CN107841536A

CN107841536A - 一种检测jak2 v617f基因突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN107841536A
Application number: CN201711002034.4A
Authority: CN
Inventors: 关明; 曹国君; 许笑; 唐宜桂; 张心菊; 康志华; 邓萱; 马玮哲; 王俨; 马艳春
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2018-03-27

Abstract

本发明涉及一种检测JAK2 V617F基因突变的引物组合物，其含有SEQ ID NO：2‑SEQ ID NO：6所示序列的引物和SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针；本发明还涉及一种含有上述引物组合物的试剂盒及其检测方法。本发明所述的试剂盒及其检测方法具有良好的特异性和稳定性，梯度突变负荷浓度的样本用所建立的LAMP反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到1％，与探针法实时PCR的效果相当，且其可对JAK2 V617F基因突变进行可视化检测，与传统的检测方法相比，该方法对设备和环境要求低，检测速度更快，检测灵敏度更高，有助于将来POCT(床旁检测)的实现。

Description

一种检测JAK2 V617F基因突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测JAK2 V617F基因突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法。

背景技术

经典的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)是一组以一系或多系成熟血细胞扩增为特征的克隆性疾病，包括真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)和原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)，可造成严重贫血、急性白血病转化等，血栓是最常见的并发症，也是MPN患者的主要致死原因。

PV是一种克隆性的以红细胞异常增殖为主的慢性骨髓增生性疾病，患者表现为红细胞大量增殖，影响氧的运输，血清促红细胞生成素水平低于正常下限，骨髓活检显示增生活跃，易合并出血及血栓性并发症和脾肿大。ET患者表现为持续性的血小板升高(>450×10⁹/L)，巨核细胞增生，脾肿大，容易发生血栓或出血。PMF是以骨髓中巨核细胞和粒细胞显著增生伴反应性纤维化，巨核细胞发育异常为特征，近20％的患者最后演变为急性白血病，死因多为严重贫血、充血性心力衰竭、出血或反复感染、急性白血病转化等。此三类疾病之间可互相转化或合并存在，由于患者血细胞过度增殖而引起血液淤滞，从而可诱发各种心脑血管疾病。

PV、PMF和ET的常规诊断主要根据临床表现、实验室检查和病理形态学分析进行综合判断。由于反应性增生与MPN同样具有外周血细胞计数增加的实验室检查特征，加之MPN的临床症状不典型，对于不同类型的MPN与反应性增生之间的鉴别诊断一直是困扰临床的问题。在过去的近半个世纪，有关经典的骨髓增殖性肿瘤研究发展缓慢，几乎是一个被血液学界遗忘的角落，自2005年JAK2 V617F突变被发现以来，特别是近年随着二代测序技术在临床的推广应用，MPN特异性的基因突变谱系得以被揭示，为经典的骨髓增殖性肿瘤的诊断、预后和治疗策略制定提供了全新的分子标志物[5]。

2005年，国际上多个研究小组几乎同时发现了在MPN患者的骨髓和外周血中存在JAK2 V617F点突变，此突变是位于JAK2基因14外显子1849位碱基G>T点突变，通过将617号密码子的缬氨酸置换为苯丙氨酸影响JH2结构域的活性，并导致JAK2自主抑制功能失调，在没有细胞因子刺激的条件下使JAK2仍能被激活并促进造血细胞增殖。

JAK2V617F在MPN的突变率分别为：PV 95％，ET 50％～60％，PMF 50％～60％，但至今尚无在淋巴细胞疾病、实体肿瘤和反应性骨髓增殖性病变中出现JAK2 V617F突变的报道，因此现认为JAK2 V617F突变的发现对MPN的诊断是革命性的突破。JAK2 V617F突变发现一年之后，在该突变阴性的ET和PMF患者中发现了骨髓增生性白血病病毒致癌基因(MPL)突变，但PV患者未发现有此突变。MPL基因位于染色体1p34，编码血小板生成素受体并影响巨核细胞的增殖及分化。MPL突变是位于MPL基因10号外显子515位密码子色氨酸TGG置换为亮氨酸TTG(515L)或色氨酸TGG替换为赖氨酸AAG(515K)。约5％～10％的ET/PMF患者携带MPL突变，MPL 515突变已经成为ET和PMF分子标志物。

目前，JAK2 V617F、MPL W515K/L突变已被WHO纳入了此类疾病的主要诊断标准，这些分子标志物的发现不仅有助于MPN的诊断和鉴别诊断，还有助于判断临床转归和预后。如JAK2 V617F突变负荷越高，患者年龄越大，血红蛋白水平和白细胞计数则越高，血小板计数越低，脾大和皮肤瘙痒也越明显。随着JAK2 V617F突变负荷增高，PV和ET患者发生血栓和继发ET、PV后的骨髓纤维化的概率也显著增高。近年来，越来越多的分子标志物，如MPL、TET和CALR突变等相继被发现，这些标志物的发现对于理解MPN的分子发病机制具有重要意义，也有助于对这类疾病的患者进行诊断和治疗。

综上所述，检测JAK2 V617F基因突变对明确MPN的诊断、治疗及预后具有重要意义。目前，MPN分子标志物检测方法包括荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，限制性片段长度多态(restriction fragment length polymorphis，RFLP)分析，Sanger测序，高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting analysis，HRM)等。上述方法存在以下局限性：都是基于传统PCR的原理，需要专门的场地、设备和人员，检测成本高，周期长，无法在社区、基层的实验室或家庭中开展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，建立了一种针对JAK2 V617F基因突变进行快速检测的环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)体系。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种检测JAK2 V617F基因突变的的引物组合物，其包括SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6所示序列的引物。

进一步地，该引物组合物还包括如SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针。

进一步地，所述SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5所示序列的引物中的至少一个的5'端进行锁核酸修饰；更进一步地，所述SEQ ID NO：4所示序列的引物中的至少一个的5'端进行锁核酸修饰，本发明将突变位点设置于FIP或BIP引物的5'端，并对其进行锁核酸修饰，以增强检测其特异性。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述引物组合物的检测JAK2 V617F基因突变的试剂盒。

为了进一步优化上述试剂盒，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，上述试剂盒还包括反应工作液、Bst DNA聚合酶、去离子水、DNA模板。

进一步地，所述反应工作液的成分如下：1.5×ThermoPol缓冲液，12mM MgSO₄，dNTP 2.1mM/种。

进一步地，该试剂盒还包括显色剂。

进一步地，所述显色剂选自羟基萘酚蓝、钙黄绿素、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞和百里酚蓝中的一种；更进一步地，所述显色剂为中性红。

进一步地，该试剂盒包括反应工作液17μL，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6所示序列中的每一引物各0.5μL，SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针1μL，Bst DNA聚合酶1μL，中性红染料1μL，去离子水0.5μL，DNA模板2μL。

进一步地，所述SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：3所示序列中的每一引物的终浓度均为0.2μmol/L；SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5所示序列中的每一引物的终浓度均为1.6μmol/L；SEQ ID NO：6所示序列的引物的终浓度为0.8μmol/L；SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种用于非诊断和非治疗目的的检测JAK2 V617F基因突变的方法，其以被测样本的DNA模板，采用上述引物组合物或试剂盒进行LAMP反应，然后采用浊度法或可视化判读来鉴定样本是否为JAK2 V617F突变阳性。

进一步地，所述LAMP反应的条件为：55℃-70℃，30-60min；更进一步地，所述LAMP反应的条件为：58℃-68℃，30-60min

进一步地，所述LAMP反应所用的设备为能够稳定提供55℃-70℃恒温的设备，例如普通PCR仪或恒温金属浴等。

本发明的第四个目的是提供一种上述引物组合物扩增的JAK2 V617F基因突变的靶序列，其由SEQ ID NO：1所示序列组成。

上述引物、探针及靶序列的碱基序列如下表1所示。

表1检测JAK2 V617F基因突变的靶序列、引物及探针的碱基序列表

其中，上表中扩增引物FIP和扩增引物BIP中的至少一个的5'进行锁核酸修饰。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的试剂盒和检测方法无需专门的场地、设备和人员，检测成本更加低廉，检测灵敏度更高，且可以在30-40分钟内完成快速检测，有助于将来POCT(床旁检测)的实现。

附图说明

图1是本发明一实施例中的JAK2 V617F基因突变LAMP体系特异性的验证示意图；

图2是本发明一实施例中不同浓度梯度的JAK2 V617F基因突变样本的LAMP体系的检测结果示意图；

图中附图标记为：

B1-B4为临床JAK2 V617F突变阳性样本的检测结果，B5为临床CALR-1突变阳性样本的检测结果，B6为临床CALR-2突变阳性样本的检测结果，B7为MPL突变阳性样本的检测结果，B8为阴性对照(正常人的野生基因组DNA为模板)的检测结果。

1～7分别为浓度为10⁸copies/ml、10⁷copies/m、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml为模板、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml的JAK2 V617F突变阳性样本的检测结果图，8为阴性对照(正常人的野生基因组DNA为模板)。

具体实施方式

本发明提供了一种检测JAK2 V617F突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法，该引物组合物包括SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6所示序列的引物，其还可包括如SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为本发明一较佳实施方式中选取的JAK2 V617F突变的靶序列，以及用于检测JAK2 V617F突变的引物及探针序列。

利用在线的LAMP引物设计网站PrimerExplorer V5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)针对靶片段，设计适当的特异性引物：

(1)引物序列为：

F3：GTCAAACAACAATTCTTTGTACT(SEQ ID NO：2)；

B3：CAGTTTCAAAAATACTTAACTCCT(SEQ ID NO：3)；

FIP：AACATACTCCATAATTTAAAACCAAGTCTTTCTTTGAAGCAGC(SEQ ID NO：4)，其5'的A碱基进行了锁核酸修饰；

BIP：AACTACAGGCTTTCTAATGCCTTTCTCATTACACTGACACCTAGCT(SEQ ID NO：5)；

LF：AATGCTTGTGAGAAAGCTTGCTC(SEQ ID NO：6)。

(2)PNA探针序列为：

TGGAGTATGTGTCTGT(SEQ ID NO：7)。

(3)靶序列，具体为：

gtcaaacaacaattctttgtacttttttttttccttagTCTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAGACGAGAgtaagtaaaactacaggctttctaatgcctttctcagagcatctgtttttgtttatatagaaaattcagtttcaggatcacagctaggtgtcagtgtaaactataatttaacaggagttaagtatttttgaaactg(262BP)(SEQ ID NO：1)。

在上述引物序列中，LAMP引物的设计区域为：

tctcactttgatctccatattccaggcttacacaggggtttcctcagaacgttgatggcagttgcaggtccatataaagggaccaaagcacattgtatcctcatctatagtcatgctgaaagtaggagaaagtgcatctTtattatggcagagagaattttctgaactatttatggacaacagtcaaacaacaattctttgtacttttttttttccttagTCTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAGACGAGAgtaagtaaaactacaggctttctaatgcctttctcagagcatctgtttttgtttatatagaaaattcagtttcaggatcacagctaggtgtcagtgtaaactataatttaacaggagttaagtatttttgaaactgaaaacactgtaggactattcagttatatcttgtgaaaaaggaaagcaatgaagttaaaagtagaaggttacaatgcccaaacaatagagtattatagtaaacaaatgtctataaaacattttgtgttcatgata；

PNA封闭探针的设计区域为：

aattctttgtacttttttttttccttagTCTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATGTTTCTGTGGAGACGAGAgtaagtaaaactacaggctttctaatgcctttctcagagcatctgtttttgtttatatagaaaattcagtttcaggatcacagctaggtgtca。

实施例2

本实施例为本发明检测JAK2 V617F突变的试剂盒及其方法。

本发明所采用的试剂盒包括扩增反应体系，该扩增反应体系的总体积为25μL，其其包括反应工作液17μL，引物F3：0.5μL(终浓度0.2μmol/L)，引物B3：0.5μL(终浓度0.2μmol/L)，引物FIP：0.5μL(终浓度1.6μmol/L)，引物BIP：0.5μL(终浓度1.6μmol/L)，引物LF：0.5μL(终浓度0.8μmol/L)，PNA探针：1μL(终浓度0.8μmol/L)，Bst DNA聚合酶1μL(8U)，中性红染料1μL，去离子水0.5μL，DNA模板2μL；其中反应工作液的成分如下：1.5×ThermoPol缓冲液，12mM MgSO₄，dNTP 2.1mM/种。

采用上述试剂盒进行LAMP反应，LAMP反应条件为：58℃-68℃，60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴等能够稳定提供58℃-68℃恒温的设备；然后采用浊度法或可视化判读来鉴定样本是否为JAK2 V617F基因突变阳性，具体为结果判断：反应结束后，反应液的颜色由原来的淡黄色变为红色，即判定为反应阳性。

1)采集临床JAK2 V617F突变阳性样本，临床CALR-1突变阳性样本，临床CALR-2突变阳性样本，MPL突变阳性样本和阴性对照，采用该试剂盒分别进行PCR扩增反应并对该试剂盒的特异性进行验证。检测结果如图1所示，其结果可采用浊度法判读或可视化判读，采用浊度法判读时，反应体系中未加入任何目视法检测的显色剂，其中临床JAK2 V617F突变阳性样本检测结果均为浑浊-阳性，其与样本检测均为澄清透明-阴性；采用可视化判读时，反应体系中加入了目视法检测的染料：中性红，临床JAK2 V617F突变阳性样本检测结果均为红色-阳性，临床CALR-1突变阳性样本、临床CALR-2突变阳性样本、MPL突变阳性样本和阴性对照检测结果均为黄色-阴性，由上可知本实施例采用的试剂盒JAK2 V617F突变LAMP体系特异性高。

2)构建含靶序列的TA克隆质粒(即JAK2 V617F型突变质粒)，转入了JAK2 V617F型突变质粒的293T细胞，均为10⁶个细胞，用基因组DNA抽提试剂盒抽提DNA，然后按比例稀释，制成梯度突变负荷浓度的样本，具体浓度为10¹copies/ml，10²copies/ml，10³copies/ml，10⁴copies/ml，10⁵copies/ml，10⁶copies/ml，10⁷copies/ml，10⁸copies/ml，用所建立的JAK2V617F突变LAMP反应体系进行检测，均能检出；用所建立的LAMP反应体系进行扩增，发现突变负荷检出敏感性可达到1％，与探针法实时PCR的效果相当，其检测结果采用可视化判读，详见图2。

在本实施例中的DNA样本的采集及处理、TA克隆质粒以及293T细胞的构建均采用本领域常用的方法，例如采用天根基因组DNA抽提试剂盒提取血液中的基因组DNA，采用T-Vector pMD19进行TA克隆质粒的构建等等。

由上述实施例可知，本发明所述的JAK2 V617F基因突变的试剂盒和检测方法相对于现有技术的检测方法检测灵敏度提高，且检测方法简单，成本低廉，报告周期短，适用于一般筛查。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属华山医院

<120> 一种检测JAK2 V617F基因突变的引物组合物及其试剂盒和检测方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcaaacaac aattctttgt actttttttt ttccttagtc tttctttgaa gcagcaagta 60

tgatgagcaa gctttctcac aagcatttgg ttttaaatta tggagtatgt ttctgtggag 120

acgagagtaa gtaaaactac aggctttcta atgcctttct cagagcatct gtttttgttt 180

atatagaaaa ttcagtttca ggatcacagc taggtgtcag tgtaaactat aatttaacag 240

gagttaagta tttttgaaac tg 262

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcaaacaac aattctttgt act 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtttcaaa aatacttaac tcct 24

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacatactcc ataatttaaa accaagtctt tctttgaagc agc 43

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aactacaggc tttctaatgc ctttctcatt acactgacac ctagct 46

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatgcttgtg agaaagcttg ctc 23

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggagtatgt gtctgt 16

Claims

1.一种检测JAK2V617F基因突变的的引物组合物，其特征在于，包括SEQ ID NO：2～SEQID NO：6所示序列的引物。

2.根据权利要求1所述的一种检测JAK2V617F基因突变的的引物组合物，其特征在于，还包括如SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针。

3.根据权利要求1所述的一种检测JAK2V617F基因突变的的引物组合物，其特征在于，所述SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5所示序列的引物中的至少一个的5'端进行锁核酸修饰。

4.一种含有权利要求1～3中任一项所述的引物组合物的检测JAK2V617F基因突变的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的检测JAK2V617F基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括反应工作液、Bst DNA聚合酶、去离子水、DNA模板。

6.根据权利要求5所述的检测JAK2V617F基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括显色剂。

7.根据权利要求6所述的检测JAK2V617F基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括反应工作液17μL，SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：6所示序列中的每一引物各0.5μL，SEQ IDNO：7所示序列的PNA探针1μL，Bst DNA聚合酶1μL，中性红染料1μL，去离子水0.5μL，DNA模板2μL。

8.根据权利要求7所述的检测JAK2V617F基因突变的试剂盒，其特征在于，所述SEQ IDNO：2～SEQ ID NO：3所示序列中的每一引物的终浓度均为0.2μmol/L；

SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5所示序列中的每一引物的终浓度均为1.6μmol/L；

SEQ ID NO：6所示序列的引物的终浓度为0.8μmol/L；

SEQ ID NO：7所示序列的PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。

9.一种用于非诊断和非治疗目的的检测JAK2V617F基因突变的方法，其特征在于，以被测样本的DNA模板，采用权利要求1～3中任一项所述的引物组合物进行LAMP反应，然后采用浊度法或可视化判读来鉴定样本是否为JAK2V617F突变阳性。

10.根据权利要求9所述的检测JAK2V617F基因突变的方法，其特征在于，所述LAMP反应的条件为：55℃-70℃，30-60min。