CN107389636B - 一种可检测内源性谷胱甘肽的荧光传感器的制备及应用 - Google Patents
一种可检测内源性谷胱甘肽的荧光传感器的制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可检测内源性谷胱甘肽的荧光传感器的制备及应用，该荧光传感器是以根据现有技术制备的二氧化锰纳米片和嵌段聚合物，具有聚集诱导发光(AIE)性能的染料(p‑DTPACO)为原料制备的一种在基于癌细胞靶向检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器。该荧光传感器能靶向对癌细胞中内源性的谷胱甘肽的实现高选择性和高灵敏度检测。相比于现有的荧光检测技术，本发明得到的荧光传感器具有对谷胱甘肽高选择性快速响应，低细胞毒性，优良的水分散性，且投入成本较低，合成路线简单等优点，适于放大合成和实际生产应用，在分析化学、生命科学等技术领域有着巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于检测谷胱甘肽的荧光传感器的制备和应用，具体来说，涉及可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备及其应用，属于化学材料制备及分析检测领域。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是广泛存在于生物细胞中一种非常重要的还原性物种，也是人体的必须具有生理功能氨基酸之一，在维持细胞的氧化还原进程中起着重要的作用，且水平异常的生物GSH会与许多疾病相关联，例如癌症、肝损伤、衰老、糖尿病、艾滋病毒、艾滋病、帕金森氏病和自闭症儿童等。尤其是在癌症细胞内，GSH的水平要比正常细胞内的高出2～4倍。因此能够在癌细胞内对GSH进行成像分析和检测具有重要的意义。
目前，已经发展起来的检测谷胱甘肽的方法很多，但是主要以小分子传感器为主。然而，涉及到小分子传感器，便不能忽视其所特有的缺陷，首先是小分子传感器大多数在纯有机溶剂或者混合溶剂中工作，因为有机溶剂的生物毒性限制了它的可应用性；其次是小分子传感器在水中会因为彼此之间的π-π相互作用导致聚集，进一步限制了可应用性。这也导致这类传感器在实际检测中运用的可行性降低。除此之外，水溶性荧光传感器因其优异的水溶性、低细胞毒性、无有机溶剂残留、可设计性强、高灵敏度、高选择性等优点，受到了越来越多的关注，在化学、医学和环境科学等研究领域显示了极其广阔的应用前景。
此外，目前针对于谷胱甘肽(GSH)，基于二氧化锰纳米片的特异性氧化荧光传感器已经有很多被制备，例如基于碳量子点(Liu,J,et al.J Agric Food Chem 2016,64(1),371-380；Das,K.et al.ACS Appl Mater Interfaces 2016,8(39),25691-25701；CN104597019 A)、石墨烯量子点(Yan,X.et al.ACS Appl Mater Interfaces 2016,8(34),21990-21996.)、有机小分子(Dong,Z.et al.Nanoscale 2017,9(14),4677-4682.)、硅纳米粒子(Meng,H.M.et al.Anal Chem 2014,86(24),12321-12326；Meng,H.M.et al.AnalChem 2015,87(8),4448-4454.)、上转换纳米粒子(Yuan,J.et al.ACSAppl.Mater.Interfaces 2015,7,10548-10555)，但是仍然存在着几个问题，首先是已经报道的这些传感器都是简单的细胞成像，没有靶向癌细胞内源性GSH成像和检测；其次，无论是碳量子点，硅纳米粒子，或者是小分子，都有共同的缺陷，就是当浓度增加到一定程度后会有聚集诱导荧光猝灭效应(ACQ)；对于这些材料，在生物体内是不能够被生物体正常代谢，会对正常生物体造成潜在的威胁。
目前已经发展起来的具有聚集诱导荧光增强效应(AIE)的荧光染料可以有效的避免ACQ效应。并且，嵌段聚合物材料因为其低细胞毒性，并且可以被生物体正常的代谢，因而是一种理想的载体材料。此外，叶酸已经被证明是一种优良的具有癌细胞靶向定位的分子。因此，结合具有AIE效应的染料，嵌段聚合物和叶酸，发明一种具有癌细胞靶向，简单、低成本、优良的水溶性、生物毒性低、且高效的水溶性荧光传感器具有相当重要的现实意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于癌细胞靶向检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备及应用，该荧光传感器以根据现有技术(CN106221107A)制备的聚合物(PEO-b-P(AEMH-co-St))，根据现有技术(Kai,K.et al.J.Am.Chem.Soc.2008,130,15938-15943)制备的二氧化锰纳米片和根据现有技术(Hu,J.et al.Dyes and Pigments2017,137,480-489)制备的具有聚集诱导发光(AIE)性能的染料(p-DTPACO)为原料制备。进一步应用研究表明，该荧光传感器能够实现对水中谷胱甘肽的高灵敏度、高选择性的检测。同时也能够实现对癌细胞中内源性谷胱甘肽的检测。
本发明的目的是通过下述方式实现的：
一种可检测内源性谷胱甘肽的聚合物荧光传感器的制备，包括以下步骤：
(1)将一定的根据成熟技术制备的聚合物(PEO-b-P(AEMH-co-St))、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，室温一段时间之后，加入叶酸，反应完成之后除去大部分溶剂，用甲醇沉淀，得到产物1。
(2)利用产物1和产物2(p-DTPACO)进一步制备得到聚合物胶束，即产物3。其中，p-DTPACO的结构式为：
(3)取一定量的产物3和二氧化锰纳米片，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌30min，得到产物4。即一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器。根据上述制备方法制备的荧光传感器，其具体的反应过程参见附图7。
根据上述的制备方法制备的水溶性荧光传感器在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的应用。
本发明以二氧化锰纳米片，嵌段共聚物，具有聚集诱导发光(AIE)性能的染料(p-DTPACO)为原料来制备所需要的水溶性荧光传感器，该聚合物荧光传感器在的pH为7.4的缓冲溶液稀释之后，在有谷胱甘肽存在时，在545nm处会随着谷胱甘肽浓度的增加出现显著的荧光增强现象。并且随着谷胱甘肽浓度的增加，可见光下溶液逐渐由橙色变为无色，而在紫外光下，溶液由很弱的绿色荧光逐渐变为明亮的绿色荧光。而且该荧光传感器对谷胱甘肽的检测具有明显的高选择性，并且能达到高灵敏度检测的效果。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光传感器克服了传统小分子传感器水溶性差、细胞毒性大的缺点，也克服了一些基于二氧化锰纳米片的传感器不能靶向癌细胞成像检测的缺点，并且成本投入较少，合成路线简单、后处理方便、可直接对谷胱甘肽实现快速高效识别，尤其是在生理环境pH为7左右的生物体内环境的应用有着极其重要的意义。
总而言之，本发明提供了一种可癌细胞靶向检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备及其应用，该聚合物荧光传感器制备简单，灵敏度高，有望在生物材料科学领域得到广泛应用。
附图说明
图1为制备的荧光传感器的粒径图。
图2为制备的荧光传感器对谷胱甘肽的识别示意图。
图3为不同谷胱甘肽(GSH)浓度时，荧光传感器的荧光发射光谱变化图(激发波长：420nm)，[GSH]＝0mol/L(a)，5.0×10-5mol/L(b)，1.0×10-4mol/L(c)，1.5×10-4mol/L(d)，1.8×10-4mol/L(e)，2.0×10-4mol/L(f)，2.4×10-4mol/L(g),2.7×10-4mol/L(h)，3.0×10-4mol/L(i),3.3×10-4mol/L(j)，3.8×10-4mol/L(k)，4.0×10-4mol/L(l)，4.5×10-4mol/L(m)，5.0×10-4mol/L(n)，5.5×10-4mol/L(o)，6.0×10-4mol/L(p)。
图4为荧光传感器随GSH浓度变化的荧光强度变化值对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图。
图5为各种干扰物对该荧光传感器荧光比率强度的选择性对比数据图，加入后的离子的浓度均为5.0×10-3mol/L，GSH浓度为4.0×10-4mol/L，F和F0为在以420nm为激发波长时各离子加入后的荧光强度和空白样的荧光强度。
图6为传感器在癌细胞(Hela)靶向成像检测内源性GSH的成像应用图(A图为加入GSH清除剂，B图为没有加入GSH清除剂)。
图7为一种基于癌细胞靶向检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器的制备方法的具体的反应过程图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：一种基于癌细胞靶向的检测谷胱甘肽的荧光传感器的制备，具体步骤以下：
(1)将一定的根据成熟技术制备的聚合物(PEO-b-P(AEMH-co-St))(50mg0.005)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(20mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(15mg)溶解于2mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温一段时间之后，加入叶酸(7mg)，反应完成之后除去大部分溶剂，用甲醇沉淀，得到产物1。
(2)将产物1(2mg)溶解于1mL的N,N-二甲基甲酰胺，将产物2(p-DTPACO)(0.2mg)溶解于1mL的四氢呋喃中，通过共沉淀方法进一步制备得到聚合物胶束，即产物3。
(3)取一定量的产物3(3mL)和根据现有技术制备的二氧化锰纳米片(150μL)，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌30min，得到产物4。即一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器。
实施例2：一种基于癌细胞靶向的检测内源性谷胱甘肽的荧光传感器的制备，具体步骤以下：
(1)将一定的根据成熟技术(CN106221107A)制备的聚合物(PEO-b-P(AEMH-co-St))(50mg)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(25mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(20mg)溶解于2mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温一段时间之后，加入叶酸(10mg)，反应完成之后除去大部分溶剂，用甲醇沉淀，得到产物1。
(2)将产物1(1mg)溶解于1mL的N,N-二甲基甲酰胺，将产物2(p-DTPACO)(0.2mg)溶解于0.5mL的四氢呋喃中，通过共沉淀方法进一步制备得到聚合物胶束，即产物3。
(3)取一定量的产物3(2mL)和根据现有技术制备的二氧化锰纳米片(150μL)，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌30min，得到产物4。即一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器。
实施例3：一种可检测内源性谷胱甘肽的荧光传感器的制备，具体步骤以下：
(1)将一定的根据成熟技术(CN106221107A)制备的聚合物(PEO-b-P(AEMH-co-St))(50mg)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(18mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(26mg)溶解于2mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温一段时间之后，加入叶酸(5mg)，反应完成之后除去大部分溶剂，用甲醇沉淀，得到产物1。
(2)将产物1(1mg)溶解于1mL的N,N-二甲基甲酰胺，将产物2(p-DTPACO)(0.15mg)溶解于0.5mL的四氢呋喃中，通过共沉淀方法进一步制备得到聚合物胶束，即产物3。
(3)取一定量的产物3(5mL)和根据现有技术制备的二氧化锰纳米片(100μL)，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌30min，得到产物4。即一种可在癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性荧光传感器。
实施例4：缓冲溶液中谷胱甘肽的检测实验。
取16个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光传感器溶液300μL(该荧光传感器原溶液的浓度为1mg/mL)，依次加入2.7mL的pH为7.4的缓冲溶液溶液，搅拌1min之后分别将浓度为[GSH]＝0mol/L(a)，5.0×10-2mol/L(b)，1.0×10-1mol/L(c)，1.5×10-1mol/L(d)，1.8×10-1mol/L(e)，2.0×10-1mol/L(f)，2.4×10-1mol/L(g),2.7×10-1mol/L(h)，3.0×10-1mol/L(i)，3.3×10-1mol/L(j)，3.8×10-1mol/L(k)，4.0×10-1mol/L(l)，4.5×10-1mol/L(m)，5.0×10-1mol/L(n)，5.5×10-1mol/L(o)，6.0×10-1mol/L(p)。的3μL谷胱甘肽溶液加入16个样品瓶中，常温下搅拌10min后，以420nm为激发波长，分别测定每个样品的荧光发射光谱，得16个样品的荧光发射光谱变化图，见图3。测定结果表明：该聚合物荧光传感器在546nm处的荧光强度明显上升。根据图3中516nm处荧光强度变化值与浓度的变化关系可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图(y＝a+b×x，a＝55.6358，b＝0.4571，R2＝0.9885)，见图4。
实施例5：其它氨基酸影响的对比检测实验。
取13个5mL样品瓶，分别装入实施例1中所得的荧光传感器溶液300μL(该荧光传感器浓度为0.22mg/mL)，然后依次加入2.7mL的pH为7.4的缓冲溶液，搅拌1min之后分别将浓度为1mol/L的Ser(丝氨酸)，Asn(天冬酰胺)，Thr(苏氨酸)，Gln(谷氨酸)，Gly(甘氨酸)，Ala(L-丙氨酸)，Arg(精氨酸)，His(组氨酸)，Met(蛋氨酸)，Glucose(葡萄糖)，1mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液和浓度为8.0×10-2mol/L的谷胱甘肽溶液各取15μL加入另外前12个样品瓶中，13号样品为空白样。然后分别测定13个样品在420nm波长激发下的荧光光谱数据，得到在546nm波长发射处的荧光比率变化值(F表示加入各物种的荧光强度，F0表示空白样的荧光强度)，结果见图5。测定结果表明：除了谷胱甘肽外，其它上述各种物种对所制备的荧光传感器的荧光比率强度没有明显影响。
实施例6：癌细胞中内源性GSH检测实验
向含有癌细胞株(Hela)的培养皿中，先取一组加入GSH清除剂N-乙基马来酰亚胺去除细胞内的内源性的GSH，然后向这组培养皿中加入传感器的水溶液，与细胞培养液混合均匀后，使传感器在培养液中的终浓度达到0.022mg/mL。染色5min后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，另外取一组为空白样，这一组不加入GSH清除剂，其他操作和上一组完全一样，最后将这两组置于37℃恒温培养箱中进行孵育24小时，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。结果如图6所示。实验结果发现，染有加入GSH清除剂的一组的癌细胞中基本看不到绿色荧光，而没有加入GSH清除剂的一组可以看到很明显的荧光。实验结果表明该传感器具有较好的细胞膜透过性，能够定位于癌细胞中。并且该传感器能够用于癌细胞中内源性GSH检测。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明所作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种可应用于癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性聚合物荧光传感器，其特征在于，包含两亲性接枝共聚物，二氧化锰纳米片和具有AIE效应的p-DTPACO化合物，两亲性接枝共聚物的结构式为：
式中n/x/y/z的比例为113：1：2～5：10～40；
其中，p-DTPACO化合物的结构式为：
2.一种可应用于癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性聚合物荧光传感器，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)将一定的根据成熟技术制备的聚合物PEO-b-P(AEMH-co-St)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，室温一段时间之后，加入叶酸，反应完成之后除去大部分溶剂，用甲醇沉淀，得到产物1；
(2)利用产物1和利用产物2p-DTPACO进一步制备得到聚合物胶束，即产物3；其中，p-DTPACO化合物的结构式为：
(3)取一定量的产物3和二氧化锰纳米片，将混合溶液置于避光和N2保护的条件下室温搅拌30min，得到产物4，即一种可应用于癌细胞中检测内源性谷胱甘肽的水溶性聚合物 荧光传感器。
3.根据权利要求2所述的水溶性聚合物荧光传感器，其特征在于，步骤(1)中，聚合物和叶酸的质量比为10:2～1；保持聚合物在N,N-二甲基甲酰胺的浓度为10～20mg/mL。
4.根据权利要求2所述的水溶性聚合物荧光传感器，其特征在于，步骤(2)中，产物1和p-DTPACO的质量比为20～5：1。
5.根据权利要求4所述的水溶性聚合物荧光传感器，其特征在于，产物1和p-DTPACO的质量比为12～8：1。
6.根据权利要求2所述的水溶性聚合物荧光传感器，其特征在于，聚合物和叶酸的质量比为5:4～1。
7.根据权利要求1-6任一所述水溶性聚合物荧光传感器在Hela细胞中检测内源性谷胱甘肽中的应用。
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