氯甲烷)、腈系溶剂(例：乙腈)、芳香烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、水。这些之中，更优选水，更优选含有缓冲剂的水(缓冲液)。作为缓冲剂的例子，可举出：三羟甲基氨基甲烷(Tris缓冲液)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl缓冲液)、三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE缓冲液)、磷酸钠、2-吗啉乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺)亚氨二乙酸(ADA)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、2-氨基-N,N,N-三甲基乙烷氯化铵(cholamine chloride)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-三(羟甲基)甲基-2-甲磺酸(TES)、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、乙酰胺甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、甘氨酰胺、N,N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)等。
组合物可进一步含有盐。盐包含金属氯化物，作为其例子，可举出：NaCl、MgCl2、KCl等。
组合物可进一步含有添加物和共溶剂。作为其例子，可含有二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、牛血清白蛋白、硫酸铵、聚乙二醇(PEG)、明胶、非离子型表面活性剂。作为非离子型表面活性剂的例子，可举出：Tween20(注册商标)、Triton X-100(注册商标)等。
组合物的形态为固体的情况下，组合物例如可以是将寡核苷酸(6)负载于固相载体上而成的组合物等。固相载体，可举出能负载生物高分子的无机材料、有机材料。优选为玻璃(例：多孔玻璃(CPG)、硅胶、树脂(例：交联的非溶胀性聚苯乙烯树脂(HPS))等。这些之中，更优选HPS或CPG。
组合物通常容纳在容器中提供给使用者。
组合物可用于后述的目标核酸的扩增或检测、链侵入、RNAi等。另外，组合物可用作药物组合物。
<<目标核酸的检测方法>>
本发明包含目标核酸的检测方法。该方法包含如下工序：
(I)将目标核酸通过核酸扩增法选择性地扩增的工序；以及，
(II)对在上述工序(I)中扩增的目标核酸进行检测的工序。
上述扩增或检测中使用的寡核苷酸优选包含寡核苷酸(6)。
工序(I)的核酸扩增中，通常使用多个引物分子。多个引物分子之中，至少一部分可以是寡核苷酸(6)。例如，可使用包含寡核苷酸(6)的正向引物和不包含寡核苷酸(6)的反向引物。
工序(I)的核酸扩增中，有时使用多个引物分子和探针分子。该情形下，引物分子和探针分子之中，至少一部分可以是寡核苷酸(6)。例如，可使用不包含寡核苷酸(6)的正向引物、不包含寡核苷酸(6)的反向引物和包含寡核苷酸(6)的探针。
作为核酸扩增法，只要是可选择性地扩增目标核酸的方法，就没有特别限制。作为核酸扩增法的例子，可举出：PCR法(包含热启动PCR法、多重PCR法、巢式PCR法、RT-PCR法、实时PCR法、数字PCR法、TaqMan(注册商标)PCR法、Clamp PCR法等)、NASBA法(参考美国专利第5130238号说明书)、TMA法(参考美国专利第5399491号说明书)、TRC法(参考美国专利申请公开第2001/0053518号说明书)、LAMP法(参考美国专利第6410278号说明书)、ICAN法(参考美国专利申请公开第2003/073081号说明书)、LCR法(参考欧州专利申请号320328号)、SDA法(参考美国专利第5455166号说明书)等。
一个实施方式中，工序(I)的核酸扩增法优选为Clamp PCR法。Clamp PCR法中，至少使用引物和Clamp核酸。引物和Clamp核酸中的任一者或者二者可包含寡核苷酸(6)。
与目标核酸(例：变异型基因)相比，Clamp核酸通常更牢固地夹住(Clamp)检查试样中的非目标核酸(例：野生型基因)。Clamp核酸牢固地结合于非目标核酸，非目标核酸的扩增被抑制，由此可选择性地扩增目标核酸。例如，检测特定基因变异的情况下，通过在具有与野生型的基因序列完全互补的碱基序列的Clamp核酸的存在下进行核酸扩增，野生型核酸的扩增被抑制，变异型核酸被选择性地扩增。
具体地，例如将目标核酸的目标部位作为变异型基因的变异部位，将包含该变异部位(目标核酸的目标部位)的碱基序列作为“序列A”时，Clamp核酸与作为非目标核酸的野生型基因中与序列A相对应的碱基序列是完全互补的。
寡核苷酸(6)具有序列高选择性。因此，包含寡核苷酸(6)的Clamp核酸对即使相差1个碱基的碱基序列的结合能力也非常弱，可特异性地结合完全互补的碱基序列。另外，寡核苷酸(6)的Tm值高，形成稳定的双链。即，包含寡核苷酸(6)的Clamp核酸特异性地与非目标核酸牢固地结合，发挥高的Clamp能力。Clamp核酸的长度没有特别限定，例如为5～30mer。
工序(I)的核酸扩增可以是逆转录反应。逆转录反应中，以RNA为模板，通过RNA依赖性DNA聚合酶合成cDNA。由于寡核苷酸(6)牢固地与RNA结合，因此使检查试样中的特定的RNA与寡核苷酸(6)结合，可抑制从该RNA的逆转录反应。由此，可从目标RNA更特异地合成cDNA。合成的cDNA可用PCR法等进一步扩增。
目标核酸也可以是检查试样中包含的核酸。检查试样典型为从生物体采集的试样(以下也称为“生物体试样”)。通常使用由从生物体采集的试样通过混杂物的去除、核酸的提取/纯化、预扩增等预处理而得到的试样。具体可使用血液、血浆、血清、胸水、支气管清洗液、骨髓液、淋巴液、肠道清洗液、切除组织、鼻咽拭子液、唾液、鼻涕、咯痰等。另外，对这些进行了上述预处理的试样也包含在“生物体试样”中。由于本发明的方法可非常高灵敏度地检测核酸，因此例如可使用正常细胞与异常细胞混杂的切除组织来检测来源于异常细胞的基因变异。另外，即使检查试样微量的情况下或者检查试样中的核酸微量的情况下，本发明的方法也可适用。检查试样优选为包含目标核酸的溶液。在检测血液或切除组织所含的细胞内目标核酸的情况下，可通过公知的方法进行细胞的裂解。除了生物体试样以外，还可使用排泄物、排水、河水、海水、土壤、对这些进行了上述预处理的试样等检查试样。作为排泄物，例如可举出：尿、粪便等。
目标核酸可以是DNA也可以是RNA，优选为DNA。DNA也可以是从RNA通过逆转录反应合成的cDNA。目标核酸可以是基因、基因的启动子区域等基因组DNA上的特定的区域。本发明的检测方法可用于目标核酸的目标部位的变异、多态性等的检测。另外，本发明的检测方法可用于等位基因的确定。能够检测检查试样中包含何种类型的等位基因。另外，本发明的检测方法可用于甲基化的检测。在对目标核酸进行亚硫酸氢盐处理后，通过适用本发明的检测方法，可检测目标核酸中是否存在甲基化胞嘧啶。
包含变异的基因(下面称作变异型基因)具有与野生型基因的碱基序列的差异，即变异。该差异起因于选自置换、插入、缺失、倒位、重复和转座所组成的组中的一个以上的变异或它们的组合。
该差异有时通常与特定疾病的发病和/或治疗敏感性相关。在此，“发病”不仅包含疾病实际上的发病，还包含发病风险等。另外，“治疗敏感性”不仅包含由药物等进行治疗的奏效率，还包含副作用的强弱等。作为上述疾病，例如可举出：癌症、骨髓增生异常综合征、感染症等，但不限定于这些。上述疾病的优选例是癌症。
上述基因的优选例是ABL/BCR融合基因、HER2基因、EGFR基因、c-KIT基因、KRAS基因、BRAF基因、PIK3CA基因、FLT3基因、MYC基因、MYCN基因、MET基因、BCL2基因或EML4/ALK融合基因等。
工序(II)中，可根据上述的核酸扩增的方法，通过公知的方法检测扩增的核酸。例如，可通过检测从反应液产生的荧光或反应液的浊度来定性或定量地检测扩增。
另外，作为检测扩增的目标核酸的方法，可例示碱基序列分析法等。通过使用公知的序列分析装置(测序仪)来分析扩增的目标核酸的碱基序列，可检测目标核酸。
予以说明，检测检查试样中的目标核酸的方法，例如也可采用美国专利申请公开第2015/240299号说明书中所述的方法。
本发明包括检测检查试样中的目标核酸的方法，所述方法包含使包含寡核苷酸(6)和标记的探针与包含目标核酸的检查试样进行反应的工序。作为该检测方法的具体例子，可举出：原位杂交、微阵列等。
作为检测方法使用原位杂交时，可通过将用荧光色素等标记的寡核苷酸(6)与检查试样(例：细胞)中的目标核酸杂交并测定标记，来检查试样中的检测目标核酸。
作为检测方法使用微阵列时，可通过将固定化有包含寡核苷酸(6)的探针的微阵列与包含目标核酸的检查试样进行反应并检测目标核酸与探针的杂交，来检测目标核酸。
这样，使用寡核苷酸(6)，可序列高选择性地检测检查试样中的目标核酸。
<<用于检测目标核酸或选择性地扩增目标核酸的试剂盒>>
用于检测目标核酸或选择性地扩增目标核酸的试剂盒包含寡核苷酸(6)。予以说明，目标核酸例如可以是包含在检查试样中的核酸。
试剂盒中，寡核苷酸(6)如上所述可用作目标核酸的扩增和/或检测中的引物、探针和/或Clamp核酸。引物、探针和/或Clamp核酸可根据目标核酸或非目标核酸的碱基序列适当设计。
一个实施方式的试剂盒包含引物和/或探针。这些之中，引物和/或探针的至少一部分可以是寡核苷酸(6)。
图2A是试剂盒的一例的示意图，所述试剂盒包括容纳有包含引物和探针的组合物的容器。试剂盒11包括：外包装箱12、设置在外包装箱12内并在表面形成有凹部的容器支撑体、安装在凹部并容纳有包含引物和探针的组合物的容器13、试剂盒说明书14。试剂盒说明书14中可预先记载有试剂盒11的操作方法、保管条件、使用期限等。
图2B是试剂盒的一例的示意图，所述试剂盒包括容纳有包含引物的组合物的容器和容纳有包含探针的组合物的容器。试剂盒21包括：外包装箱22、设置在外包装箱22内并在表面沿长边方向留有间隔地形成有第1凹部和第2凹部的容器支撑体、安装在第1凹部并容纳有包含引物的组合物的容器23a、安装在第2凹部并容纳有包含探针的组合物的容器23b、试剂盒说明书24。
其他实施方式的试剂盒包含正向引物、反向引物和探针。这些之中，至少一部分可以是寡核苷酸(6)。包含正向引物的组合物、包含反向引物的组合物和包含探针的组合物可三种全都容纳在同一容器中(例：图2A所示那样的试剂盒)，也可任意两种容纳在同一容器中(例：图2B所示那样的试剂盒)，还可三种都容纳在各自的容器中(例：图2C所示那样的试剂盒)。
图2C是试剂盒的一例的示意图，所述试剂盒包括容纳有包含正向引物的组合物的容器、容纳有包含反向引物的组合物的容器和容纳有包含探针的组合物的容器。试剂盒31包括：外包装箱32、设置在外包装箱32内并在表面沿长边方向留有间隔地形成有第1～第3凹部的容器支撑体、安装在第1凹部并容纳有包含正向引物的组合物的容器33a、安装在第2凹部并容纳有包含反向引物的组合物的容器33b、安装在第3凹部并容纳有包含探针的组合物的容器33c、试剂盒说明书34。
此外，其他实施方式的试剂盒包含Clamp核酸和引物。这些之中，至少一部分可以是寡核苷酸(6)。该试剂盒可以是用于选择性地扩增目标核酸的试剂盒。包含Clamp核酸的组合物和包含引物的组合物可容纳在同一容器中(例：图2A所示那样的试剂盒)，也可容纳在各自的容器中(例：图2B所示那样的试剂盒)。
进一步，其他实施方式的试剂盒包含Clamp核酸、引物和探针。这些之中，至少一部分可以是寡核苷酸(6)。包含Clamp核酸的组合物、包含引物的组合物和包含探针的组合物，可三种都容纳在同一容器中(例：图2A所示那样的试剂盒)，也可任意两种容纳在同一容器中(例：图2B所示那样的试剂盒)，还可三种都容纳在各自的容器中(例：图2C所示那样的试剂盒)。
试剂盒中可包含DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)、反应缓冲液、盐、限制酶等。
本发明包含用于检测目标核酸或选择性地扩增目标核酸的寡核苷酸(6)的用途。在此使用的寡核苷酸(6)例如具有与试剂盒中含有的寡核苷酸(6)相同的特征。
<药物组合物(或制剂)>
本发明的药物组合物(或制剂)包含化合物(1)或寡核苷酸(6)。作为包含化合物(1)的药物组合物(或制剂)，例如可举出：作为核苷逆转录酶抑制剂(Nucleoside AnalogueReversetranscriptase Inhibitor：NRTI)的AZT(叠氮胸苷，azidothymidine)等低分子药物。作为包含寡核苷酸(6)的药物组合物(或制剂)，例如可举出：反义、siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)、适体(Aptamer)、诱骗(Decoy)核酸、CpG寡核苷酸等中分子或高分子的核酸药物等。
药物组合物可以是液状制剂(例：注射剂、滴眼剂、滴鼻剂、混悬剂等)、固体制剂(例：片剂、颗粒剂、散剂等)、半固体制剂(例：软膏剂、栓剂等)、其他任何对本领域技术人员公知的制剂形态。
药物组合物的优选例是非口服给予制剂(例：皮下给予剂、静脉内给予剂、经鼻腔给予剂、髓腔内给予剂、脑室内给予剂、玻璃体给予剂等)。
药物组合物的其他优选例是局部用制剂。
药物组合物通常进一步包含药学上允许的载体或添加剂。
载体包含固体载体和液体载体。作为固体载体的例子，可举出：淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸、去端肽胶原等。作为液体载体的例子，可举出：水(包含生理盐水)等。
添加剂包含稳定剂，作为其例子，可举出：尼泊金甲酯、尼泊金丙酯等对羟基苯甲酸酯类；苄基醇等醇类；苯扎氯铵；苯酚、甲酚等酚类等。
寡核苷酸(6)具有序列高选择性，Tm值高，不易被核酸酶分解。因此，包含化合物(1)或寡核苷酸(6)的药物组合物(或制剂)可在体内序列高选择性地捕捉目标(例：目标基因)而发挥作用。
实施例
下面，基于实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
<<化合物(1)的合成例>>
合成例中的记号和缩写如下。
ABZ：N6-苯甲酰基腺嘌呤
Bz：苯甲酰基
DMTr：二甲氧基三苯甲基
i-Pr：异丙基
BF3OEt2：三氟化硼-乙醚配合物
BSA：N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺
CIPS：1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷
DIBAL-H：氢化二异丁基铝
DIPEA：N,N-二异丙基乙基胺
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
DMTrCl：4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷
DBU：1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯
Et3B：三乙基硼
Et3N：三乙基胺
MeMgBr：甲基溴化镁
MeOH：甲醇
NaBH3CN：氰基硼氢化钠
PPTS：对甲苯磺酸吡啶
TBAF：四正丁基氟化铵
Tf2O：三氟甲磺酸酐
THF：四氢呋喃
TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯
TsCl：对甲苯磺酰氯
rt：室温
h：小时
min：分钟
[合成例1]
Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R3是甲基、R4是R配置的甲基、R5是氢原子且n是1的化合物(1)(以下称为“化合物(R)M-T-4”)按照下述反应方案进行合成。
[化46]
Figure BDA0004143951850000391
(化合物T-1的合成)
在氮气流下，将化合物1(20.0g，37.89mmol)溶解在DMSO(500mL)中，室温下加入2-碘酰基苯甲酸(27.89g，41.68mmol)，室温下搅拌4.5小时。水冷反应液并用饱和碳酸氢钠水终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用乙酸乙酯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，依次用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:1～2:3)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物T-1(17.48g，产率87％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.01-1.12(28H,m),1.91(3H,d,J＝1Hz),3.82,4.15(2H,ABq,J＝14Hz),4.44(1H,m),4.69(1H,d,J＝4Hz),5.86(1H,s),7.09(1H,m),7.41(1H,d,J＝1Hz),8.48(1H,s).
(化合物(R)M-T-1的合成)
将化合物T-1(3.86g，7.33mmol)溶解在甲苯(55mL)中，在干冰/丙酮冷却下加入三氟化硼-乙醚配合物(4.60mL，37.0mmol)后，经30分钟将甲基溴化镁(12％四氢呋喃溶液)滴入反应液中，在该冷却状态下搅拌2小时。用水终止反应后，用乙酸乙酯、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-1(2.50g，63％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.88(3H,d,J＝7),0.95-1.14(28H,m),1.92(3H,s),3.67,4.13(2H,ABq,J＝13),3.76(1H,m),4.15(1H,d,J＝2Hz),4.32(1H,d,J＝3),6.12(1H,s),7.74(1H,s),8.55(1H,s).
作为其他方法，化合物(R)M-T-1按照下述反应方案进行合成。
[化47]
Figure BDA0004143951850000401
(化合物(R)M-T-5的合成)
在氮气流下，将草酰氯(5.6mL，64.92mmol)溶解在二氯甲烷(240mL)中，在干冰-丙酮浴下加入二甲基亚砜(9.2mL，129.84mmol)。在同温度下搅拌30分钟后，将化合物S-1(20.0g，49.94mmol)的二氯甲烷溶液(40mL)加入反应液中。在同温度下再反应搅拌45分钟后，将三乙基胺(27.8mL，199.76mmol)加入反应液中。在同温度下再搅拌15分钟后，恢复至室温搅拌1小时。将反应液用二氯甲烷和1N盐酸稀释后，分离出有机层，用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去，由此得到中间体。接着在氮气流下，将氯化铈(12.3g，49.9mmol)溶解在四氢呋喃(240mL)中。室温下搅拌30分钟后，在冰浴下加入甲基溴化镁(四氢呋喃中1M，100mL，100.0mmol)。在同温度下再搅拌1.5小时后，在干冰-丙酮浴下加入预先得到的中间体的四氢呋喃溶液(120mL)。在同温度下搅拌3小时后，再在室温下搅拌1小时。反应液用饱和氯化铵水溶液终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层和水层。将得到的有机层依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝4:1～3:1)纯化，得到为无色透明油状物的化合物(R)M-T-5(19.0g，91％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.20(3H,d,J＝6),1.35(3H,s),1.59(3H,s),3.29(1H,d,J＝2),3.63,3.79(2H,ABq,J＝10),4.41,4.54(2H,ABq,J＝12),4.44(1H,d,J＝5),4.48,4.86(2H,ABq,J＝11),4.57-4.62(1H,m),4.67(1H,dd,J＝4,5),5.79(1H,d,J＝4),7.23-7.38(10H,m).
(化合物(R)M-T-6的合成)
在氮气流下，将化合物(R)M-T-5(9.06g，21.85mmol)溶解在吡啶(143mL)中，加入对甲苯磺酰氯(12.28g，64.43mmol)，80℃下搅拌13小时。接着使其降温至65℃后，加入对甲苯磺酰氯(3.07g，16.11mmol)，80℃下搅拌7.5小时，再使其降温至65℃后，加入对甲苯磺酰氯(3.07g，16.11mmol)，80℃下搅拌2小时。冷却反应液，用水终止反应后，用乙酸乙酯、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:1～3:1)纯化，得到为无色透明油状物的化合物(R)M-T-6(11.3g，91％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.32(3H,s),1.44(3H,d,J＝6),1.53(3H,s),2.40(3H,s),3.48,3.56(2H,ABq,J＝10),4.22(1H,d,J＝5),4.37-4.44(3H,m),4.59-4.62(2H,m),5.39(2H,q,J＝6),5.75(1H,d,J＝4),7.23-7.32(12H,m),7.72-7.75(2H,m).
(化合物(R)M-T-7的合成)
在氮气流下，将(R)M-T-6(11.20g，19.69mmol)溶解在乙酸(111mL)中，依次加入乙酸酐(18.4mL，194.76mmol)、浓硫酸(0.072g，0.73mmol)，室温下搅拌2.5小时。反应液用饱和碳酸氢钠水中和后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层依次用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸镁使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的中间体用乙腈进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在乙腈(180mL)中。依次加入胸腺嘧啶(4.09g，32.46mmol)、N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(21.4mL，86.56mmol)，80℃下搅拌10分钟。反应液降温至45℃后，加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(4.6mL，25.97mmol)，88℃下搅拌1小时。冰冷反应液，用饱和碳酸氢钠水终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水镁使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-7(11.74g，87％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.29(3H,d,J＝7),1.49(3H,d,J＝1),2.02(3H,s),2.43(3H,s),3.56,3.76(2H,ABq,J＝10),4.46-4.63(5H,m),5.10(1H,q,J＝7),5.43(1H,dd,J＝6,7),6.23(1H,d,J＝8),7.26-7.42(13H,m),7.69-7.72(2H,m),8.05(1H,s).
(化合物(R)M-T-8的合成)
在氮气氛围下，将(R)M-T-7(11.72g，17.27mmol)溶解在四氢呋喃(195mL)中，冰冷下加入40％甲胺水溶液(26mL，307.0mmol)，在该冰冷的状态下搅拌5小时。将反应液减压蒸馏除去后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的中间体在氮气流下溶解在吡啶(110mL)中，冰冷下加入甲烷磺酰氯(1.9mL，24.95mmol)，室温下搅拌2小时。将反应液用乙酸乙酯、水、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的中间体溶解在乙醇(340mL)和水(170mL)中，加入1M氢氧化钠水溶液(115mL，115.0mmol)，室温下搅拌14小时。将反应液用1N盐酸中和后，将反应液减压蒸馏除去。将得到的残余物用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:1～1:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-8(9.86g，89％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.33(3H,d,J＝7),1.62(3H,s),2.43(3H,s),3.58,3.85(2H,ABq,J＝10),4.11-4.15(1H,m),4.29(1H,d,J＝3),4.44-4.45(1H,m),4.51(2H,s),4.57,4.73(2H,ABq,J＝12),5.06(1H,q,J＝6),6.09(1H,d,J＝4),7.23-7.41(13H,m),7.72-7.74(2H,m),8.77(1H,s).
(化合物(R)M-T-9的合成)
在氮气流下，将化合物(R)M-T-8(4.00g，6.03mmol)溶解在乙醇(80mL)中，依次加入环己烯(8.9mL，87.76mmol)、20％氢氧化钯碳粉末(2.0g)，加热回流40分钟。再加入环己烯(8.9mL，87.76mmol)加热回流55分钟，加入环己烯(4.0mL，39.44mmol)加热回流25分钟。过滤反应液后，减压蒸馏除去滤液。将得到的中间体在氮气流下溶解在N,N-二甲基甲酰胺(56mL)中，冰冷下依次加入1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(2.4mL，7.54mmol)、2.9M咪唑的N,N-二甲基甲酰胺溶液(7.7mL)，室温下搅拌16小时。将反应液用甲醇终止反应后，用二乙醚、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用二乙醚反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝7:3～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-9(2.76g，产率65％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.91-1.16(28H,m),1.47(3H,d,J＝6),1.86(3H,d,J＝2),2.45(3H,s),3.81-3.84(2H,m),3.94(1H,ABq,J＝12),4.53(1H,d,J＝8),4.66-4.72(1H,m),5.09(1H,q,J＝6),6.05(1H,d,J＝7),7.30-7.34(3H,m),7.80-7.82(2H,m),9.14(1H,s).
(化合物(R)M-T-10的合成)
在氮气流下，将(R)M-T-9(0.74g，1.06mmol)溶解在二氯甲烷(7.5mL)中，冰冷下依次加入吡啶(0.41mL，5.07mmol)、4-二甲基氨基吡啶(0.39g，3.23mmol)、三氟甲磺酸酐(0.45mL，2.70mmol)，在该冰冷的状态下搅拌3.5小时。再加入4-二甲基氨基吡啶(0.13g，1.07mmol)，在该冰冷的状态下搅拌3小时。将反应液用饱和食盐水终止反应后，用二氯甲烷、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用二氯甲烷反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的中间体在氮气氛围下溶解在二甲基亚砜(9.4mL)中，加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺(0.48g，2.91mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯(0.42mL，2.80mmol)，室温下搅拌86小时。将反应液用二乙醚、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用二乙醚反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，依次用水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-10(0.33g，产率36％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.01-1.21(28H,m),1.67(3H,d,J＝7),1.85(3H,d,J＝1),2.33(3H,s),3.92,3.97(2H,ABq,J＝11),4.90(1H,dd,J＝1,8),5.18(1H,d,J＝8),5.43(1H,q,J＝7),6.09(1H,d,J＝1),7.20-7.23(2H,m),7.76-7.86(7H,m).
<化合物(R)M-T-1的合成>
在氮气流下，将(R)M-T-10(0.26g，0.30mmol)溶解在吡啶(3mL)中，加入肼单盐酸盐(0.037g，0.54mmol)、1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯(0.080mL，0.54mmol)，室温下搅拌15小时。将反应液用乙酸乙酯和水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用乙酸乙酯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的中间体用甲苯进行共沸干燥，在氮气流下溶解在N,N-二甲基甲酰胺(8.0mL)中，加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]-7-十一碳烯(0.32mL，2.14mmol)，60℃下搅拌1小时，70℃下搅拌23小时。将反应液用乙酸乙酯和水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用乙酸乙酯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:1～1:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-1(0.092g，产率55％)。
(化合物(R)M-T-2的合成)
在冰冷下，在化合物(R)M-T-1(0.53g，0.98mmol)的0.5M对甲苯磺酸吡啶的甲醇溶液(7.2mL)中加入20％甲醛水溶液(0.31mL，2.0mmol)。接着，在该冰冷的状态下加入氰基硼氢化钠(0.11g，1.80mmol)，在该冰冷的状态下搅拌1小时。将反应液用乙酸乙酯、水、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:1～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-2(0.48g，89％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.93(3H,d,J＝6),1.03-1.12(28H,m),1.90(3H,d,J＝1),2.72(3H,s),2.94(1H,q,J＝6Hz),3.62,4.10(2H,AB,J＝13),4.02(1H,d,J＝3Hz),4.28(1H,d,J＝3Hz),6.23(1H,s),7.70(1H,d,J＝1),8.35(1H,s).
(化合物(R)M-T-3的合成)
将化合物(R)M-T-2(0.60g，1.02mmol)溶解在四氢呋喃(6mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，2.3mL，2.30mmol)，室温下搅拌15分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，用硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝30:1～15:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下溶解在吡啶(4.5mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.52g，1.52mmol)，室温下搅拌15小时。加入甲醇终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-3(0.58g，90％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.77(3H,d,J＝6Hz),1.35(3H,d,J＝1),2.69(1H,d,J＝12),2.71(3H,s),2.80(1H,q,J＝6),3.22,3.41(2H,ABq,J＝10),3.80(6H,d,J＝1),4.35(1H,d,J＝3Hz),4.57(1H,dd,J＝3,10Hz),6.33(1H,s),6.83-6.87(4H,m),7.22-7.46(9H,m),7.86(1H,d,J＝1),8.39(1H,s).
(化合物(R)M-T-4的合成)
在氮气流下，将化合物(R)M-T-3(0.54g，1.57mmol)用乙腈进行共沸干燥，使其溶解在乙腈(7mL)中。在冰冷下依次加入4,5-二氰基咪唑(0.22g，1.01mmol)、2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.36mL，1.10mmol)，室温下搅拌5小时。将反应液用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)M-T-4(0.50g，70％)。
31P NMR(CDCl3)δ148.7,149.0.
HRMS(MALDI):calcd for C43H55N5O9P[M+H+]816.3732,found 816.3746.
[合成例2]
Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R3是甲基、R4是R配置的乙基、R5是氢原子且n是1的化合物(1)(以下称为“化合物(R)E-T-4”)按照下述反应方案进行合成。
[化48]
Figure BDA0004143951850000441
(化合物(R)E-T-1的合成)
在氮气流下，将化合物T-1(2.4g，4.63mmol)溶解在二氯甲烷(77mL)中，室温下加入三氟化硼-乙醚配合物(1.5mL，24.39mmol)、三乙基硼(己烷中1M，12.2mL，24.39mmol)。室温下边鼓入空气边搅拌5分钟后，加入三氟化硼-乙醚配合物(1.5mL，24.39mmol)、三乙基硼(己烷中1M，12.2mL，24.39mmol)。室温下边鼓入空气边搅拌10分钟后，加入三氟化硼-乙醚配合物(0.2mL，1.59mmol)、三乙基硼(己烷中1M，2.0mL，2.00mmol)，室温下边鼓入空气边搅拌5分钟。将反应液用饱和碳酸氢钠水终止反应后，用二氯甲烷、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用二氯甲烷反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:2～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-T-1(2.05g，产率79％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.92-1.13(28H,m),1.21-1.46,(2H,m),1.92(3H,d,J＝1Hz),3.58(1H,br),3.70,4.17(2H,ABq,J＝13Hz),4.13(1H,d,J＝4Hz),4.33(1H,d,J＝3Hz),5.51(1H,br),6.14(1H,s),7.73(1H,d,J＝1Hz),8.58(1H,s).
(化合物(R)E-T-2的合成)
在氮气流下，将化合物(R)E-T-1(0.97g，1.75mmol)溶解在0.5M对甲苯磺酸吡啶甲醇溶液(11.5mL，5.76mmol)中，冰冷下依次加入20％甲醛水溶液(0.49mL，3.24mmol)、氰基硼氢化钠(0.18mg，2.88mmol)，在该冰冷的状态下搅拌30分钟。将反应液用乙酸乙酯、水、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1～3:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-T-2(0.92g，92％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.91-1.13(28H,m),1.29-1.36,(1H,m),1,57-1.68,(1H,m),1.91(3H,d,J＝1Hz),2.74(3H,s),2.81(1H,m),3.73,4.20(2H,ABq,J＝13Hz),3.98(1H,d,J＝3Hz),4.26(1H,d,J＝3Hz),6.26(1H,s),7.72(1H,d,J＝1Hz),8.34(1H,s).
(化合物(R)E-T-3的合成)
将化合物(R)E-T-2(0.98g，0.20mmol)溶解在四氢呋喃(20mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，4.0mL，3.99mmol)，室温下搅拌20分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝40:1～20:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在吡啶(7mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.77g，2.28mmol)，室温下搅拌15小时。加入甲醇终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用乙酸乙酯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1～1:4)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-T-3(1.06g，91％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.75(3H,t,J＝8Hz),1.07-1.15,1.42-1.51(2H,m),1.30(3H,s),2.59(1H,m),2.63(1H,m),2.71(3H,s),3.26,3.54(2H,ABq,J＝11),3.79(6H,d,J＝1),4.32(1H,d,J＝3Hz),4.51(1H,dd,J＝3,9Hz),6.35(1H,s),6.84-6.87(4H,m),7.23-7.46(9H,m),7.89(1H,s),8.33(1H,s).
(化合物(R)E-T-4的合成)
在氮气流下，将化合物(R)E-T-3(1.03g，1.64mmol)用乙腈进行共沸干燥，使其溶解在乙腈(11mL)中。在冰冷下依次加入4,5-二氰基咪唑(0.22g，1.90mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.68mL，2.08mmol)，室温下搅拌4小时。将反应液用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:1～2:3)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-T-4(1.13g，82％)。
31P NMR(CDCl3)δ149.1,150.5.
HRMS(MALDI):calcd for C46H56F3N6NaO10P[M+H+]830.3888,found830.3883.
[合成例3]
Base是N-苯甲酰基-腺嘌呤-9-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R3是甲基、R4是R配置的乙基、R5是氢原子且n是1的化合物(1)(以下称为“化合物(R)E-A-3”)按照下述反应方案进行合成。
[化49]
Figure BDA0004143951850000461
(化合物(R)E-A-1的合成)
在氮气流下，将化合物(R)E-T-2(0.33g，0.57mmol)溶解在甲苯(6.7mL)中，依次加入N6-苯甲酰基腺嘌呤(0.21g，0.88mmol)、N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(0.87mL，3.50mmol)，90℃下搅拌0.5小时。接着加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(0.15mL，0.82mmol)，90℃下搅拌1小时。冰冷反应液，用饱和碳酸氢钠水终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，将反应液进行硅藻土过滤，回收滤液，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-A-1(0.27g，71％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.98-1.15(31H,m),1.33-1.44(1H,m),1.65-1.74(1H,m),2.80(3H,s),2.91(1H,m),3.81,4.20(2H,ABq,J＝13Hz),4.52(1H,d,J＝3Hz),4.64(1H,d,J＝3Hz),6.78(1H,s),7.51-7.56(2H,m),7.59-7.64(1H,m),8.01-8.04(2H,m),8.36(1H,s),8.83(1H,s),9.01(1H,s).
(化合物(R)E-A-2的合成)
将化合物(R)E-A-1(0.30g，0.44mmol)溶解在四氢呋喃(3mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，0.92mL，0.92mmol)，室温下搅拌30分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝30:1～10:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在吡啶(2mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.18g，0.53mmol)，室温下搅拌16小时。冰冷反应液，用甲醇终止反应后，用水、乙酸乙酯进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:2～0:1)纯化，得到为白色固体的化合物(R)E-A-2(0.25g，75％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.69(3H,t,J＝7Hz),1.05-1.13(1H,m),1.38-1.45(1H,m),2.69(3H,s),2.74(1H,d,J＝3Hz),3.05,3.36(2H,ABq,J＝10Hz),3.72(6H,d,J＝2Hz),4.69(1H,d,J＝3Hz),4.82(1H,dd,J＝3,6Hz),5.60(1H,d,J＝6Hz),6.66(1H,s),6.86(4H,d,J＝8Hz),7.19-7.30(7H,m),7.37-7.40(2H,m),7.52-7.57(2H,m),7.62-7.67(1H,m),8.03-8.05(2H,d,J＝7Hz),8.57(1H,s),8.80(1H,s),11.26(1H,s).
(化合物(R)E-A-3的合成)
在氮气流下，将化合物(R)E-A-2(0.20g，0.27mmol)用乙腈进行共沸干燥，加入乙腈(3mL)和四氢呋喃(2mL)使其溶解。依次加入4,5-二氰基咪唑(0.035g，0.30mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.11mL，0.32mmol)，室温下搅拌6小时。接着依次补加4,5-二氰基咪唑(0.018g，0.15mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.053mL，0.16mmol)，再搅拌16小时。用水终止反应后，用乙酸乙酯进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层依次用水和饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:2～1:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-A-3(0.15g，61％)。
31P NMR(CDCl3)δ148.9,149.1.
HRMS(MALDI):calcd for C51H59N8NaO8P[M+Na+]965.4086,found965.4096.
[合成例4]
Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R4是甲基、n是0的化合物(1)(以下称为“化合物OM-T-3”)按照下述反应方案进行合成。
[化50]
Figure BDA0004143951850000471
(化合物OM-T-1的合成)
在氮气流下，将化合物(R)M-T-1(2.88g，5.31mmol)溶解在二甲基亚砜(58mL)中，室温下加入2-碘酰基苯甲酸(3.89g，5.84mmol)，60℃下搅拌6小时，边放冷至室温边再搅拌9小时。水冷反应液，用饱和碳酸氢钠水终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物OM-T-1(2.12g，73％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.00-1.14(28H,m),1.91(3H,s),1.94(3H,s),3.89,4.22(2H,ABq,J＝13),4.45(1H,d,J＝4Hz),4.61(1H,dd,J＝4,1),5.86(1H,s),7.44(1H,s),8.40(1H,s).
(化合物OM-T-2的合成)
将化合物OM-T-1(1.36g，2.51mmol)溶解在四氢呋喃(14mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，5.4mL，5.40mmol)，室温下搅拌15分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝30:1～10:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在吡啶(25mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(1.62g，4.78mmol)，室温下搅拌15小时。加入甲醇终止反应后，用水、乙酸乙酯进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。在得到的粗产物中加入二氯甲烷，过滤析出的固体，由此得到为白色固体的化合物OM-T-2(1.01g，69％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.37(3H,d,J＝1),1.66(3H,s),3.37(2H,brs),3.75(6H,s),4.62-4.64(2H,m),5.81(1H,s),6.13(1H,d,J＝4),6.90-6.93(4H,m),7.23-7.36(7H,m),7.42-7.45(2H,m),7.55(1H,d,J＝1),11.48(1H,brs).
(化合物OM-T-3的合成)
在氮气流下，将化合物OM-T-2(0.40g，0.65mmol)用乙腈进行共沸干燥，使其溶解在乙腈(4mL)中。在冰冷下依次加入4,5-二氰基咪唑(0.087g，0.73mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.26mL，0.80mmol)，室温下搅拌5小时。冰冷反应液，用水终止反应后，用乙酸乙酯、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝2:1～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物OM-T-3(0.42g，80％)。
31P NMR(CDCl3)δ149.4,149.7.
HRMS(MALDI):calcd for C42H50N5NaO9P[M+Na+]822.3238,found822.3232.
[合成例5]
Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R3是甲基、R4是S配置的甲基、R5是氢原子且n是1的化合物(1)(以下称为“化合物(S)M-T-4”)按照下述反应方案进行合成。
[化51]
Figure BDA0004143951850000491
(化合物(S)M-T-1的合成)
在氮气流下，将化合物OM-T-1(0.20g，0.37mmol)溶解在甲苯(4mL)中，在干冰/丙酮冷却下加入1.0mol/L氢化二异丁基铝/己烷溶液(1.5mL，1.5mmol)，在该冷却状态下搅拌2小时。用饱和罗谢尔盐水溶液终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:2～1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(S)M-T-1(0.046g，23％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.97-1.15(28H,m),1.46(3H,d,J＝7),1.92(3H,d,J＝1),3.08(1H,q,J＝7),4.03(2H,s),4.18(1H,d,J＝2),4.41(1H,d,J＝2),6.06(1H,s),7.75(1H,d,J＝1),8.46(1H,s).
(化合物(S)M-T-2的合成)
在冰冷下，在化合物(S)M-T-1(0.31g，0.57mmol)的0.5M对甲苯磺酸吡啶的甲醇溶液(3.6mL)中加入20％甲醛水溶液(0.16mL，1.0mmol)。接着，在该冰冷的状态下加入氰基硼氢化钠(0.058g，0.92mmol)，在该冰冷的状态下搅拌1小时。将反应液用乙酸乙酯、水、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:1～2:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(S)M-T-2(0.29g，93％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.94-1.15(28H,m),1.32(3H,d,J＝7),1.91(3H,d,J＝1),2.68(3H,s),2.87(1H,q,J＝7Hz),3.97(1H,d,J＝3),4.00,4.08(2H,ABq,J＝13),4.34(1H,d,J＝3Hz),6.24(1H,s),7.79(1H,d,J＝1),8.40(1H,s).
(化合物(S)M-T-3的合成)
将化合物(S)M-T-2(0.31g，0.56mmol)溶解在四氢呋喃(4mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，1.2mL，1.20mmol)，室温下搅拌15分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，用硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝40:1～10:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在吡啶(5.4mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.32g，0.95mmol)，室温下搅拌15小时。加入甲醇终止反应后，用水、乙酸乙酯进行稀释，分离出有机层。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(S)M-T-3(0.30g，88％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.04(3H,d,J＝7),1.43(3H,s),2.67(3H,s),3.26(1H,q,J＝7),3.40,3.58(2H,ABq,J＝11),3.80(7H,s),4.13(1H,dd,J＝3,10),4.42(1H,d,J＝3),6.12(1H,s),6.82-6.87(4H,m),7.22-7.40(7H,m),7.46-7.49(2H,m),7.65(1H,d,J＝1),8.35(1H,s).
(化合物(S)M-T-4的合成)
在氮气流下，将化合物(S)M-T-3(0.28g，0.46mmol)用乙腈进行共沸干燥，使其溶解在乙腈(4mL)中。在冰冷下依次加入4,5-二氰基咪唑(0.064g，0.54mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.19mL，0.58mmol)，室温下搅拌5小时。将反应液用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(S)M-T-4(0.26g，70％)。
31P NMR(CDCl3)δ149.1,149.2.
HRMS(MALDI):calcd for C43H54N5NaO9P[M+Na+]838.3551,found838.3564.
[合成例6]
Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R4是乙基、n是0的化合物(1)(以下称为“化合物OE-T-3”)按照下述反应方案进行合成。
[化52]
Figure BDA0004143951850000501
(化合物OE-T-1的合成)
在氮气流下，将化合物(R)E-T-1(6.48g，11.66mmol)溶解在二甲基亚砜(102mL)中，室温下加入2-碘酰基苯甲酸(9.00g，13.50mmol)，室温下搅拌15小时。水冷反应液，用饱和硫酸氢钠水溶液终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分别分离出有机层和水层。用乙酸乙酯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，依次用饱和碳酸氢钠水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝3:1～3:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物OE-T-1(3.10g，48％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.92-1.14(28H,m),1.19(3H,t,J＝7),1.91(3H,s),2.24(2H,q,J＝7),3.94,4.27(2H,ABq,J＝13Hz),4.44(1H,d,J＝4Hz),4.59(1H,d,J＝4Hz),5.88(1H,s),7.45(1H,s),8.41(1H,s).
(化合物OE-T-2的合成)
将化合物OE-T-1(0.11g，0.20mmol)溶解在四氢呋喃(2mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，0.61mL，0.61mmol)，室温下搅拌20分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝40:1～5:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在吡啶(2mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(0.18g，0.52mmol)，室温下搅拌19小时。加入甲醇终止反应后，用乙酸乙酯、水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:2～1:3)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物OE-T-2(0.11g，90％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.01(3H,t,J＝7Hz),1.47(3H,d,J＝1),2.02-2.15(2H,m),2.65(1H,br),3.46,3.66(2H,ABq,J＝11),3.80(6H,d,J＝1),4.65(1H,d,J＝4Hz),4.78(1H,br),6.00(1H,s),6.83-6.88(4H,m),7.24-7.45(9H,m),7.61(1H,d,J＝1),8.62(1H,s).
(化合物OE-T-3的合成)
在氮气流下，将化合物OE-T-2(0.26g，0.42mmol)用乙腈进行共沸干燥，使其溶解在乙腈(3mL)中。在冰冷下依次加入4,5-二氰基咪唑(0.062g，0.52mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.20mL，0.61mmol)，室温下搅拌5小时。冰冷反应液，用水终止反应后，用乙酸乙酯进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:1～1:2)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物OE-T-3(0.30g，77％)。
31P NMR(CDCl3)δ149.1,150.5.
HRMS(MALDI):calcd for C43H52N5NaO9P[M+Na+]836.3395,found836.3398.
[合成例7]
Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、R1是DMTr、R2是-P(N(i-Pr)2)(OC2H4CN)、R3是3-(N,N-二甲基氨基)丙基、R4是R配置的乙基、R5是氢原子的化合物(1)(以下称为“化合物(R)EDM-T-2”)按照下述反应方案进行合成。
[化53]
Figure BDA0004143951850000511
(化合物(R)E-T-5的合成)
在氮气流下，将化合物(R)M-T-1(2.46g，4.42mmol)溶解在四氢呋喃(30mL)中，加入四正丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液，11.0mL，11.0mmol)，室温下搅拌30分钟。将得到的反应液进行减压蒸馏除去，通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯:甲醇＝10:1～8:1)除去反应残余物，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，在氮气流下使其溶解在吡啶(30mL)中。加入4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷(2.59g，7.64mmol)，室温下搅拌15小时。用甲醇终止反应后，用水、乙酸乙酯进行稀释，分别分离出有机层和水层。用乙酸乙酯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(己烷:乙酸乙酯＝1:4～0:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)E-T-5(2.63g，96％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.79(3H,t,J＝7),1.09-1.19(2H,m),1.27(3H,d,J＝1),3.05-3.07(1H,m),3.28,3.43(2H,ABq,J＝11),3.41-3.44(1H,m),3.79(6H,d,J＝1),4.40(1H,d,J＝3),4.68(1H,m),5.60(1H,brs),6.25(1H,s),6.84-6.87(4H,m),7.21-7.35(7H,m),7.42-7.45(2H,m),8.33(1H,d,J＝1),8.82(1H,s).
(化合物(R)EDM-T-1的合成)
在氮气流下，冰冷下在氢化钠(油中60％，0.17g，4.14mmol)的甲苯混悬液(6.8mL)中缓慢滴入3-(二甲基氨基)-1-丙醇(0.68mL，5.80mmol)，在该冰冷的状态下搅拌20分钟。接着分两次加入对甲苯磺酰氯(0.79g，4.14mmol)后，室温下搅拌2小时。用水终止反应后，用饱和食盐水、甲苯进行稀释，分别分离出有机层和水层。用甲苯反向萃取水层。合并在最初分离得到的有机层和在反向萃取中得到的有机层，用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去直至残余物有少许白浊。将得到的对甲苯磺酸3-(二甲基氨基)-1-丙酯的甲苯溶液直接用于后续反应。
在氮气流下，将(R)E-T-5(1.63g，2.65mmol)溶解在甲苯(14mL)中，室温下加入N,N-二异丙基乙基胺(1.1mL，6.35mmol)。将反应液加热至100℃后，经20分钟滴入事先制备的对甲苯磺酸3-(二甲基氨基)-1-丙酯的甲苯溶液，在该100℃的状态下再搅拌2小时。将反应液恢复至室温，减压蒸馏除去反应溶剂。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(乙酸乙酯:三乙基胺:甲醇＝20:1:0～20:1:1.5)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)EDM-T-1(0.27g，14％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.73(3H,t,J＝8),1.01-1.13,1.43-1.52(2H,m),1.28(3H,s),1.65-1.74,1.83-1.92(2H,m),2.21(6H,s),2.27-2.36,2.41-2.49(2H,m),2.73-2.80(2H,m),3.04-3.13(1H,m),3.27,3.53(2H,ABq,J＝11),3.80(6H,s),4.31(1H,d,J＝3),4.50(1H,d,J＝3),6.31(1H,s),6.83-6.87(4H,m),7.21-7.37(7H,m),7.44-7.47(2H,m),7.87(1H,s).
(化合物(R)EDM-T-2的合成)
在氮气流下，将化合物(R)EDM-T-1(0.41g，0.59mmol)用乙腈进行共沸干燥，使其溶解在乙腈(5mL)中。在冰冷下依次加入4,5-二氰基咪唑(0.078g，0.66mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.24mL，0.72mmol)，室温下搅拌6小时。接着室温下加入4,5-二氰基咪唑(0.039g，0.33mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.12mL，0.36mmol)，该状态下搅拌16小时，再在室温下加入4,5-二氰基咪唑(0.039g，0.33mmol)、2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(0.12mL，0.36mmol)，该状态下搅拌1.5小时。用水终止反应后，用乙酸乙酯、饱和食盐水进行稀释，分离出有机层。将得到的有机层依次用水、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠使其干燥并减压蒸馏除去。将得到的粗产物用硅胶柱色谱(乙酸乙酯:三乙基胺:甲醇＝20:1:0～20:1:1)纯化，得到为白色发泡状固体的化合物(R)EDM-T-2(0.30g，55％)。
31P NMR(CDCl3)δ148.9,149.1.
HRMS(MALDI):calcd for C48H65N6NaO9P[M+Na+]923.4443,found923.4420.
<<寡核苷酸的合成例>>
寡核苷酸使用在上述合成例中得到的化合物((R)M-T-4、(R)E-T-4、(S)M-T-4、OM-T-3、OE-T-3、(R)EDM-T-2)，按照标准的亚磷酰胺方案，通过核酸自动合成仪(Expedite(商标)8909/ABI株式会社制)合成，得到下述的寡核苷酸。
·具有式(6)中Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是甲基、R4是R配置的乙基且R5是氢原子的单元的寡核苷酸(以下称为(R)E-T)
·具有式(6)中Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是甲基、R4是R配置的甲基且R5是氢原子的单元的寡核苷酸(以下称为(R)M-T)
·具有式(6)中Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是0且R4是乙基的单元的寡核苷酸(以下称为OE-T)
·具有式(6)中Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是甲基、R4是S配置的甲基且R5是氢原子的单元的寡核苷酸(以下称为(S)M-T)
·具有式(6)中Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是0且R4是甲基的单元的寡核苷酸(以下称为OM-T)
·具有式(6)中Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是3-(N,N-二甲基氨基)丙基、R4是R配置的乙基且R5是氢原子的单元的寡核苷酸(以下称为(R)EDM-T)
对5’-末端被二甲氧基三苯甲基保护且被固相支持的状态的寡核苷酸，分别用28％氨水从色谱柱上切割下来(1.5小时)，使切割下来的寡核苷酸在28％氨水中60℃下反应16小时，进行全部保护基的脱保护。
用NAP-10柱进行简易纯化，用反相HPLC[WakoPak(商标)WS-DNA柱、10.0mm×250mm)进行纯化[条件：在0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH7.0)中以3ml/分钟进行30分钟的8-16％乙腈的梯度洗脱，柱温50℃]。
合成的寡核苷酸的纯度用反相HPLC[WakoPak(商标)WS-DNA柱、4.6mm×250mm)进行确认[条件：在0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH7.0)中以1ml/分钟进行30分钟的8-16％乙腈的梯度洗脱，柱温50℃，检测波长254nm]。予以说明，合成的寡核苷酸的纯度全部在90％以上。
另外，合成的寡核苷酸的分子量通过MALDI-TOF-MASS测定进行确定。分子量的计算值和实测值(测定结果)如下表所示。予以说明，式(6)所表示的单元被整合到下表中的反义链(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5)的n的位置，Base是胸腺嘧啶-1-基。n以外的碱基序列全部由DNA(式(7)Ra＝H)构成。另外，作为对照，也给出了n的位置上整合了式(9)所表示的单元中Base是胸腺嘧啶-1-基且Rb是Me或H的单元的寡核苷酸(下面，在表中分别称为NMe-T或NH-T)的分子量的计算值和实测值。
[表1]
Figure BDA0004143951850000541
<<试验例>>
[试验例1]寡核苷酸的融解温度(Tm)测定(双链形成能力评价)
通过测定将上述合成例中得到的化合物((R)E-T-4、OE-T-3、(R)M-T-4、(S)M-T-4、OM-T-3、(R)EDM-T-2)整合到SEQ ID NO:4所示的序列的n的位置而合成的本发明的6种寡核苷酸(6)((R)E-T、OE-T、(R)M-T、(S)M-T、OM-T、(R)EDM-T)(反义链)与单链DNA(5’-d(agcaaaaaacgc)-3’；SEQ ID NO:6(正义链))或单链RNA(5’-r(agcaaaaaacgc)-3’；SEQ IDNO:7(正义链))的融解温度(Tm)，考察了反义链的双链形成能力。另外，作为对照，准备了将式(7)所表示的单元中Base是胸腺嘧啶-1-基且Ra是H的单元(T)配置在SEQ ID NO:4的n的位置而合成的寡核苷酸(DNA-T)、以及将式(9)所表示的单元中Base是胸腺嘧啶1-基且Rb是Me的单元整合在SEQ ID NO:4的n的位置而合成的寡核苷酸(NMe-T)作为反义链。
制备终浓度分别为氯化钠100mM、磷酸钠缓冲液(pH7.2)10mM、反义链4μM、正义链4μM的样品溶液(120μl)，以0.5℃/分钟从15℃升温至110℃，每隔0.5℃，用分光光度计(株式会社岛津制作所制UV-1800)测定260nm处的吸光度。通过微分法从得到的测定值计算Tm值。结果如下表所示。
对于单链DNA的双链形成能力(Tm值)
[表2]
Figure BDA0004143951850000542
对于单链RNA的双链形成能力(Tm值)
[表3]
Figure BDA0004143951850000543
由此可知，本发明的寡核苷酸(6)对于单链DNA和单链RNA中的任一者，特别是对于单链RNA，具有优异的双链形成能力。因此，本发明的寡核苷酸(6)适于用在要求优异的双链形成能力的以DNA或RNA为目标的核酸药物或基因诊断上。
[试验例2]寡核苷酸的酶抗性能力测定
1)酶抗性能力测定用寡核苷酸的制备
与上述寡核苷酸的合成例同样地制备了下表的具有SEQ ID NO:8所示序列(TTTTTTTTTT)或其一部分被修饰的SEQ ID NO:5所示序列的寡核苷酸。
[表4]
Figure BDA0004143951850000551
T＝式(7)中，Base是胸腺嘧啶-1-基且Ra是H的单元
^＝硫代磷酸酯键
tα＝式(9)中，Base是胸腺嘧啶-1-基且Rb是H的单元
tβ＝式(9)中，Base是胸腺嘧啶-1-基且Rb是Me的单元
t＝式(7)中，Base是胸腺嘧啶-1-基的单元
ta ＝式(6)中，Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是甲基、R4是R配置的甲基
且R5是氢原子的单元
tb ＝式(6)中，Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是甲基、R4是R配置的乙基
且R5是氢原子的单元
tc ＝式(6)中，Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是甲基、R4是S配置的甲基
且R5是氢原子的单元
td ＝式(6)中，Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是0且R4是甲基的单元
te ＝式(6)中，Base是胸腺嘧啶-1-基、A1是单键、n是1、R3是3-(N,N-二甲基氨基)丙基、
R4是R配置的乙基且R5是氢原子的单元
2)样品溶液的制备
样品溶液如下表所示进行制备。
[表5]
试剂 终浓度
Tris HCl pH8.0 50mM
MgCl2 10mM
寡核苷酸 7.5μM
3)酶反应
使用装置(Major Science公司制、MD-MINI)，在温度37℃下对寡核苷酸编号1～7进行操作A(下述(1)～(4))。
(1)对样品溶液进行温育(5分钟)。
(2)以终浓度1.60μg/mL或5.00μg/mL添加酶CAVP(东部菱背响尾蛇毒液(Crotalusadamanteus Venom)磷酸二酯酶I)，开始反应。
(3)反应时间结束时添加EDTA使反应液的浓度为5.0mM，终止反应。
(4)反应时间为0分钟、5分钟、10分钟、40分钟、80分钟。
对寡核苷酸编号1、2、4、6和8～10，除了在操作A的(2)中以终浓度4.38μg/mL添加酶CAVP开始反应以外，与上述操作A同样地进行操作B。
4)酶抗性能力的评价
对操作A的酶反应结束后的样品溶液，以下述条件进行HPLC分析。
(条件)
装置：LC-2010A HT(株式会社岛津制作所制)
色谱柱：XBridge寡核苷酸(Oligonucleoties)BEH C18柱130，2.5μm，4.6mm×50mm
流动相
·A液：0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH7.0)
·B液：0.1M三乙基乙酸铵缓冲液(pH7.0):乙腈＝1:1(v/v)梯度：5～30％((v/v)B液)，15分钟)
流速：0.8mL/分钟
柱温：50℃
检测波长：268nm
注入量：15μL(101.2pmol)
从HPLC分析结果测定酶未消化寡核苷酸的量，通过下式计算各反应时间的未消化寡核苷酸的残留率(％)。
[数1]
Figure BDA0004143951850000561
对操作B的酶反应结束后的样品溶液，除了作为装置使用Alliance e2695(Waters公司制)以外，与上述同样地进行HPLC分析。
5)结果
酶CAVP的终浓度为5.00μg/mL、1.60μg/mL、4.38μg/mL情况下的结果分别如表6A和图1A、表6B和图1B以及表6C和图1C所示。
[表6A]
CAVP 5.00μg/mL(终浓度)各反应时间的未消化寡核苷酸的残留率(％)
Figure BDA0004143951850000562
[表6B]
CAVP 1.60μg/mL(终浓度)各反应时间的未消化寡核苷酸的残留率(％)
Figure BDA0004143951850000571
[表6C]
CAVP 4.38μg/mL(终浓度)各反应时间的未消化寡核苷酸的残留率(％)
Figure BDA0004143951850000572
由结果可知，本发明的寡核苷酸(6)与天然型和其他非天然型的寡核苷酸相比，具有优异的酶抗性。
序列表
<110> 株式会社理真思
<120> 新人工核酸、其制造方法和用途
<130> P21-127WO
<150> JP 2020-161113
<151> 2020-09-25
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n 是修饰的 t
<400> 1
gcgttntttg ct 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n 为 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n 是修饰的 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n 是修饰的 t
<400> 2
gcgntntntg ct 12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n 是修饰的 t
<400> 3
gcgttnnntg ct 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> n 是修饰的 t
<400> 4
gcgnnnnnng ct 12
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义链
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n 是修饰的 t
<400> 5
ttttttttnt 10
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义链
<400> 6
agcaaaaaac gc 12
<210> 7
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正义链
<400> 7
agcaaaaaac gc 12
<210> 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 8
tttttttttt 10

Claims (17)

1.一种下式(1)所表示的化合物或其盐：
[化1]
Figure FDA0004143951830000011
式(1)中，
Base是任选有取代基的芳香族杂环基或任选有取代基的芳香烃环基，
A1是单键或亚烷基，
R1和R2相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基或任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，或者R1和R2与相邻的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成任选有取代基的环，
R3是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的芳基、任选有取代基的酰基、具有取代基的磺酰基、具有取代基的甲硅烷基、功能性分子单元取代基、或式：R31-X-所表示的基团，其中，式R31-X-中，R31是任选有取代基的氨基，X是任选有取代基的亚烷基、或该亚烷基中的至少一个亚甲基被置换为-N(R32)-、-O-或-S(＝O)k-的基团，其中，式-N(R32)-中，R32是氢原子或烷基，式-S(＝O)k-中，k是0、1或2，
R4是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R5是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R4和R5不同时是氢原子，
下式：
[化2]
Figure FDA0004143951830000012
所表示的记号表示单键或双键，
该记号是单键时，n是1，
该记号是双键时，n是0。
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其中，A1是单键。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其盐，其中，下式：
[化3]
Figure FDA0004143951830000013
所表示的记号是单键，n是1。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物或其盐，其中，R4是烷基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的化合物或其盐，其中，R5是氢原子或烷基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的化合物或其盐，其中，R3是氢原子、烷基、烯基、环烷基、芳基、芳烷基、酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、式：-Si(R6)3所表示的基团、标记官能团、具有嵌入能力的基团、具有核酸结合能力的基团、核酸切割活性官能团、具有细胞内迁移或核内迁移能力的基团、或具有金属螯合能力的基团，其中，式-Si(R6)3中，各R6相同或不同，是烷基或芳基。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的化合物或其盐，其中，R3是式：R31-X-所表示的基团，
R31是下式(A)所表示的基团或者是下式(B)所表示的基团，
[化4]
Figure FDA0004143951830000021
式(A)中，R3a和R3b相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、或氨基的保护基，或者R3a和R3b与相邻的氮原子一同形成任选有取代基的环，
[化5]
Figure FDA0004143951830000022
式(B)中，R3c～R3f相同或不同，是氢原子、烷基、或氨基的保护基，
X是-CmH2m-，其中，式-CmH2m-中，m是1～10的整数。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的化合物或其盐，其中，R1和R2相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的芳基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、式：-Si(R6)3所表示的基团、式：-P(R7)(R8)所表示的基团、二羟基亚膦酰基、或羟基巯基亚膦酰基，其中，式-Si(R6)3中，各R6相同或不同，是烷基或芳基，式-P(R7)(R8)中，R7和R8相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基或烷基氨基，或者，
R1和R2与相邻的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成任选有取代基的环。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的化合物或其盐，其中，Base是任选有取代基的2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-1-基、任选有取代基的2-氧代-1,2-二氢嘧啶-1-基、任选有取代基的嘌呤-9-基、或任选有取代基的6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基。
10.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其是下式(1A)所表示的化合物或其盐，
[化6]
Figure FDA0004143951830000031
式(1A)中，Base和R1～R5与上述相同。
11.根据权利要求1所述的化合物或其盐，其是下式(1B)所表示的化合物或其盐，
[化7]
Figure FDA0004143951830000032
式(1B)中，Base和R1、R2及R4与上述相同。
12.一种权利要求1所述的式(1)所表示的化合物或其盐中n是0或n是1且R5是氢原子的化合物或其盐的制造方法，所述方法包括：
(I)使下式(1E)所表示的化合物与式：R4·所表示的自由基或式：R4M所表示的有机金属试剂进行反应的工序，其中，式(1E)中，Base、A1、R1和R2与权利要求1相同，式R4·中，R4与权利要求1相同，式R4M中，M是金属原子或含金属原子的原子团，R4与权利要求1相同；
[化8]
Figure FDA0004143951830000033
进一步任选包括：
(II)将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化的工序；
(III)将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化并接着进行氢化的工序、或者(IV)使在所述工序(I)中得到的化合物或将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化并接着进行氢化后的化合物与式：R3-L所表示的化合物进行反应的工序，其中，式R3-L中，L是离去基团，R3与权利要求1相同但不是氢。
13.一种制造权利要求1所述的式(1)所表示的化合物或其盐中n是1、R3是任选有1或2个取代基的甲基且R5是氢原子的化合物或其盐的方法，所述方法包括：
(I)使下式(1E)所表示的化合物与式：R4·所表示的自由基或式：R4M所表示的有机金属试剂进行反应的工序，其中，式(1E)中，Base、A1、R1和R2与权利要求1相同，式R4·中，R4与权利要求1相同，式R4M中，M是金属原子或含金属原子的原子团，R4与权利要求1相同；
[化9]
Figure FDA0004143951830000041
以及，
(II)使在所述工序(I)中得到的化合物与羰基化合物进行反应或将在所述工序(I)中得到的化合物进行脱氢化并接着进行氢化后的化合物与羰基化合物进行反应的工序。
14.一种具有下式(6)所表示的单元的寡核苷酸或其盐：
[化10]
Figure FDA0004143951830000042
式(6)中，
Base是任选有取代基的芳香族杂环基或任选有取代基的芳香烃环基，
A1是单键或亚烷基，
R3是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的芳基、任选有取代基的酰基、具有取代基的磺酰基、具有取代基的甲硅烷基、功能性分子单元取代基、或式：R31-X-所表示的基团，其中，式R31-X-中，R31是任选有取代基的氨基，X是任选有取代基的亚烷基、或该亚烷基中的至少一个亚甲基被置换为-N(R32)-、-O-或-S(＝O)k-的基团，其中，式-N(R32)-中，R32是氢原子或烷基，式-S(＝O)k-中，k是0、1或2，
R4是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R5是氢原子、任选有取代基的烷基或任选有取代基的芳基，
R4和R5不同时是氢原子，
下式：
[化11]
Figure FDA0004143951830000043
所表示的记号表示单键或双键，
该记号是单键时，n是1，
该记号是双键时，n是0。
15.一种目标核酸的检测方法，其包括：
(I)将目标核酸通过核酸扩增法选择性地扩增的工序；以及，
(II)对在所述工序(I)中扩增的目标核酸进行检测的工序，
其中，所述扩增或检测中使用的寡核苷酸包含权利要求14所述的寡核苷酸或其盐。
16.一种用于检测目标核酸或选择性地扩增目标核酸的试剂盒，其中，
(a)所述试剂盒包含引物和探针，该引物和探针中的至少一者包含权利要求14所述的寡核苷酸或其盐，或者，
(b)所述试剂盒包含Clamp核酸和引物，该Clamp核酸和引物中的至少一者包含权利要求14所述的寡核苷酸或其盐。
17.一种药物组合物，其含有权利要求1～11中任一项所述的化合物或其盐、或者权利要求14所述的寡核苷酸或其盐。
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