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CN106458885A - 用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用 - Google Patents

用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用 Download PDF

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CN106458885A CN201480071194.2A CN201480071194A CN106458885A CN 106458885 A CN106458885 A CN 106458885A CN 201480071194 A CN201480071194 A CN 201480071194A CN 106458885 A CN106458885 A CN 106458885A
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Abstract

本公开涉及用于各种组合物、试剂盒以及方法的新颖化合物，包括(举例来说)用于聚合酶储存缓冲液和如聚合酶链式反应(PCR)的核酸合成或扩增反应中。还描述了制备该新颖化合物的方法。

Description

用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用
技术领域
本发明涉及用于各种组合物、试剂盒和方法的新颖化合物，包括(举例来说)在聚合酶储存缓冲液中或在如聚合酶链式反应(PCR)的反应中涉及核酸合成的组合物和方法。还描述了用于制备改性的化合物的方法。
背景技术
许多公知的重组DNA技术涉及复制或聚合和/或扩增DNA。一个此类实例为聚合酶链式反应(PCR)。在PCR期间，该反应在热稳定DNA聚合酶存在下，在低温和高温(例如，55℃和95℃)两个温度之间反复地循环。在高温下在反应过程中耗费的总时间段取决于循环总数、每次循环的高温步骤持续时间和变温速度(即，热循环仪从一个温度改变到另一个温度下的速率)。尽管用于PCR的DNA聚合酶是高度热稳定的，但是它们在高温下随着时间推移倾向于变得失活。此外，这些聚合酶通过被引入到具有次最佳辅因子浓度或具有次最佳pH水平或包括化学或生物抑制剂的存在的反应混合物环境中也可变得失活。
在此类条件下，稳定酶的一种方法为添加稳定剂，如表面活性剂。表面活性剂(如清洁剂)为使活性形式酶和其液体环境之间的界面稳定的表面活性化合物。举例来说，TaqDNA聚合酶的活性已通过添加如NP-40或20(Bachmann等人《核酸研究(Nuc.AcidsRes.)》18(5)：1309(1990))的非离子清洁剂稳定。然而，在一些应用中，20-稳定的DNA聚合酶具有低的扩增效率或导致非特异性产物的扩增。此外，一些清洁剂需要高浓度。而且，还已知一些清洁剂(例如，NP-40)具有毒性。因此，需要改进在溶液中热稳定DNA聚合酶的稳定性的化合物，且具体来说在不需要对目前所使用清洁剂赋予任何缺点情况下改进酶稳定性的化合物。
发明内容
本文提供了用于各种组合物、试剂盒和方法的新颖化合物。此类用途可包括(但不限于)用于储存缓冲液和核酸合成或扩增反应中。在一些实施例中，提供了通过对相关起始材料化学改性合成的离子型和两性离子型清洁剂化合物。
在一些实施例中，此类新颖化合物在具有热稳定聚合酶的组合物中。在一些实施例中，此类组合物为稳定的热稳定酶组合物。在一个实施例中，酶为从水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq聚合酶)纯化的DNA聚合酶。在一些实施例中，酶为通过重组手段产生的DNA聚合酶。在另一实施例中，酶为与抗体(多种抗体)和/或可可逆地抑制所述聚合酶的寡核苷酸结合的DNA聚合酶。
本文所提供的新颖化合物可以用于多种用途并且可以包括在各种组合物中，如(举例来说)如聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增反应。
在某些实施例中，改性的化合物具有以下结构式：
其中：
R1为H、(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一种(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基或(C1-C30)取代的杂烷基取代；
R2和/或R3各自独立地为H、CH3、CH(CH3)2、CH2(C6H5)或C(CH3)3；
R4和/或R5各自独立地为H、CH3、CH(CH3)2、C6H5、CH2(C6H5)、C(CH3)3、CH2CH(CH3)2、CHCH2CH(CH3)2、CH2C6H5OH、CH2C＝CH NH(C6H5)、CH2C＝CHN＝CHNH、CH2COOH、CH2CONH2、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、CH2SH、(CH2)nNH、(CH2)nN、CH2OH、CH(OH)CH3、(CH2)2SCH3、(CH2)3NHC(NH2)＝NH，或者可替代地R3与R5一起形成5-或6-元环，其任选地被至少一种(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基取代；
以及，
每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。
在某些实施例中，R1为C8烷基。在某些实施例中，R1为C12烷基。在其它实施例中，R1为C16烷基。在某些实施例中，R2和/或R3各自独立地选自H和CH3。在某些实施例中，R4和/或R5各自独立地选自H、(CH2)nNH、(CH2)nN，或者可替代地R3与R5一起形成5-或6-元环。
在某些实施例中，提供了具有式1的新颖化合物。在一些实施例中，新颖化合物BrijL-23-脯胺酸具有以下结构式：
并且/或者提供了其衍生物。
还提供了用于聚合和/或扩增核酸的方法，其包含将目标核酸与至少一种聚合酶、引物、dNTP以及至少一种具有式I的新颖化合物混合，并且聚合和/或扩增目标核酸。在此类方法的一些实施例中，利用了至少一种引物。在某些实施例中，提供了包含至少一种聚合酶、dNTP、至少一种引物以及至少一种具有式I的新颖化合物的核酸扩增反应混合物。在一些实施例中，反应混合物可另外包含可检测标记。在某些实施例中，该方法另外包括用于检测可检测标记以定量扩增的核酸的一个或多个步骤。在某些实施例中，提供了在热循环过程期间通过将具有式I的新颖清洁剂包括在其中抑制聚合酶失活的方法。在某些实施例中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一种具有式I的新颖清洁剂并且在使得酶的聚合酶活性稳定的条件下将其合并以形成混合物的方法。在某些实施例中，聚合酶是热稳定的。在某些实施例中，本文中所描述的方法提供具有与当在常规(例如，已知)清洁剂，如(举例来说)NP-40和/或20存在下时类似(例如，大致相同)扩增效率或提高的扩增效率的扩增反应。在一些实施例中，本文中所描述的新颖化合物可(举例来说)在储存缓冲液或扩增反应中替代NP-40和/或20(例如，如作为主混合物或预混合组合物的一部分而提供)。
在某些实施例中，本文所描述的至少一种新颖化合物在组合物或反应混合物中的有效浓度等于或小于如NP-40和/或20的常规清洁剂所需要的有效浓度。在一些此类实施例中，至少一种(一种或多种)新颖化合物在反应混合物中的有效浓度可以小于如NP-40和/或20的常规(一种或多种)清洁剂所需要的有效浓度的至多、约，或至少一、二、三、四、五、六、七、八、九或十倍。在一些实施例中，至少一种新颖化合物如BrijL-23-脯胺酸的有效浓度0.0001％至10％。举例来说，在一些实施例中，BrijL-23-脯胺酸在组合物或反应混合物中的浓度为0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％或10％。在一些优选实施例中，BrijL-23-脯胺酸在所述组合物或反应混合物中的浓度为0.01％至5％，如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％和5％。
还提供了产生新颖化合物的方法。
在某些实施例中，本文提供了包含具有式I的新颖化合物中的至少一种(如BrijL-23-脯胺酸)的组合物。在某些实施例中，提供了包含至少一种聚合酶和具有式I的新颖化合物中至少一种(如BrijL-23-脯胺酸)的组合物。在一些实施例中，聚合酶是热稳定的。还提供了包含试剂的试剂盒，所述试剂包括进行此类方法或制备此类混合物所必需的此类化合物等。
附图说明
本文中示出的所有扩增曲线图以图形方式将目标核酸扩增表示为作为循环次数(x轴)的函数的ΔRn(y轴)。
图1.在不同浓度下使用根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例扩增的1Kb和3Kb PCR产物滴定新颖化合物Dt1和Dt2。
图2.在根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例的新颖化合物Dt1和Dt2的存在下视紫质基因的扩增。
图3.在0.004％和0.0002％下新颖化合物DT2与用于根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例扩增的0.1-1Kb PCR产物的20的比较。
图4.在0.004％和0.002％下新颖化合物DT2与用于根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例扩增的1-2Kb PCR产物的20的比较。
图5.PCR活性：新颖化合物Dt2与用于根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例扩增的视紫质基因产物的单独Brij-58的比较。
图6.使用根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例扩增的Rhod-1043目标序列滴定新颖化合物Dt2和Dt4。
图7.Dt4与20的比较：根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例的β-2微球蛋白(B2M)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、大核糖体蛋白(RPLPO)以及葡糖苷酸酶β(GUSB)的扩增。
图8.Dt4与20(对数量级)的比较：根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例的B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB的扩增。
图9.Dt4与20的比较：根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例的如由Cq表示的各种PCR产物的扩增效率。
图10.Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7与20的比较；根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例执行的扩增。
图11.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例比较Dt4与Brij-58和20(每个均为0.001％和0.0008％)活性的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1)扩增反应的扩增曲线。
图12.根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例比较Dt4与Brij-58以及20(每个均为0.0006％和0.0004％)活性的HPRT1扩增反应的扩增曲线。
图13.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，比较Dt4与Brij-58和20(每个均为0.001％和0.0008％)活性的肽基脯胺酰基异构酶A(PPIA)扩增反应的扩增曲线。
图14.根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例比较Dt4与Brij-58和20(每个均为0.0006％和0.0004％)活性的PPIA扩增反应的扩增曲线。
图15.根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例比较Dt4与Brij-58和20(每个均为0.0002％和0.0001％)活性的PPIA扩增反应的扩增曲线图。
图16.根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例比较0.002％Dt4与0.01％20活性的B2M扩增反应的扩增曲线。
图17.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例扩比较0.002％Dt4与0.01％20活性的GAPDH扩增反应的扩增曲线。
图18.根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例比较0.002％Dt4与0.01％20活性的RPLPO扩增反应的扩增曲线。
图19.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，在两个月内以约一周为间隔获取的表明聚合酶在5X缓冲液中稳定性的扩增反应(Cq)(ACTB(肌动蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图形表示。
图20.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，在两个月内以约一周为间隔获取的表明聚合酶在5X缓冲液中稳定性的扩增反应(ΔRn)(ACTB(肌动蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)的图形表示。
图21.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，在两个月内以约一周为间隔获取的表明聚合酶在5X缓冲液中稳定性的扩增反应(Cq)(ACTB(肌动蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)图形表示的两个不同Dt4批次与20的(Cq，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的扩增反应)的比较。
图22.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，在两个月内以约一周为间隔获取的表明聚合酶在5X缓冲液中稳定性的扩增反应(Cq)(ACTB(肌动蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的扩增反应)图形表示的两个不同Dt4批次与20的(ΔRn，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的扩增反应)的比较。
图23.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，在多种分析中比较Dt4扩增。
图24.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，使用市售的PlatinumTaq(1)经配制包括新颖化合物BrijL-23-脯胺酸的Platinum Taq(2)，和经配制包括20的Platinum Taq(3)比较各种目标(面板1-44)的PCR扩增。每个板代表使用包含以上描述的各种酶配制物(1、2或3)的反应混合物扩增的特定目标序列(1至44)。
图25.根据本文公开方法和组合物的某些示例性实施例，Platinum Taq和经配制包括BrijL-23-脯胺酸或20的rTaq的灵敏度。使用包含50ng、5ng、500pg或50pg DNA的反应扩增基因组DNA。使用各种配制物(如所描述的那些)执行扩增反应。“Fm.Pla.Taq”为具有20的Platinum Taq(10u/μl)的配制物。“CatalogPla.Taq”为市售Platinum Taq的配制物。“Pla.Taq776”为具有BrijL-23-脯胺酸的Platinum Taq(10u/μl)的配制物。“Fm.Taq”为具有的rTaq(5u/μl)的配制物。“Catalog Taq”为市售rTaq的配制物。“Taq776”为具有BrijL-23-脯胺酸的rTaq(5u/μl)的配制物。
图26.根据本文公开的方法和组合物的某些示例性实施例，使用市售PlatinumTaq(1)、市售rTaq(A)、经配制包括新颖化合物BrijL-23-脯胺酸的Platinum Taq(2)、经配制包括新颖化合物BrijL-23-脯胺酸的rTaq(B)、经配制包括20的PlatinumTaq(3)和经配制包括20的rTaq(C)扩增的PCR产物TOPO-TA克隆的比较。
具体实施方式
本文提供了用于各种用途的新颖化合物，其包括但不限于在用于稳定酶储存和/或核酸聚合和/或扩增反应的组合物中使用。因此，在一些实施例中，提供了用于储存聚合酶和用于扩增目标核酸的组合物、方法和试剂盒。在一些实施例中，提供了利用起始化合物(例如，更简单的化合物)化学合成的离子型和两性离子型清洁剂。在一些实施例中，提供了新颖化合物，如Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、Dt10、Dt11和Dt12(以下所述)。在一些实施例中，提供了新颖化合物BrijL-23-脯胺酸。这些新颖化合物可以用于各种步骤，包括(举例来说)核酸聚合和/或扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施例中，一种或多种具有式I的新颖化合物(如BrijL-23-脯胺酸)的存在，可使聚合酶在组合物或反应混合物内稳定、降低聚合酶在反应混合物内的抑制和/或增加聚合酶在反应混合物内的聚合和/或扩增效率。由此，提供了包含至少一种聚合酶和具有式I的新颖化合物中至少一种(如BrijL-23-脯胺酸)的组合物和反应混合物。此类组合物或反应混合物可另外包含一种或多种dNTP和至少一种核酸扩增引物(例如，PCR引物)。在一些实施例中，此类组合物还可包括一种或多种组分，如三羟甲基氨基甲烷、EDTA、甘油、DTT、KCl、Mg2+、明胶(例如，鱼明胶)、Kathon或牛血清白蛋白(BSA)。
在某些实施例中，本文中提供了包含具有式I的新颖化合物中的至少一种的组合物。在某些实施例中，提供了包含至少一种聚合酶和式I的新颖化合物中至少一种的组合物。在一些实施例中，聚合酶是热稳定的。还提供了包含此类反应混合物组分和还任选地包含用于进行此类方法或用于制备此类混合物必需的其它试剂的试剂盒(单独地或作为预先混合的配制物中任一者)。
本文中描述了新颖化合物及其制备和使用方法。术语“新颖化合物”通常是指具有式I的化合物。在某些实施例中，术语“清洁剂”可以是指一种或多种新颖化合物，任选地包括一种或多种“常规清洁剂”。如本文所使用，术语“常规清洁剂”可以是指已知的化合物和/或根据式I除了本文中所描述的那些之外的任何化合物。在一些实施例中，术语“新颖化合物”可以是指仅有新颖化合物或一种或多种新颖化合物与一种或多种常规添加剂(如清洁剂)的组合。类似地，使用术语“至少一种新颖化合物”可以是指单独的一种或多种新颖化合物、与另一种新颖化合物一起和/或与一种或多种常规添加剂，如清洁剂一起。因此，在一些实施例中，本文所描述的组合物和/或反应混合物可另外包含一种或多种常规清洁剂，如举例来说但不限于非离子型清洁剂、Brij-58、CHAPS、正十二烷基-b-D-麦芽糖苷、NP-40、十二烷基硫酸钠(SDS)、X-15、X-35、X-45、X-100、X-102、X-114、X-165、X-305、X-405、X-705、20和/或其它清洁剂也可以是合适的，正如可以由本领域的技术人员所测定(参见，例如，美国专利申请公布第2008/0145910号；美国专利申请公布第2008/0064071号；美国专利第6,242,235号；美国专利第5,871,975号；以及用于示例性清洁剂的美国专利第6,127,155号；所有这些以全文引用的方式并入本文中)。附加的清洁剂也可以是合适的，如将由本领域技术人员测定。
在某些实施例中，新颖化合物具有以下结构式：
其中：
R1为H、(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一种(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基或(C1-C30)取代的杂烷基取代；
R2和/或R3各自独立地为H、CH3、CH(CH3)2、CH2(C6H5)或C(CH3)3；
R4和/或R5各自独立地为H、CH3、CH(CH3)2、C6H5、CH2(C6H5)、C(CH3)3、CH2CH(CH3)2、CHCH2CH(CH3)2、CH2C6H5OH、CH2C＝CH NH(C6H5)、CH2C＝CHN＝CHNH、CH2COOH、CH2CONH2、(CH2)2CONH2、(CH2)2COOH、CH2SH、(CH2)nNH、(CH2)nN、CH2OH、CH(OH)CH3、(CH2)2SCH3、(CH2)3NHC(NH2)＝NH，或者可替代地R3与R5一起形成5-或6-元环，其任选地被至少一种(C1-C30)烷基、(C1-C30)取代的烷基、(C1-C30)杂烷基、(C1-C30)取代的杂烷基取代；
以及，
每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。
在某些实施例中，R1为C8烷基。在某些实施例中，R1为C12烷基。在其它实施例中，R1为C16烷基。在某些实施例中，R2和/或R3各自独立地选自H和CH3。在某些实施例中，R4和/或R5各自独立地选自H、(CH2)nNH、(CH2)nN，或者可替代地R3与R5一起形成5-或6-元环。
在某些实施例中，R1为C12烷基。在某些实施例中，R2和R4为H。在某些实施例中，R3与R5一起形成5-元环，并且每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29以及30。
在某些实施例中，新颖化合物为BrijL-23-脯胺酸和/或其衍生物。在某些实施例中，新颖化合物具有以下结构式：
具有式I的化合物可以通过利用更简单的起始化合物材料制备以将新的和/或改进的化合物(例如，表面活性剂或清洁剂)及其性能提供到其中。在一些实施例中，中间体可以使用LC-MS分析来分析并且在未纯化情况下用于执行接下来的合成步骤。
在一些实施例中，提供了包含本文所描述的新颖化合物的稳定酶组合物和酶。在一些实施例中，该酶为DNA或RNA聚合酶。。在一些实施例中，该酶是热稳定的。在一些实施例中，该酶是经纯化的。在一些实施例中，该酶是天然的。在一些实施例中，该酶是重组体。在一些实施例中，DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。在一些实施例中，DNA聚合酶从水生栖热菌中分离。在一些实施例中，该酶可以是融合蛋白质，如融合聚合酶。在一些实施例中，本文中所描述的新颖化合物和酶提供在缓冲液中。在一些实施例中，缓冲液包含一种或多种组分，如核苷三磷酸(dNTP)、MgCl2+、DTT、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、甘油、KCl、明胶和Kathon。在一些优选实施例中，所述核苷三磷酸的浓度每个为μM约0.15mM至2mM(例如，0.4mM)。在一些优选实施例中，所述MgCl2+的浓度为约1mM至15mM(例如，3mM)。在一些优选实施例中，所述DTT的浓度为约0.5mM至5mM(例如，1mM)。在一些优选实施例中，所述EDTA的浓度为约0.05mM至1mM(例如，0.1mM或0.15mM)。在一些优选实施例中，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为约5mM至500mM(例如，20mM、30mM、40mM、200mM或300mM)。在一些优选实施例中，所述三羟甲基氨基甲烷的pH为约7.5至8.5。在一些优选实施例中，所述甘油的浓度为约10％至60％(例如，30％、35％、40％、45％或50％)。在一些优选实施例中，所述KCl的浓度为约50mM至1000mM(例如，100mM或500mM)。在一些优选实施例中，所述明胶的浓度为约0.02％至1％(例如，0.05％或0.5％)。在一些优选实施例中，所述Kathon的浓度为约0.015％至0.05％(例如，0.016％或0.04％)。在一些实施例中，另外提供酶抑制剂，如本文中所描述的那些。
在一些实施例中，酶(如热稳定的DNA聚合酶)储存于包含本文所描述的新颖化合物(例如，BrijL-23-脯胺酸)的组合物中。在一些实施例中，该酶稳定一段延长的时间段。举例来说，在一些实施例中，该酶储存于包含本文所描述的新颖化合物的组合物中至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、十个月、16个月、24个月、30个月或36个月。在一些实施例中，该酶在约-70℃至约环境温度(例如，25℃)的温度下储存于包含本文所描述的新颖化合物的组合物中。在一些实施例中，该酶在约4℃、-4℃或-20℃下储存于包含本文所描述的新颖化合物的组合物中。
在一些实施例中，提供了用于制备本文所描述的新颖化合物的方法。在一些实施例中，此类方法可包括将化合物A(如过程1所示)(例如，1eq.)、甲基三苯氧基磷碘化物(例如，4eq.)以及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(例如，6mL)依次合并到铝箔覆盖的圆底烧瓶(例如，50mL)。然后，将该反应在适当温度(例如，室温)下在适当气氛(例如，氩气)下搅拌足够的时间段(例如，3天)。在足够的时间段(例如，3天)之后，可以监测反应的进程(例如，使用分析液相色谱/质谱(LC-MS))。中间产物图案的出现可确认改性清洁剂的形成。可以或可不(通常)分离这一预期的中间产物(中间体B)。可以将氨基酸酯盐酸盐(例如，2eq.)和Et3N(例如，2eq.)添加到该中间产物。反应混合物可以在适当温度(例如，65℃)下加热一段适当时间(例如，3天至4天)。反应的进程可以使用分析LC-MS监测。然后，通常将反应混合物冷却到适当温度(例如，室温)并且浓缩(例如，在旋转蒸发仪上)至适当体积(例如，约2mL)。然后，浓缩的粗混合物可通过制备型HPLC纯化。然后，可以将期望的馏分汇集并浓缩(例如，在旋转蒸发仪上)以获得所期望的产物(例如，如在过程1中以产生化合物Dt1,Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)。该产物然后可以进行水解反应(例如，使用2N NaOH)。然后可以搅拌该反应混合物(例如，在室温下)直至如通过分析LC-MS测定的耗尽所有起始物质。这可以接着进行中和(例如，用Amberlite)以产生最终的阳离子产物(例如，Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)、两性离子产物(例如Dt2、Dt4、Dt6、Dt10)或阴离子产物(Dt8)。
因此，以下示出用于研发具有式I的新颖化合物的示例性方法：
其中R1、R2、R3、R4、R5和n为如上文所描述，并且X选自由以下各者组成的群组：H、CH3、CH2CH3、CH2(C6H5)和C(CH3)3。具有式I的新颖化合物可以是(举例来说)离子型的(例如，阳离子型、阴离子型、两性离子型)。以下示出使用过程1制备的示例性新颖化合物：
其中n为如上文所描述的。在某些实施例中，每个n独立为5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。
以下示出使用过程2研发新颖化合物的示例性方法。
以上示出使用过程2制备的具有式I的示例性新颖化合物(BrijL-23-脯胺酸)，作为最终产物(参见框中化合物)。
关于过程2的反应物和中间体以及由此制备的新颖化合物的附加信息在表1中示出：
表1
在某些实施例中，提供了用于聚合和/或扩增核酸的方法，其包含将目标核酸与至少一种聚合酶、引物、dNTP以及至少一种具有式I的新颖化合物混合，并且聚合和/或扩增目标核酸。在某些实施例中，该方法可包括至少一种引物。在某些实施例中，提供了核酸扩增反应混合物，所述混合物包含至少一种聚合酶、dNTP、至少一种引物和至少一种具有式I的新颖化合物(如BrijL-23-脯胺酸)。在某些实施例中，组合物和/或反应混合物可另外包含可检测标记。在某些实施例中，该方法包括用于检测和/或定量可检测标记以检测和/或定量扩增的核酸的一个或多个步骤。
在某些实施例中，提供了在储存和/或热循环过程期间通过将具有式I的新颖化合物包括其中抑制聚合酶失活的方法。在某些实施例中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一种具有式I的新颖化合物，并且在使得该酶的聚合酶活性稳定的条件下将其合并以形成混合物的方法。在某些实施例中，聚合酶是热稳定的。在某些实施例中，本文中所描述的方法提供具有与在如(举例来说)NP-40和/或20的常规(例如，已知)清洁剂存在下时，类似的酶稳定性(例如，大致相同)或提高的酶稳定性的组合物。在某些实施例中，当本文中所描述的方法提供具有与在如(举例来说)NP-40和/或20的常规(例如，已知)清洁剂存在下时，类似扩增效率(例如，大致相同)或提高扩增效率的扩增反应。在一些实施例中，本文中所描述的新颖化合物可在储存缓冲液、主混合物和/或扩增反应中替代NP-40和/或20。
在某些实施例中，至少一种具有式I的新颖化合物(例如，Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、Dt10、Dt11、Dt12和/或BrijL-23-脯胺酸)在反应混合物中的“有效浓度”(例如，将支撑如PCR的扩增反应的量)可以比常规清洁剂(例如，NP-40和/或20)所需要的浓度更高、相同或更低。在一些此类实施例中，至少一种新颖化合物(例如，Dt4和/或BrijL-23-脯胺酸)在反应混合物中的有效浓度可以小于常规清洁剂(如NP-40和/或20)所需要的浓度的至多约或至少一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍。举例来说，NP-40或20通常包括在约0.01％或更小(例如，如通过从储备溶液稀释成反应混合物测定的)的反应中。在某些实施例中，本文所描述的新颖化合物可以在比常规清洁剂更低的浓度(例如，以百分比(即，w/v或v/v))下使用(例如，与0.01％20相比用于Dt4的0.002％；图11至18)。
在某些实施例中，提供了聚合和/或扩增核酸的方法，其包含将所关注的核酸(例如，目标核酸)与至少一种聚合酶、引物、dNTP和至少一种式I的新颖化合物混合，并且聚合和/或扩增该目标核酸。在某些实施例中，该方法包括至少一种引物。在某些实施例中，提供了包含至少一种聚合酶、dNTP、至少一种引物以及至少一种具有式I的改性化合物的(一种或多种)核酸扩增反应混合物。在其它实施例中，提供了用于使用此类(一种或多种)混合物的方法。可以使用各种反应和体系中的任一项扩增目标核酸。
如本文中所用，术语“扩增”(amplification)、“核酸扩增”或“扩增(amplifying)”是指产生多个核酸模板的拷贝或产生多个与核酸模板互补的核酸序列拷贝。术语(包括术语“聚合”)还可以指延伸核酸模板(例如，通过聚合)。扩增反应可以是聚合酶介导的延伸反应，例如聚合酶链式反应(PCR)。然而，任何已知扩增反应都可以适用于如本文所描述进行使用。通常是指目标核酸“指数”增加的术语“扩增”在本文中可以用于描述核酸的所选目标序列数量的线性和指数增加两者。
术语“扩增反应混合物”和/或“主混合物”可以是指包含用于扩增目标核酸的各种(一些或所有)试剂的水溶液。此类反应还可以使用固体支撑物(例如阵列)来进行。该反应还可以根据用户所期望的以单一或多重形式执行。这些反应通常包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、目标核酸以及核苷三磷酸。根据情况，该混合物可以是完全或不完全扩增反应混合物。用于扩增目标核酸的方法可以是本领域的技术人员可获得的任何方法。可以利用使目标核酸序列的拷贝倍增的任何体外手段。这些手段包括线性、对数和/或任何其它扩增方法。尽管本发明一般论述包括定量PCR(qPCR)和终点PCR(epPCR)的PCR作为核酸扩增反应，但是预期本文中描述的改性的清洁剂应在其它类型的核酸扩增反应中有效，包括聚合酶介导的扩增反应(如解旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)和滚链扩增(RCA))以及连接酶介导的扩增反应(如连接酶检测反应(LDR)、连接酶链式反应(LCR)和每个的间隙型式)两者以及如LDR和PCR的核酸扩增反应的组合(参见(举例来说)美国专利6,797,470)。举例来说，改性的化合物可以用于(举例来说)各种连接介导的反应，其中举例来说与PCR引物相反，采用连接探针。附加的示例性方法包括聚合酶链式反应(PCR；参见，例如美国专利第4,683,202号；第4,683,195号；第4,965,188号；和/或第5,035,996号)、等温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参见，例如PCT公布第WO 2006/081222号)、链置换(参见，例如美国专利第RE39007E号)、引物分子的部分破坏(参见，例如PCT公布第WO2006/087574号))、连接酶链式反应(LCR)(参见，例如Wu等人，《基因组学(Genomics)》4:560-569(1990))，和/或Barany等人《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88:189-193(1991))、QβRNA复制酶系统(参见例如PCT公布第WO 1994/016108号)、基于RNA转录的系统(例如，TAS、3SR)、滚环扩增(RCA)(参见，例如美国专利第5,854,033号；美国专利申请公布第2004/265897号；Lizardi等人《自然·遗传学(Nat.Genet.)》19:225-232(1998)；和/或Banér等人《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》,26:5073-5078(1998))以及链置换扩增(SDA)(Little等人《临床化学(Clin.Chem.)》45:777-784(1999))。这些系统与本领域技术人员可获得的许多其它系统一起可以适用于聚合和/或扩增如本文中所述使用的目标核酸。
“扩增效率”可以是指可以经定量以测定拷贝数的任何产物(例如，所述术语可以是指PCR扩增子、LCR连接产物和/或类似产物)。不论在具体扩增反应中充当期望的具体化合物是否可以通过进行至少两个独立的扩增反应测定，每个反应分别在不存在和存在每个反应中均发生的定量扩增的化合物下进行。化合物的各种浓度或组合还可以在独立的反应混合物中测试以测定对扩增效率的影响。扩增和/或聚合效率可以通过本领域中已知的各种方法来测定，其包括(但不限于)测定校准稀释曲线和斜率计算，使用如Hellemans等人,《基因组生物学(Genome Biology)》8:R19(2007)中所述的qBase软件测定，使用如Livak和Schmittgen，《方法(Methods)》25:402(2001)所述的ΔΔCq(ΔΔCq)计算测定，或通过如Pfaffl，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》29:e45(2001)所述的方法，所有这些都以其全文引用的方式并入本文中。
用于聚合和/或扩增核酸的示例性方法包括(举例来说)聚合酶介导的延伸反应。举例来说，聚合酶介导的延伸反应可以是聚合酶链式反应(PCR)。在其它实施例中，核酸扩增反应为多重反应。举例来说，适用于如本文所述用于聚合和/或扩增并且检测核酸的示例性方法可以商购(参见，例如美国专利第4,889,818号；第5,079,352号；第5,210,015号；第5,436,134号；第5,487,972号；第5,658,751号；第5,210,015号；第5,487,972号；第5,538,848号；第5,618,711号；第5,677,152号；第5,723,591号；第5,773,258号；第5,789,224号；第5,801,155号；第5,804,375号；第5,876,930号；第5,994,056号；第6,030,787号；第6,084,102号；第6,127,155号；第6,171,785号；第6,214,979号；第6,258,569号；第6,814,934号；第6,821,727号；第7,141,377号；和/或第7,445,900号，所有这些都在此以其全文引用的方式并入本文中)。分析通常通过使用具有5'到3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能够杂交到目标多核苷酸的引物和能够相对于所述引物杂交到所述目标多核苷酸3'的寡核苷酸探针，对所述目标多核苷酸执行核酸扩增来进行。寡核苷酸探针通常包括可检测标记(例如，荧光报告体分子)和能够淬灭所述报告体分子的荧光的淬灭剂分子。通常，可检测标记和淬灭剂分子是单探针的一部分。随着扩增进行，聚合酶消化探针以将可检测标记与淬灭剂分子分离。在反应期间监测可检测标记(例如荧光)，其中标记的检测对应于核酸扩增的发生(例如信号越高，扩增量越大)。分析的变体(例如LNATM外加分析)在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。
适用于如本文所述使用的另一个示例性系统在置换杂交法中利用双链探针(参见，例如Morrison等人《分析生物化学(Anal.Biochem.)》，18:231-244(1989)；和/或Li等人《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，30(2，e5)(2002))。在此类方法中，探针通常包括两个不同长度的互补寡核苷酸，其中一个包括可检测标记并且另一个包括猝灭剂分子。当未结合到目标核酸时，猝灭剂遏制可检测标记的信号。在与目标核酸置换杂交之后，探针变成可检测的。可以使用多个探针，每个含有不同的可检测标记，以使得可以在单一反应中查询多个目标核酸。
适用于如本文所述用于聚合和/或扩增并且检测目标核酸的附加例示性方法涉及“分子信标”，其是单链发夹状寡核苷酸探针。在目标序列存在下，探针去折叠、结合并且发射信号(例如发荧光)。分子信标通常包括至少四个组分：1)“环”，与目标序列互补的18-30核苷酸区域；2)两个5-7核苷酸“茎”，在环的任一端上所见并且彼此互补；3)在5'端处，可检测标记；以及4)在3'端处，猝灭剂部分，其当探针在闭环形状(例如，不结合到目标核酸)中时阻止可检测标记发射信号。因此，在互补目标存在下，信标的“茎”部分分离出来，导致探针杂交到目标。还已知其它类型的分子信标并且它们可以适用于本文所述的方法中。分子信标可以用于各种分析系统中。一个此类系统是基于核酸序列的扩增用于在无温度循环的情况下将RNA聚合和/或扩增到双链DNA的单步骤等温法。NASBA反应通常需要禽成髓细胞瘤病毒(AMV)、逆转录酶(RT)、T7RNA聚合酶、RNA酶H以及两个寡核苷酸引物。在扩增之后，可以使用分子信标检测经扩增的目标核酸。分子信标的其它用途在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。
ScorpionsTM系统为可以用于本文所描述的方法中的另一种示例性分析形式。ScorpionsTM引物为双功能性分子，其中引物与可检测标记(例如，萤光团)和猝灭可检测标记荧光的不可检测猝灭剂部分一起共价键联到探针。在存在目标核酸的情况下，可检测标记和猝灭剂分离，这导致从可检测标记发射的信号增加。通常，在扩增反应中所用的引物包括在5'端的探针元件以及在发夹环开始时的“PCR阻断剂”元件(例如，六乙二醇(HEG)单体(Whitcombe等人《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》17：804-807(1999))。探针通常包括具有在一个末端的可检测标记并且在另一个末端的淬灭剂的自身互补茎序列。在初始扩增循环(例如，PCR)中，引物杂交到目标并且由于聚合酶的作用而发生延伸。ScorpionsTM系统可以使用多个可不同标记以在探针之间加以区分的探针，用于检查并且鉴别点突变。使用PCR作为实例，在完成一个延长循环之后，新合成的目标区将连接到与探针相同的链。在第二个变性和退火循环之后，探针和目标杂交。然后发夹序列杂交到新产生的PCR产物的一部分。这导致可检测标记与猝灭剂分离并引起信号发射。所述经标记探针的其它用途在本领域中是已知的并且将适用于本文中所述的方法中。
本文所提供新颖化合物还可以用于在某一组条件(例如，某一温度或pH)下抑制或基本上抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的组合物和/或反应混合物。聚合酶活性的抑制可以用于如在“热启动”技术中减少不期望的次级扩增产物的形成。在一些热启动技术中，DNA聚合酶活性重要的组分(例如，二价离子和/或DNA聚合酶自身)可以不添加至反应混合物中，直至混合物的温度足够高以防止非特异性引物退火。示例性热启动技术可包括(举例来说)基于寡核苷酸的系统、基于抗体的系统、基于化学的系统和/或这些系统中任一项的组合(例如，双重三重、四重等热启动系统)。举例来说，镁或DNA聚合酶可以封存在蜡珠中，其随着反应温度增加熔化，仅在高温下释放所封存的组分。根据其它技术，举例来说通过DNA聚合酶的可逆化学改性、将抗体或多个抗体结合至DNA聚合酶或结合到DNA聚合酶的寡核苷酸分子，使DNA聚合酶可逆地失活或改性。在一些实施例中，逆转所述化学改性或者在较高反应温度下变性(一个或多个)抗体分子或寡核苷酸分子，从而释放功能性DNA聚合酶。双重热启动反应系统通常包含至少两个不同的热启动装置，其在某一组条件(例如，在某一温度或pH)下抑制或基本上抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。此类温度依赖性热启动装置可包括(但不限于)：在较低温下阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度下阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在高温下离解的DNA聚合酶的可逆化学改性、在较低温度下提供降低活性的DNA聚合酶的胺基酸改性、包括超稳定DNA结合域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度下隔离引物的单链结合蛋白、可逆改性的引物和/或在具体温度下改变构形的改性的dNTP。如这些的方法详细地描述在各种参考文献中，其包括(举例来说)Chou等人，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20：1717-1723(1992)；Dang等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》264：268(1996)；D'Aquila等人，《核酸研究(Nucl.AcidsRes.)》19：3749(1991)；美国专利第5,338,671号；美国专利第5,587,287号；美国专利第5,677,152号；美国专利第5,773,258号；美国专利8,470,531；和/或美国专利公布2010-0317062Al；所有这些在此以全文的方式并入本文中。如将由本领域普通技术人员所理解，其它热启动技术在本领域中也是已知的并且可以适合与本文中所描述的新颖化合物一起使用，。
可以用于所公开的核酸扩增反应中的核酸聚合酶可以是起作用进行所期望反应的任何核酸聚合酶，举例来说例如原核生物的、真菌的、病毒的、噬菌体、植物和/或真核生物的核酸聚合酶。如本文所用，术语“DNA聚合酶”是指使用核酸链作为模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶使用现存DNA或RNA作为DNA合成的模板并且沿着其所读取的模板链催化脱氧核糖核苷酸的聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶可将游离核苷酸仅添加到新形成链的3'-羟基端。其经由将核苷单磷酸从脱氧核苷三磷酸(dNTP)转移至生长寡核苷酸链的3'-羟基合成寡核苷酸。这导致新链沿着5'到3'的方向伸长。因为DNA聚合酶可仅添加核苷酸到预先存在的3'-OH基团上，所以为了开始DNA合成反应，DNA聚合酶需要可以向其可添加第一核苷酸的引物。合适的引物可包含RNA或DNA的寡核苷酸或其嵌合体(例如，RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上文提及的活性的天然酶的变异体。举例来说，其可以包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5'到3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶或具有核酸内切酶活性的DNA聚合酶。
合适的核酸聚合酶还可包含全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可实现核酸分子的合成的任何经改性聚合酶。在本发明内，DNA聚合酶还可包括聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。聚合酶的非限制性实例可包括(举例来说)T7DNA聚合酶、真核粒线体DNA聚合酶γ、原核DNA聚合酶I、II、III、IV和/或V；真核聚合酶α、β、δ、ε、η、ζ、ι和/或κ；大肠杆菌DNA聚合酶I；大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亚基；大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V；栖热水生菌DNA聚合酶I；嗜热脂肪芽孢杆菌；DNA聚合酶I；广古菌聚合酶；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)；酿酒酵母聚合酶4；跨损伤合成聚合酶；逆转录酶；和/或端粒酶。可以使用的合适的热稳定DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq、Tfl、Tfi、Pfu和VentTM DNA聚合酶、任何经基因工程化的DNA聚合酶、具有降低的或不显著的3'到5'核酸外切酶活性的任何DNA聚合酶(例如，SuperScriptTM DNA聚合酶)和/或经基因工程化的DNA聚合酶(例如，具有活性位点突变F667Y或F667Y的等效物(例如，在Tth中)的那些、FS、ThermoSequenaseTM)、金、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ(全部可购自马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Beverly,MA))和/或其任何衍生物和片段。如本领域的技术人员将了解，其它核酸聚合酶也可以是合适的。
在另一方面，本公开提供用于聚合和/或扩增所关注核酸序列(例如，目标序列)的反应混合物。在一些实施例中，反应混合物可另外包含可检测标记。所述方法还可以包括一个或多个用于检测可检测标记以定量经扩增核酸的步骤。如本文中所用，术语“可检测标记”是指指示扩增的各种信号传导分子中的任一个。举例来说，绿和其它DNA结合染料是可检测标记。此类可检测标记可包含或可以是(举例来说)核酸插入剂或非插入剂。如本文中所用，插入剂是能够非共价插入到双链核酸分子的堆叠碱基对之间的试剂或部分。非插入剂是不插入到双链核酸分子中的试剂。核酸结合剂可直接地或间接地产生可检测信号。所述信号可以使用(举例来说)荧光和/或吸光度直接地可检测，或使用(举例来说)可检测地受与双链核酸的接近性影响的任何合适的部分或配体间接地可检测，例如连接到核酸结合剂的被取代的标记部分或结合配体。核酸结合剂在结合到双链核酸时通常必需产生可与当相同试剂在溶液中或结合到单链核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。举例来说，如溴化乙锭的插入剂在插入到双链DNA中时发出的荧光比在结合到单链DNA、RNA或在溶液中时强烈(参见，例如美国专利第5,994,056号；第6,171,785号；和/或第6,814,934号)。类似地，放线菌素D在结合到单链核酸时在紫外/可见光谱的红色部分中发荧光，并且当结合到双链核酸时在紫外/可见光谱的绿色部分中发荧光。并且在另一实例中，已经报导了光反应性的补骨脂素4-氨甲基-4-5',8-三甲基补骨脂素(AMT)在插入到双链DNA中之后展现在长波长下的吸收和荧光减少(Johnson等人《光化学和光生物学(Photochem.&Photobiol.)》，33：785-791(1981))。举例来说，美国专利第4,257,774号描述了荧光插入剂(例如，乙锭盐、道诺霉素(daunomycin)、麦帕克林(mepacrine)和吖啶橙、4',6-二脒基-α-苯基吲哚)与DNA的直接结合。非插入剂(例如，如本文中所述的小沟结合物，例如Hoechst33258、偏端霉素(distamycin)、纺锤菌素(netropsin))也可以是适用的。举例来说，Hoechst 33258(Searle等人《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》18(13)：3753-3762(1990))在增加目标量的情况下展现出有所改变的荧光。小沟结合剂在本文中其它地方更详细地加以描述。
其它DNA结合染料对于本领域的技术人员来说是可获得的并且可以单独或与分析系统的其它试剂和/或组分组合使用。示例性DNA结合染料尤其可包括(举例来说)吖啶(例如，吖啶橙、吖啶黄)、放线菌素D(Jain等人《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》68：21(1972))、氨茴霉素、BOBOTM-1、BOBOTM-3、BO-PROTM-1、色霉素、DAPI(Kapuseinski等人《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》(112)：3519(1979))、道诺霉素、偏端霉素(例如，偏端霉素D)、在美国专利第7,387,887号中所述的染料、玫瑰树碱、乙锭盐(例如，溴化乙锭)、氟库满宁、如美国专利第4,257,774号中所述的荧光插入剂、(缅因州罗克兰的康伯司生物科学罗克兰公司(Cambrex Bio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.))、赫斯特33258(Embrey和Embrey，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》18：3753-3762(1990))、赫斯特33342、乙菲啶、JO-PROTM-1、LIZ染料、LO-PROTM-1、麦帕克林、光神霉素、NED染料、纺锤菌素、4',6-二脒基-α-苯基吲哚、普罗黄素、POPOTM-1、POPOTM-3、PO-PROTM-1、碘化丙啶、多吡啶钌、S5、金、绿I(美国专利第5,436,134号和第5,658,751号)、绿II、蓝、绿、43、44、45、蓝、 11、13、15、16、20、23、噻唑橙(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇化学公司(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.))、TOTOTM-3、和(俄勒冈州尤金分子探针公司有限公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR))。举例来说，绿I(参见，例如美国专利第5,436,134号；第5,658,751号；和/或第6,569,927号)已经用于监测PCR反应。如本领域的技术人员将了解，其它DNA结合染料也可以是合适的。
对于如本文中所述的用途，一种或多种可检测标记和/或淬灭剂可以附接到一个或多个引物和/或探针(例如，可检测标记)。可检测标记在游离时或在结合到目标核酸中的一个时可发射信号。可检测标记还可以在接近另一种可检测标记时发射信号。可检测标记还可以与猝灭剂分子一起使用以使得信号仅仅在与猝灭剂分子不足够接近时才可检测。举例来说，在一些实施例中，分析系统可引起可检测标记从淬灭分子中释放。可以使用若干可检测标记中的任一个来标记在本文中所述方法中所使用的引物和探针。如上文所提到，在一些实施例中，可检测标记可以附接到可以并入到引物中的探针，或者可以其它方式结合到扩增的目标核酸(例如，可检测核酸结合剂，如插入或非插入染料)。当使用一个以上可检测标记时，每一个的光谱特性应该不同以使得所述标记可以彼此区分，或以使得可检测标记一起发射任一可检测标记单独不发射的信号。示例性可检测标记包括例如荧光染料或荧光团(例如，可以通过光激发以发射荧光或磷光的化学基团)、能够猝灭来自荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”等。尤其如将由本领域的普通技术人员已知的，合适的可检测标记可包括(举例来说)荧光素(例如，5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羟基色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基荧光素(6-FAM)；FITC；6-羧基-1,4-二氯-2',7'-二氯荧光素(TET)；6-羧基-1,4-二氯-2',4',5',7'-四氯荧光素(HEX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)；Alex荧光团(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568 594、610、633、635、647、660、680、700、750)；荧光团(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X共轭物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)，香豆素(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素毒伞素、羟基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)，钙黄绿素，钙黄绿素AM，钙黄绿素蓝，钙染料(例如，钙深红色、钙绿色、钙橙色、卡尔科弗卢尔(calcofluor)白色)，级联蓝，级联黄色；CyTM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)，青色GFP、环状AMP氟传感器(FiCRhR)，荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如GFP.EGFP)、蓝色萤光蛋白(例如，BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色萤光蛋白(例如，ECFP、蔚蓝、CyPet)、黄色萤光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如，荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/二甲氨基偶氮苯甲酰、荧光素/荧光素、 FL、荧光素/QSY7和QSY9)、和LysoSensorTM(例如，蓝DND-22、蓝-白DPX、黄HCK-123、绿DND-26、红DND-99、LysoSensorTM蓝DND-167、LysoSensorTM绿DND-189、LysoSensorTM绿DND-153、LysoSensorTM黄/蓝DND-160、LysoSensorTM黄蓝10,000MW聚葡萄糖)、俄勒冈绿(例如，488、488-X、500、514)；若丹明(例如，110、123、B、B 200、BB、BG、B额外、5-羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺、丽丝胺若丹明B、Phallicidine、鬼笔环肽、红、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-若丹明)、5-ROX(羧基-X-若丹明)、磺酰罗丹明B can C、磺酰罗丹明G Extra、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、VIC和在(例如)美国专利申请公布第2009/0197254(以全文引用的方式并入本文中)号中描述其它标记))。如本领域的普通技术人员将已知，还可以使用其它可检测标记(参见，例如美国专利申请公布第2009/0197254号(以全文引用的方式并入本文中))。可以使用这些系统和可检测标记以及许多其它系统和可检测标记中的任一个来检测扩增的目标核酸。
一些可检测标记可以基于序列(在本文中也称作“基因座特异性可检测标记”)，例如5'-核酸酶探针。此类探针可包含一种或多种可检测标记。各种可检测标记在本领域中是已知的，举例来说(本文中所描述的探针(还参见美国专利第5,538,848号(以全文引用的方式并入本文中))各种茎环分子信标(参见，例如美国专利第6,103,476和5,925,517号和Tyagi和Kramer，《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》14：303-308(1996))、无茎或线性信标(参见，例如PCT公布第WO 99/21881号；美国专利第6,485,901号)、PNA分子信标(参见，例如美国专利第6,355,421和6,593,091号)、线性PNA信标(参见，例如Kubista等人，国际光学工程学会(SPIE)4264:53-58(2001))、无FRET探针(参见，例如美国专利第6,150,097号)、探针(美国专利第6,548,250号)、茎环和双螺旋ScorpionsTM探针(Solinas等人，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》29：E96(2001)和美国专利第6,589,743号)、凸出环探测器(美国专利第6,590,091号)、伪节点探针(美国专利第6,589,250号)、环式(cyclicons)(美国专利第6,383,752号)、MGB EclipseTM探针(Epoch生物科学)、发夹探针(美国专利第6,596,490号)、肽核酸(PNA)发光探针(Svanvik等人《分析生物化学(Anal Biochem.)》281：26-35(2001))、自组装纳米颗粒、举例来说在以下各者中描述的二茂铁改性的探针：美国专利第6,485,901号；Mhlanga等人，《方法(Methods)》25：463-471(2001)；Whitcombe等人，《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》17：804-807(1999)；Isacsson等人，《分子细胞探针(Molecular Cell Probes.)》14：321-328(2000)；Svanvik等人，《分析生物化学(Anal Biochem.)》281：26-35(2000)；Wolffs等人，《生物技术(Biotechniques)》766：769-771(2001)；Tsourkas等人，《核酸研究(Nucleic AcidsResearch.)》30：4208-4215(2002)；Riccelli等人，《核酸研究(Nucleic AcidsResearch.)》30：4088-4093(2002)；Zhang等人，《生物化学与生物物理学报(ActaBiochimica et Biophysica Sinica)》(上海)34：329-332(2002)；Maxwell等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》124：9606-9612(2002)；Broude等人，《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》20：249-56(2002)；Huang等人，《化学研究·毒理(Chem Res.Toxicol.)》15：118-126(2002)；以及Yu等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》14：11155-11161(2001)；(www.qiagen.com),(French等人《分子细胞探针(Mol.Cell.Probes)》15：363-374(2001))，置换探针(Li等人《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》30：e5(2002))、杂交探针(Cardullo等人《美国国家科学院院刊(Natl.Acad.Sci.USA)》85：8790-8794(1988))，MGB警报(www.nanogen.com)，Q-PNA(Fiandaca等人《基因组研究(Genome Res.)》11：609-611(2001))、(www.Promga.com)，LUXTM引物(Nazarenko等人《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》30：e37(2002))，DzyNA引物(Todd等人《临床化学(Clin.Chem.)》46：625-630(2000))。可检测标记也可包含淬灭可检测标记荧光的无可检测猝灭剂部分，其包括(举例来说)黑洞猝灭剂(Biosearch)、Iowa猝灭剂(IDT)、QSY猝灭剂(分子探针)和4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酰基磺酸盐/羧酸盐和二甲氨基偶氮苯甲酰磺酸盐/羧酸盐猝灭剂(Epoch)。可检测标记还可以包含两个探针，其中举例来说荧光团在一个探针上，而淬灭剂在另一个探针上，其中两个探针在目标上杂交在一起淬灭信号，或其中在目标上杂交经由改变荧光改变了信号特征。示例性系统还可包括PRET、水杨酸盐/DTPA配体系统(参见，例如Oser等人《应用化学英语版(Angew.Chem.Int.Engl.)》29(10)：1167(1990))置换杂交、同源探针和/或在欧洲专利第EP 070685号和/或美国专利第6,238,927号中描述的分析。可检测标记还可以包含用SO3替代羧酸酯基团的荧光素的磺酸酯衍生物，亚磷酰胺形式的荧光素、亚磷酰胺形式的Cy5(可购自Amersham的实例)。以上引用的所有参考文献都在此以其全文引用的方式并入本文中。
其它实施例提供了在热循环过程期间通过将具有式I的新颖化合物包括在其中抑制聚合酶失活的方法。还提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一种具有式I的新颖化合物并且在使得稳定所述酶的聚合酶活性使上述混合形成混合物以的方法。聚合酶可以本领域技术人员可获得的任何聚合酶，包括但不限于本文中所描述的那些聚合酶。在某些实施例中，聚合酶是热稳定的。
本文中所述的新颖化合物和方法可以用于检测和/或定量测试样本的各种目标核酸。目标核酸是设计分析系统来鉴别它或检测它存在(或不存在)于测试样本中和/或对它进行定量的任何核酸。此类核酸可以包括(举例来说)传染剂(例如，病毒、细菌、寄生虫等)、疾病过程(例如癌症、糖尿病等)或用于测量免疫反应的那些核酸。示例示性“测试样本”包括不同类型的样本，例如生物样本。示例性生物样本包括(举例来说)体液(例如，血、唾液、脊髓液)、组织样本、食物(例如，肉)或饮料(例如，牛奶)产品等。经表达核酸可以包括(举例来说)其表达(或缺乏其表达)与如传染病(例如，细菌、病毒、真菌、原虫感染)或癌症的医学病况相关的基因。本文中所述的方法还可以用于检测药物、食物或饮料产品中的污染物(例如，细菌、病毒、真菌和/或原虫)。本文中所述的方法还可以用于在存在野生型等位基因的情况下检测稀有等位基因(例如，在存在106-109个野生型等位基因情况下的一个突变体等位基因)。所述方法可用于(举例来说)检测微小残留病(例如，在缓解期间的稀有残余癌细胞，尤其是在p53基因中或先前在肿瘤内鉴别到的其它肿瘤抑制因子基因的突变)，和/或测量突变负荷(例如，存在于正常组织(例如血液或尿液)中的特异性体细胞突变的频率)。
还提供了用于执行本文中所述的方法的试剂盒。如本文中所用，术语“试剂盒”是指一组封装的相关组分，通常是一种或多种化合物或组合物。所述试剂盒可包含一对用于聚合和/或扩增样本的至少一种目标核酸的寡核苷酸、一种或多种新颖化合物(例如，和/或常规清洁剂，或包含上述中任一项的混合物)、生物催化剂(例如，DNA聚合酶)和/或对应的标记有可检测标记的一种或多种探针。所述试剂盒还可包括含有用于对照反应中的预定义目标核酸的样本。所述试剂盒还可以任选地包括储备溶液、缓冲液、酶、可检测标记或检测所需试剂、可以用于完成扩增反应的管子、膜等。在一些实施例中，包括多个引物组。在一个实施例中，试剂盒可包括以下各者中的一种或多种：举例来说，缓冲液(例如，三羟甲基氨基甲烷)、一种或多种盐(例如，KCl)、甘油、dNTP(dA、dT、dG、dC、dU)、重组BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如,ROX被动参考染料)、一种或多种清洁剂(例如，Dt4)、一种或多种热启动PCR机构、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明胶(例如，鱼或牛来源)。本领域的技术人员应理解，还涵盖具体系统和试剂盒的其它实施例。
本公开另外涉及(具有式1的)新颖化合物BrijL-23-脯胺酸：
还提供了包含聚合酶(如热稳定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸的组合物。在一些实施例中，提供了包含此化合物的储存缓冲液。举例来说，用于酶(如热稳定聚合酶或逆转录酶)的储存缓冲液可包含此化合物。在一些实施例中，还提供了包含储存或反应组合物的试剂盒，所述组合物包含聚合酶(如热稳定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸。在一些实施例中，用于提高聚合酶(如热稳定聚合酶)的效率的方法，所述方法包含以下步骤：将目标核酸与至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP和BrijL-23-脯胺酸混合；并且扩增所述目标核酸。在一些实施例中，所述提高的核酸合成效率与当聚合酶在存在NP-40和/或20的情况下替代所述化合物时的核酸合成效率相同或大于该情况下的核酸合成效率。在某些实施例中，所述化合物的有效浓度小于常规清洁剂(例如，NP-40或20)所需要有效浓度的至少约一倍至约十倍。在一些实施例中，如使用标准稳定性测试协定(例如，如在以下实例2中)测量，BrijL-23-脯胺酸在缓冲液(例如，5X缓冲液)中稳定至少约一个月至约三年。还提供了通过以下方式检测样本中目标核酸的方法：形成反应混合物(例如，包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP、BrijL-23-脯胺酸和可检测标记)、扩增目标核酸和检测由可检测标记产生的信号，所述可检测标记指示在样本中所述目标核酸的存在和/或量。还提供了在热循环过程中通过在热循环过程期间使所述聚合酶与BrijL-23-脯胺酸接触抑制聚合酶的失活的方法。在一些实施例中，聚合酶失活的抑制与当聚合酶在存在NP-40和/或20的情况下替代BrijL-23-脯胺酸时的聚合酶失活的抑制相同或大于该情况下的聚合酶失活抑制。在一些实施例中，通过在一定条件下将具有聚合酶活性的酶与BrijL-23-脯胺酸合并以形成混合物以使得稳定所述酶(例如，热稳定聚合酶)的所述聚合酶活性，而提供稳定聚合酶活性的方法。在某些实施例中，提供了包含稳定酶(如热稳定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸的组合物。在一些实施例中，提供了包含稳定酶(如热稳定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸的储存缓冲液。在一些实施例中，聚合酶活性的稳定性程度与当聚合酶在存在NP-40和/或20情况下替代BrijL-23-脯胺酸时聚合酶活性的稳定性相同或大于该情况下的聚合酶活性的稳定性。还提供了包含至少一种聚合酶(例如，热稳定聚合酶)、dNTP和BrijL-23-脯胺酸的核酸扩增反应混合物。还提供了通过以下方式聚合目标核酸的方法：将目标核酸与反应混合物中的至少一种聚合酶(例如，热稳定聚合酶)和BrijL-23-脯胺酸合并；并且聚合目标核酸。在一些实施例中，还可以通过以下方式提供用于扩增目标核酸的方法：将目标核酸与作为反应混合物(例如，另外包含dNTP和/或其它试剂)一部分的至少一种聚合酶和BrijL-23-脯胺酸合并；并且聚合目标核酸。在某些实施例中，可以检测目标核酸的聚合或扩增(例如，使用可以是(举例来说)引物或探针一部分的可检测标记)。还可以定量所述目标核酸的此类聚合和/或扩增。可以用作如本文所描述的示例性热稳定聚合酶包括(但不限于)T7DNA聚合酶、真核线粒体DNA聚合酶γ、原核DNA聚合酶I、原核DNA聚合酶II、原核DNA聚合酶III、原核DNA聚合酶IV、原核DNA聚合酶V、真核聚合酶α、真核聚合酶β、真核聚合酶γ、真核聚合酶δ、真核聚合酶ε、真核聚合酶η、真核聚合酶ζ、真核聚合酶ι、真核聚合酶κ、大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶IIIα亚基、大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基、大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、水生栖热菌DNA聚合酶I、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶I、广古菌聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、酿酒酵母聚合酶4、贯穿损害合成聚合酶、逆转录酶、热稳定聚合酶、端粒酶、Taq DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶和VentTMDNA聚合酶、具有降低的3'到5'核酸外切酶活性的聚合酶、SuperScriptTM DNA聚合酶、经基因工程化的DNA聚合酶、具有活性位点突变F667Y的聚合酶、具有活性位点F667Y等效物的聚合酶、Tth聚合酶、FS、ThermoSequenaseTM、Therminator I、Therminator II、Therminator III和/或Therminatorγ和/或其衍生物和/或其片段或其衍生物本文中提供的其它方法包括(举例来说)用于通过用于以下来检测样本中目标核酸的方法：形成包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP、BrijL-23-脯胺酸和可检测标记的反应混合物；扩增所述目标核酸；以及检测由所述可检测标记产生的信号，所述可检测标记指示所述样本中所述目标核酸的存在。某些方法可利用一种或多种热启动技术，如(举例来说)基于寡核苷酸的系统、基于抗体的系统、基于化学的系统和/或这些热启动机构中任何两种或更多种的组合(例如，基于抗体和基于寡核苷酸的热启动一起)。还提供用于了制备BrijL-23-脯胺酸的方法，如通过活化BrijL-23以产生BrijL-23-甲磺酸酯；由BrijL-23-甲磺酸酯制备BrijL-23-碘化物；由BrijL-23-碘化物制备BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯；水解BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯以产生BrijL-23-脯胺酸；以及任选地中和BrijL-23-脯胺酸(使用例如)。如本领域普通技术人员将清楚的，本文中所描述的其它实施例也涵盖在本文中。
在一些实施例中，提供了包含BrijL-23-脯胺酸的组合物。在某些实施例中，此类组合物包含以0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、15％、20％或30％的浓度的BrijL-23-脯胺酸。在一些优选实施例中，BrijL-23-脯胺酸以0.001％至10％的浓度存在于此类组合物中。在一些更优选的实施例中，BrijL-23-脯胺酸以.01％至1％的浓度存在于此类组合物中。
为了更清楚并简明地描述和指出本公开的主题，提供以下说明书和所附权利要求书中所用的特定术语的以下定义。在整个本说明书中，特定术语的举例说明应该被视为非限制性实例。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“一个”以及“所述”包括多个指示物。如本文在整个说明书以及权利要求书中所使用的近似类语言可以应用于修饰可以许可的方式变化而不会导致其相关的基本功能改变的任何定量表示。因此，由术语如“约”修饰的值不限于指定的精确值。必要时，提供了范围并且那些范围包括在其之间的所有子范围。
在本公开中，除非另外特别陈述，或除非如本领域技术人员按照本发明了解，单数为唯一功能性实施例，否则使用单数可包括复数。因此，举例来说，“一”可意指超过一个，且“一个实施例”可意指该描述适用于多个实施例。短语“和/或”表示表明以组合和单独、可替代的方式涵盖特定组合的简写方式。
应了解，在本发明教导中论述的温度、浓度、时间等之前存在暗示的“约”，使得微小并且非实质的偏差在本文中本发明教导的范围内。另外，“包含(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”以及“包括(include/includes/including)”的使用并不旨在成为限制性的。应理解，以上一般描述和详细描述两者仅是例示性和解释性的并且并不限制本发明。
除非在上述说明书中特别指出，否则在上述说明书中叙述“包含”各种组分的实施例还涵盖如上述“由所述组分组成”或“主要由所述组分组成”；在说明书中叙述“由各种组分组成”的实施例还涵盖如“包含所述组分”或“主要由所述组分组成”；并且在说明书中叙述“主要由各种组分组成”的实施例还涵盖如“由所述组分组成”或“包含所述组分”(该互换性不适用于在权利要求中这些术语的使用)。
如本文所使用，术语“核苷酸”或“核苷酸碱基”指的是核苷磷酸。其包括(但不限于)天然核苷酸、合成核苷酸、改性的核苷酸或替代物置换部分或通用类核苷酸(例如，肌核苷)。核苷磷酸可以是核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。在核苷磷酸中的糖部分中可以是戊糖(如核糖)，并且磷酸酯酯化位点可对应于附接至核苷戊糖的C-5位置的羟基。核苷酸可以是(但不限于)脱氧核苷三磷酸(dNTP)或核苷三磷酸(NTP)。核苷酸可以使用字母(字母标识)表示。举例来说，A指示腺苷(即，含有核碱基、腺嘌呤的核苷酸)、C指示胞嘧啶、G指示鸟苷、T指示胸苷、U指示尿嘧啶并且I指示肌苷。N表示任何核苷酸(例如，N可以是A、C、G、T/U或I中的任一项)。还可以是使用天然产生和合成的类似物，尤其包括(举例来说)次黄嘌呤、2-胺基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5,N4-乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑[3,4-d]嘧啶和6-氨基-4-羟基[3,4-d]嘧啶。寡核苷酸的核苷酸单元也可具有交联的功能(例如，烷基化剂)。
如本文所使用，术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指核苷的酸寡聚物或其衍生物。寡聚物可以是DNA、RNA或其类似物(例如，硫代磷酸类似物)。寡聚物还可包括改性的碱基和/或主链(例如，改性的磷酸键或改性的糖部分)。将稳定性和/或其它优点赋予寡聚物的合成的主链的非限制性实例可包括硫代磷酸键、肽核酸、锁核酸(Singh等人《化学通讯(Chem.Commun.)》4：455-456(1998))、木糖核酸和/或其类似物。寡核苷酸可以是任何长度“n”。举例来说,n可以是1、2、4、6、8、12、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40等数目的核苷酸中的任一种。多核苷酸结构(N)n表示由n个数的核苷酸N组成的寡核苷酸(例如，(I)8表示具有序列IIIIIIII的寡核苷酸；或者(A)12表示具有序列AAAAAAAAAAAA的寡核苷酸)。其它类型的寡核苷酸或多核苷酸还可以是适于如本领域的技术人员由本公开将理解的用途。
如本文所使用，术语“核酸”是指核苷酸或其衍生物的聚合物。如本文所使用，术语“目标核酸”是指核酸扩增反应在中期望被扩增的核酸。举例来说，所述目标核酸包含核酸模板。
如本文所使用，术语“序列”是指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。在整个说明书中，不论何时寡核苷酸/核酸由一连串字母表示，核苷酸都在从左到右的5'至3'次序中。举例来说，由序列(I)n(A)n表示，其中n＝1、2、3、4等的寡核苷酸表示其中(一个或多个)5'末端核苷酸为肌苷并且(一个或多个)3'末端核苷酸为腺核苷的寡核苷酸。
如本文所使用，术语“反应混合物”是指用于进行化学分析或生物分析的试剂或试剂溶液的组合。在一些实施例中，反应混合物包含进行核酸(DNA)合成/扩增反应的所有必需组分。如上所述，此类反应混合物可包括至少一种适合于聚合和/或扩增所关注的核酸序列的扩增引物对和至少一种清洁剂。如上所述，合适的反应混合物还可包括含有执行扩增反应所需要的组分(例如，通常不包括所述引物对)的“主混合物”。主混合物可以与一种或多种清洁剂合并以形成反应混合物。如将由本领域技术人员所理解，本文中还涵盖了反应混合物的其它实施例。
如本文所使用，术语“试剂溶液”或“适于执行DNA合成反应的溶液”是指通常用于执行扩增反应或DNA合成的任何或所有溶液。它们包括(但不限于)用于DNA扩增方法的溶液、用于PCR扩增反应的溶液等。适于DNA合成反应的溶液可包含缓冲液、盐和/或核苷酸。其可另外包含引物和/或以待扩增的DNA模板。一种或多种试剂溶液通常包括在反应混合物或本文所描述的主混合物中。
如本文所使用，术语“引物”或“引物序列”是指与目标核酸序列(例如，以待扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的短的线性寡核苷酸。所述引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列(例如，包含RNA和DNA)。引物可含有天然、合成或改性的核苷酸。引物长度的上限和下限凭经验确定。引物长度的下限是在杂交时与目标核酸在核酸扩增反应条件下形成稳定双螺旋所需的最低长度。极短引物(通常是小于3个核苷酸长)并不与目标核酸在此类杂交条件下形成热力学上稳定的双螺旋。上限通常是由在目标核酸中除预定核酸序列以外的区域中形成双螺旋的可能性来确定的。一般，合适的引物长度处于约以下各者任一项的范围内，举例来说3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个(等)核苷酸长。
如本文所使用，“烷基”是指任选地为直链或支链的烃，并且可以是完全饱和、单或多不饱和。此外，如本文所使用的术语“烷基”另外包括在烃链片段的一个或多个碳原子处的一种或多种取代物。
如本文所使用，“芳基”是指具有单环或多个稠合环的芳族部分，其中每个均任选地且独立被H、卤素、氰基、叠氮基、磺酸、碱或磺酸的铵盐、羧酸、羧酸的生物相容性盐、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰胺基取代。
如本文所使用，“取代的”是指其中一个或多个氢原子被一个或多个非氢原子、官能团或部分替换的分子。举例来说，未被取代的氮为-NH2，而被取代的氮-NHCH3。示例性取代基包括(但不限于)卤基(例如，氟和氯)、烷基、烯烃、炔、硫酸酯、砜、磺酸酯、氨基、铵、酰胺基、腈、烷氧基、苯氧基、芳族、苯基、多环芳族和杂环。
以下实例进一步描述某些具体实施例。这些实施例仅提供作为例子并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。
实例
实例1
新颖化合物的研发
新颖化合物Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、D10、Dt11和Dt12使用以下所述过程1研发：
其中R1、R2、R3、R4、R5和n为如上文所描述，并且X选自由以下各者组成的群组：H、CH3、CH2CH3、CH2(C6H5)和C(CH3)3。具有式I的新颖化合物可以是(举例来说)离子型(例如，阳离子型、阴离子型、两性离子型)。
如在过程1中示出，依次将化合物A(1eq.)、甲基三苯氧基磷碘化物(4eq.)和N,N-二甲基甲酰胺(6mL)添加至50mL铝箔覆盖的圆底烧瓶中。然后使所述反应在室温下在氩气氛围下搅拌3天。在3天之后，使用分析LC-MS监测反应的进程。中间产物图案的出现将确认其形成。不分离该预期的中间产物(中间体B)。将氨基酸酯盐酸盐(2eq.)和Et3N(2eq.)添加至从前述步骤中获得的该中间产物中。将反应混合物在65℃下加热3至4天。使用分析LC-MS监测反应的进程。将所述反应混合物冷却到室温并且然后在旋转蒸发仪上浓缩至约2mL。所述浓缩的粗混合物通过制备型HPLC纯化。将所有所期望的馏分合并并且在旋转蒸发仪上浓缩以获得所期望的产物(离子型化合物Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11、Dt12)。然后，使用2NNaOH将该产物进行水解反应。使反应混合物在室温下搅拌直至如在分析LC-MS上观察到的所有的起始物质被耗尽，接着用中和以获得如下文所示的最终阳离子化合物(例如，Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)、两性离子化合物(例如，Dt2、Dt4、Dt6、Dt10)或阴离子化合物(Dt8)：
以及
其中n为如上文所描述的。在某些实施例中，每个n独立为5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。
通过聚合酶测试Dt1和Dt2支持核酸扩增的能力。在0.1％NP-40和0.1％20(对照反应)、Dt1或Dt2存在下通过使用Taq聚合酶的PCR，扩增1kb和3kb(分别为Rhod-1043和Rhod-3637)的两个不同核酸目标。如图1所示，Dt1和Dt2两者以类似于20的方式支持所述扩增反应。当Dt1以0.008％和0.0006％之间的浓度包括于50μl反应中时，其支持1kb扩增子(Rhod-1043)和3Kb扩增子(Rhod-3637)的扩增。当Dt2以0.04％和0.0001％(在0.0008％下观察到一些扩增)之间的浓度包括于50μl反应中时，其支持1kb扩增子(Rhod-1043)和3kb扩增子(Rhod-3637)的扩增。
还使用视紫质基因引物测试Dt1以扩增约4Kb扩增子(Rhod-3920、Rhod-4181和Rhod-4089)(图2；“储存B”：20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、50％甘油、1mM DTT、蒸馏水)。PCR条件是94℃下两分钟；94℃下15秒、60℃下30秒、72℃下4分钟30秒进行35次循环；并且在72℃下延长十分钟。当Dt1以0.008％和0.001％之间的浓度包括于50μl反应中时，其支持Rhod-3920和Rhod-4181的扩增。当Dt1以0.008％和0.001％之间的浓度包括于50μl反应中时，其支持Rhod-4089的扩增。
图3示出，在扩增0.1Kb至1Kb扩增子中0.004％Dt1和0.002％Dt1与0.004％20相当。图4示出，在扩增1-2kb扩增子中0.004％Dt1和0.002％Dt1与0.004％20相当。
图5提供在Brij-58和Dt1之间的比较。如其中所示，Dt1(0.04％至0.006％)以类似于Brij-58(0.04％至0.0004％)或20(0.002％)的方式支持扩增。数据表明，这不是由于用于改性的Brij-58起始物质的污染。
图6比较Dt1和Dt2的活性。如其中所示，两个改性的化合物支持扩增。当Dt1以在0.04％至0.001％之间的浓度包括于反应混合物中时，其被示出支持扩增。当Dt2以0.04％至0.006％之间的浓度包括于反应混合物中时，其被示出支持扩增。
图7和图8提供在扩增四个不同目标(B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB)中在Dt4和20之间的比较。如其中所示，在0.01％Dt4或0.01％20存在下的扩增提供类似的结果。
图9提供在扩增各种不同的目标中在Dt4和20之间的比较。如其中所示，在Dt4或20存在下的扩增提供类似的结果，
图10示出在Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7存在下扩增的结果。如其中所示，尽管在这些实验的反应条件下，由以最高含量的每种清洁剂，由Dt4接着由Dt1支持扩增。Dt5和Dt7展现出类似的活性，接着是Dt6。
图11至图15示出在扩增HPRT1或PPIA中比较Dt4与Brij-58和20在各种浓度下的活性的扩增曲线图。如其中所示，在所有浓度测试(0.001％至0.0001％)中Dt4以类似于Brij-58和20两者的方式支持所述扩增反应。
图16至图18示出，在各种反应中Dt4可以在比20更低的浓度下使用(例如，相比于0.01％20的0.002％Dt4)。
图19和图20展现，Dt4在“5X”缓冲液(三羟甲基氨基甲烷(pH 8.0)、KCl和BSA)中稳定(例如，Dt4保持其支持扩增的能力)至少两个月。
图21和图22提供相比于20，两个Dt4不同批次支持各种目标扩增的能力的比较
图23示出，Dt4在各种分析中支持扩增。
实例2
BrijL-23-脯胺酸的研发和使用
以下示出另一种具有式I化合物：
可以使用如下文所示的制备BrijL-23-脯胺酸过程2：
简言之，过程2的步骤一包括活化BrijL-23，对所述BrijL-23-甲磺酸酯进行后处理并且使其干燥过夜。在步骤2中，形成BrijL-23-碘化物，对其后处理并干燥过夜。步骤3在过夜反应中形成胺，接着纯化所述产物、汇集含有所述产物的馏分、使用旋转式蒸发仪蒸发并且干燥过夜。然后，用HCl对BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯进行水解约八小时。使用旋转式蒸发仪蒸发并且干燥过夜，得到最终新颖化合物BrijL-23-脯胺酸。
对BrijL-23-脯胺酸执行加速的和实时稳定性测试。BrijL-23-脯胺酸储存在-20℃下。在42℃和24℃(环境温度)下进行加速老化稳定性研究。使用修正的阿伦尼斯(Arrhenius)方程获得的加速老化时间转化率结果示出在表2：
表2
温度 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
-20℃ 3个月 6个月 9个月 12个月 15个月 18个月 21个月 24个月
-24℃ 4.3天 8.5天 12.8天 17.7天 21.3天 25.6天 29.8天 34.1天
-42℃ 1天 2天 3天 4天 5天 6天 7天 8天
*T0＝在-20℃下第0天的样本
不同批次的BrijL-23-脯胺酸(2次试验)产物用于加速老化稳定性测试。在避光的玻璃瓶中在指定温度(24℃和42℃)下培育材料。对于24℃的取样点，将每个中试批次的一个试剂瓶从培育箱中取出并且将试管立即储存于-20℃冰箱中。在收集所有24℃的抽样时间点(T1-T8)之后，通过LCMS QC方法检查在样本转化成液体溶液之后的所有加速老化样本(24℃和42℃)。所述24℃研究进行七周。结果呈现在表3中。实时稳定性测试的结果呈现在表4中。
表3
加速稳定性测试*＊
批次 量 方法 在溶液中的百分比 溶液的透明度
1 10mg LCMS，Lyoph 5％ 透明
2 227mg LCMS，Lyoph 20％ 透明
3 146mg LCMS，Lyoph 20％ 透明
4 1g LCMS，Lyoph 20％ 透明
5 629mg Biotage，Lyoph 10％ 透明
6 1g Biotage，pump-contact 10％ 透明
表4
实时PCR稳定性测试*＊＊
***rTaq或Platinum Taq在新颖清洁剂BrijL-23-脯胺酸中配制，在-20℃下储存四个月并且测试储存缓冲液的功能和透明度。
根据加速和实时稳定性测试两者，BrijL-23-脯胺酸被发现不沉淀并且维持其化学特性。
通过聚合酶测试BrijL-23-脯胺酸支持核酸扩增的能力。在0.1％NP-40和0.1％20(对照反应)或BrijL-23-脯胺酸(2μl清洁剂/50μl反应，35个循环)存在下，通过使用Taq聚合酶的PCR扩增四十四个核酸目标。如图24所示，BrijL-23-脯胺酸以类似于在20中配制的市售Platinum Taq和Platinum Taq的方式支持44个不同的扩增反应。
还测试了Platinum Taq和在BrijL-23-脯胺酸或20中配制的rTaq的灵敏度(50ng、5ng、500pg的1.2kb扩增子；使用1μl聚合酶的50μl反应)。如图25所示，配制物的灵敏度等效于1.2kb扩增子。
还比较了750bp PCR产物的TOPO-TA克隆，所述PCR产物使用市售的Platinum Taq(1)、市售rTaq(A)、在新颖清洁剂BrijL-23-脯胺酸中配制的Platinum Taq(2)、在新颖清洁剂BrijL-23-脯胺酸中配制的rTaq(B)、在20中配制的Platinum Taq(3)或在20中配制的Taq(C)扩增。如图26所示，在不同组合物中观察到等效的克隆性能。
在公开内列举的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文中。虽然已经就优选实施例描述于了某些实施例，但应理解的是对于本领域的技术人员将对其进行变化及修改。因此，希望所附权利要求书覆盖落入以下权利要求书范围内的所有此类等效变化。

Claims (48)

1.一种具有式I的化合物：
其中：
R1为C12烷基。在某些实施例中，R2和R4为H。在某些实施例中，R3与R5一起形成5-元环，并且每个n独立为任何正整数，其包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29以及30。
2.一种化合物，其具有所述以下结构：
3.一种包含聚合酶和根据权利要求2所述的化合物的组合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚合酶是热稳定的。
5.根据权利要求3所述的组合物，其包含以下各者中的一者或多者：
a)至少一种核苷三磷酸
b)DTT
c)KCl
d)MgCl2
e)Kathon
f)EDTA
g)明胶
h)三羟甲基氨基甲烷
i)甘油
j)BSA
6.根据权利要求3所述的组合物，其另外包含聚合酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合酶抑制剂为至少一种寡核苷酸抑制剂。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述聚合酶抑制剂为至少一种抗体抑制剂。
9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚合酶稳定至少约一个月至约三年。
10.一种包含储存或反应组合物的试剂盒，所述组合物包含聚合酶和根据权利要求2所述的化合物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述聚合酶是热稳定的。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述聚合酶为从水生栖热菌(Taq)聚合酶中分离的聚合酶。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其另外包含聚合酶抑制剂。
14.一种用于提高所述聚合酶效率的方法，所述方法包含以下步骤：
a)将目标核酸与至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP和根据权利要求2所述的化合物混合；以及，
b)扩增所述目标核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述提高的效率与当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的所述效率相同。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述提高的效率大于当在NP-40和/或 的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的所述效率。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述化合物的所述有效浓度小于常规清洁剂所需要的有效浓度至少一倍至十倍。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述常规清洁剂为NP-40或
19.一种用于检测在样本中目标核酸的方法，所述方法包含以下步骤：
a)形成反应混合物，所述反应混合物包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP、根据权利要求2所述的化合物以及可检测标记；
b)扩增所述目标核酸；以及，
c)检测由所述可检测标记产生的信号，所述可检测标记指示在所述样本中所述目标核酸的存在和/或量。
20.一种用于在热循环过程中抑制聚合酶失活的方法，所述方法包含在所述热循环过程期间将所述聚合酶与根据权利要求2所述的化合物接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中聚合酶失活的所述抑制与当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的聚合酶失活的所述抑制相同。
22.根据权利要求20所述的方法，其中聚合酶失活的所述抑制大于当在NP-40或的所述存在下所述聚合酶替代所述化合物时的聚合酶灭活的所述抑制。
23.一种方法，所述方法包含在使得稳定所述酶的所述聚合酶活性的条件下，将具有聚合酶活性的酶和根据权利要求2所述的化合物混合以形成混合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述稳定性与当在NP-40和/或的存在下所述聚合酶替代所述化合物时的聚合酶活性的所述稳定性相同
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述稳定性更高于如当在NP-40和/或 的存在下所述聚合酶替代所述化合物时聚合酶活性的所述稳定性。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是热稳定的。
27.一种核酸扩增反应混合物，其包含：
a)至少一种聚合酶；
b)dNTP；以及，
c)根据权利要求2所述的化合物。
28.根据权利要求27所述的核酸扩增反应混合物，其另外包含至少一种引物。
29.根据权利要求27或28所述的核酸扩增反应混合物，其中所述聚合酶是热稳定的。
30.根据权利要求27所述的核酸扩增反应混合物，其另外包含至少一种抗体。
31.根据权利要求27所述的核酸扩增反应混合物，其另外包含至少一种寡核苷酸聚合酶抑制剂。
32.一种用于聚合目标核酸的方法，其包含以下步骤：
a)将所述目标核酸与在反应混合物中的至少一种聚合酶和根据权利要求2所述的化合物合并；以及，
b)聚合所述目标核酸。
33.一种用于扩增目标核酸的方法，其包含以下步骤：
a)使所述目标核酸与作为反应混合物的部分的至少一种聚合酶和根据权利要求2所述的化合物合并；以及，
b)聚合所述目标核酸。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述反应混合物另外包含至少一种核酸引物和/或dNTP。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中检测所述目标核酸的聚合或扩增。
36.根据权利要求35中任一项所述的方法，其中使用可检测标记检测所述目标核酸的聚合或扩增。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述可检测标记为引物或探针的一部分。
38.根据权利要求35中任一项所述的方法，其中将所述目标核酸的所述聚合或扩增定量。
39.根据权利要求32至38种任一项所述的方法，其中所述聚合酶选自以下各者组成的群组：T7DNA聚合酶、真核线粒体DNA聚合酶γ、原核DNA聚合酶I、原核DNA聚合酶II、原核DNA聚合酶III、原核DNA聚合酶IV、原核DNA聚合酶V、真核聚合酶α、真核聚合酶β、真核聚合酶γ、真核聚合酶δ、真核聚合酶ε、真核聚合酶η、真核聚合酶ζ、真核聚合酶ι、真核聚合酶κ、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶IIIα亚基、大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基、大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、水生栖热菌(T.aquaticus)DNA聚合酶I、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)DNA聚合酶I、广古菌(Euryarchaeota)聚合酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、酿酒酵母(S.cerevisiae)聚合酶4、跨损伤合成聚合酶、逆转录酶、热稳定聚合酶和端粒酶。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述热稳定聚合酶选自由以下各者组成的群组：Taq DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶和VentTM DNA聚合酶、具有降低的3'到5'核酸外切酶活性的聚合酶、SuperScriptTM DNA聚合酶、经基因工程化的DNA聚合酶、具有活性位点突变F667Y的聚合酶、具有活性位点F667Y等效物的聚合酶、Tth聚合酶、ThermoSequenaseTM、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ、其衍生物及其片段。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述热稳定聚合酶为Taq DNA聚合酶。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述热稳定聚合酶为Tfl DNA聚合酶。
43.一种用于检测在样本中的目标核酸的方法，所述方法包含：
a)形成反应混合物，其包含至少一种聚合酶、至少一种引物、dNTP和根据权利要求2所述的化合物以及可检测标记；
b)扩增所述目标核酸；以及，
c)检测由所述可检测标记产生的信号，所述可检测标记指示所述样本中所述目标核酸的所述存在。
44.根据权利要求14、19、20、23、32、33和43中任一项所述的方法，其中所述方法包含使用热启动技术。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述热启动技术选自由以下各者组成的群组：基于寡核苷酸的系统、基于抗体的系统、基于化学类型的系统以及双重热启动系统。
46.一种产生改性清洁剂的方法，其包含：
a)活化BrijL-23以产生BrijL-23-Mesolate；
b)由BrijL-23-Mesolate制备BrijL-23-碘化物；
c)由BrijL-23-碘化物制备BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯；以及，
d)水解BrijL-23-脯胺酸-叔丁酯以产生BrijL-23-脯胺酸。
47.根据权利要求46所述的方法，其另外包含中和所述产物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中使用中和所述产物。
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